Single Eicel bisulfiet Mutagenese

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-methylering in een enkele oöcyt te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst cumuluscellen en zeep palita te verwijderen van verzamelde oöcyten. De tweede stap is om de oöcyt in een twee-naar-een aros-lyse-oplossing te bedden om de kleine hoeveelheid DNA te beschermen tegen verlies of afbraak.

Vervolgens wordt bi-sulfietmutagenese uitgevoerd, gevolgd door amplificatie via gennest polymerasekettingreactie. De laatste stap is het liëren en klonen van het PCR-product. Klonen worden vervolgens geselecteerd, PCR-geamplificeerd en voor sequencing verzonden.

Uiteindelijk wordt bi-sulfietmutagenese en sequencing gebruikt om DNA-methylering bij cytosinefosfaat guine, of CPG-dinucleotiden van een gebied van belang in een enkele oöcyt te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals bi-sulfietmutagenese van grote aantallen cellen, is dat gegevens kunnen worden verkregen uit een enkele oöcyt zonder pooling van cellen, PCR-bias en chemo-celcontaminatie. Op de dag van oöcytverzameling, bereid de oplossingen op die in het geschreven protocol zijn vermeld. Bij het maken van oplossingen, verminder de kans op DNA-contaminatie door vaak van handschoenen te veranderen en filtertips te gebruiken. Houd ook buizen schuin wanneer ze open zijn en dop alle buizen af wanneer ze niet in gebruik zijn.

Begin met de OSI-verzameling door de gedissekteerde muizen-ovaducten in M-twee-media te plaatsen en de M-poelie te scheuren om het cumuluscelcomplex te extraheren. Scheid vervolgens de cellen van het cumuluscelcomplex met behulp van 0,3 milligram per milliliter hyaluronidase-oplossing in een druppel van 30 microliter M-twee-media. Houd de cellen slechts zo lang in oplossing als het duurt om de cumuluscellen te verwijderen, omdat langdurige blootstelling ze kan beschadigen.

Was de oöcyten in druppels van 30 microliter M-twee-media door de oöcyten van druppel naar druppel over te brengen. Verwijder de cumuluscellen periodiek voor een totaal van drie wasbeurten. Verwijder de Z van LUCITA met behulp van zure tyroloplossing.

Plaats eerst de oöcyten in een druppel van 30 microliter oplossing en breng ze vervolgens over naar een andere druppel van 30 microliter. Omdat elk meegenomen medium de zuurgraad zal verdunnen en de efficiëntie zal verminderen. Houd de cellen slechts zo lang in oplossing als het duurt om de zona te verwijderen, omdat langdurige blootstelling ze kan beschadigen.

Na het verwijderen van de zona, was de cellen opnieuw in een druppel van 30 microliter M-twee-media om agros-inbedding uit te voeren. Plaats eerst de lyse-oplossing op een hitteblok van 70 graden Celsius. Voeg de voorverwarmde lage smeltpunt of LMP Agros toe aan de lyse-oplossing, waardoor een twee-naar-een AGROS naar lyse-oplossing ontstaat. Plaats vervolgens een enkele oöcyt op een schone glazen glijbaan in minimale M-twee-media.

De volgende stap is om de enkele cel in de Agros en lyse-oplossing in te bedden. Dit moet snel gebeuren, omdat de agros bij temperaturen onder 65 graden Celsius hard wordt. Neem 10 microliter van de Agros-lyse-oplossing op in een pipettip onder een microscoop.

Expel voorzichtig ongeveer een microliter of minder van de agros-lyse-oplossing op de glazen glijbaan, waardoor het zich kan mengen met de minimale media. Neem vervolgens de oöcyt voorzichtig op in de pipettip. Plaats vervolgens alle 10 microliter in een einor-buis met 300 microliter minerale olie, zodat de resulterende kraal een sferische vorm aanneemt.

Incubeer de buis gedurende 10 minuten op ijs om lyse uit te voeren. Verwijder de 300 microliter minerale olie en voeg 500 microliter van de SDS-lysebuffer toe. Incubeer het monster een nacht in een waterbad ingesteld op 50 graden Celsius op de tweede dag.

Bereid de bi-sulfietmutagenese-oplossingen vers voor zoals beschreven in het geschreven protocol. Begin met mutagenese door de 500 microliter SDS-lysebuffer volledig te verwijderen. Houd er rekening mee dat eventueel overgebleven lysebuffer de agros zal verdunnen wanneer deze wordt verwarmd en de kraal zal vatbaarder zijn voor oplossing in de volgende stappen.

Na volledige verwijdering van de lysebuffer, voeg 300 microliter minerale olie toe. Incubeer het monster gedurende twee en een half minuten op een hitteblok van 90 graden Celsius. Zorg ervoor dat u de temperatuur niet vermengt of roert, uitbreidt of fluctueert.

Na twee en een half minuten. Incubeer het monster gedurende 10 minuten op ijs. Om denaturatie uit te voeren, verwijder de minerale olie en voeg een milliliter 0,1 molair natriumhydroxide toe aan de buis. Klop en draai de buis vijf tot zes keer om en om.

Incubeer het monster gedurende 15 minuten. In een waterbad ingesteld op 37 graden Celsius, om de drie tot vier minuten omdraaien, de kraal zou moeten drijven in het natriumhydroxide. Merk op dat de kraal niet langer op de bodem van de buis ligt.

Voer de behandeling met bi-sulfiet uit door de buis voorzichtig te draaien na verwijdering van het natriumhydroxide. Voeg 300 microliter minerale olie en 500 microliter BIS-sulfietoplossing toe. Zorg ervoor dat u blootstelling aan licht vermijdt en incubeer de buis drie en een half uur in een waterbad van 50 graden Celsius.

Voer nu desinatie uit. Incubeer het monster eerst gedurende drie minuten op ijs voordat u de minerale olie en BIS-sulfietoplossing verwijdert. Na een zachte draai, voeg een milliliter 0,3 molair natriumhydroxide toe. Klop en draai de buis vijf tot zes keer om en om.

Incubeer het monster gedurende 15 minuten. In een waterbad van 37 graden Celsius, om de drie tot vier minuten omdraaien, opnieuw, de kraal zou moeten drijven in het natriumhydroxide voor het begin van PCR. Was de monsters door eerst voorzichtig te draaien.

Verwijder vervolgens het natrium