Formuleringen voor Vriesdrogen van bacteriën en hun invloed op de overleving van de cel

Het doel van het volgende experiment is om het effect van verschillende soorten lyofilisatieformuleringen op de celoverleving te observeren. Allereerst worden verschillende formuleringen voor het vriesdrogen van celculturen voorbereid. Vervolgens wordt elke formulering gemengd met de celcultuur, daarna gevriesdroogd en later gerehydrateerd, waarna de overlevingspercentages worden gemeten.

De resultaten tonen verschillen in overlevingspercentages die kunnen worden gekoppeld aan de gekarakteriseerde eigenschappen. Deze methode kan u helpen begrijpen welke fysieke en structurele eigenschappen van een formulering van belang zijn voor de overleving van cellen tijdens dehydratatie. Om een startcultuur van Pseudomonas putida voor te bereiden, begint u met het inoculeren van 100 milliliters triptiek-sojabouillon, of TSB, met een kolonie cellen die zijn gekweekt op agar aangevuld met triptiek-sojabouillon of TSB; incubeer de cultuur bij 30 °C, schuddend bij 130 RPM gedurende zeven uur.

Overbreng een aliquot van de cultuur naar vers TSB en laat dit 16 uur groeien. Oogst de cellen door centrifugatie bij 1.500 ×g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was het celpellet door resuspensie in 150 millimolaire natriumchloride.

Pellet de cellen en resuspendeer ze in formulatiemedium. Ter voorbereiding van formulatie-oplossingen voor het vriesdrogen van cellen.

Weeg de respectievelijke matrixcomponenten af en los deze op in water om isotone omstandigheden te verkrijgen. Pas de oplossing aan met het hulpstof, natriumchloride, of andere celcompatibele opgeloste stoffen. Om cellen homogeen te resuspenderen in een oplossing met lage viscositeit, dient men de oplossingen met hoge viscositeit te vortexen.

Voeg een roerkolf toe en schud het mengsel. Verdeel vervolgens de formuleringen over vooraf gewogen vriesdroogbuisjes en weeg de buisjes. Neem 100 µL uit elk monster en maak tienvoudige seriële verdunningen; plateer de gewenste verdunningen en incubeer deze bij kamertemperatuur. Als de buisjes in de vriesdroger worden afgesloten, plaats dan een rubberen stop op elk buisje van de geplateerde cellen.

Tel de cellen in elke formulering. Gebruik de dune-methode om de oppervlaktespanning van de gedroogde bacteriële mengsels te meten. Reinig de platinaring door deze in een kleurloze vlam te plaatsen tot deze roodgloeit.

Spoel en veegHet meetvat af met aceton en een pluisvrij weefsel en gebruik een vlam om de binnenkant uit te branden. Vul het vat met de oplossing en laat het oppervlak tot rust komen voordat er gemeten wordt voor oplossingen die tijd nodig hebben om een evenwicht te bereiken. De hier gebruikte opstelling zal kwalitatieve gegevens leveren voor formuleringen met hoge viscositeiten.

Gebruik een oplossing met een lagere concentratie om de oppervlaktespanning te meten en extrapoleer dat de vriesdroogcondities moeten worden aangepast aan de fysische eigenschappen van de formulering. De belangrijkste parameter is de glasovergangstemperatuur of TG van de formulering, aangeduid als TG prime voor het vriesgeconcentreerde monster, wat aangeeft dat er nog water aanwezig is. Om het vriesgedrag van de formule te bepalen, worden vijf tot 10 milligram van het monster geplaatst in een aluminium pan met deksel voor differentiële scanningcalorimetrie of DSC.

Bereid een lege pan voor als referentie. Stel het DSC-temperatuurscanprogramma zo in dat het de vriesstap in het vriesdroogprogramma nabootst. Dit wordt gedaan omdat de koelkinetiek de TG' van de niet-gedroogde formuleringen kan beïnvloeden voordat de opwarmscan begint.

Verlaag de temperatuur tot ruim onder de verwachte tg. Kies voor de onderzochte formuleringen een passende opwarmingssnelheid. Het geregistreerde warmtestroomsignaal wordt uitgedrukt in watt en wordt beïnvloed door de opwarmingssnelheid.

Een hogere opwarmingssnelheid zal een groter TG Prime-signaal opleveren; stel het temperatuurbereik zo in dat dit zowel de TG prime als het smelten van de formulering omvat. Zodra het vriesgedrag is bepaald, moeten de parameters van het vriesdrogingsproces worden aangepast, zodat de temperatuur van het monster altijd onder de TG van het monster blijft en de kamerdruk een snelle sublimatie van ijs en residuwater in de formulering mogelijk maakt. Om de droge producten na het vriesdrogen te beschermen.

Beheers de atmosfeer van de monsters door de monsters in de vriesdroger af te sluiten voordat het vacuüm aan het einde van de vriesdroogcyclus wordt opgeheven. Als alternatief kunnen de vials worden gevuld met een gewenste atmosfeer. Het is belangrijk om te voorkomen dat de monsters aan de omgevingscondities worden blootgesteld, aangezien elk spoortje vocht of zuurstof in de bewaaratmosfeer de overleving van de cellen zal beïnvloeden.

Weeg ten slotte de vials om de monsters via röntgenanalyse te analyseren. Breng een kleine hoeveelheid van de bacteriële matrix aan op een monsterhouder en plaats de monsterhouder in de röntgenrefractometer. Gebruik de software die compatibel is met de röntgenapparatuur om elke aanwezige kristallijne fase in het monster te analyseren.

Om de bacteriële matrix via elektronenmicroscopie te analyseren, brengt u een kleine hoeveelheid aan op koolstofband die op een SEM-stub is bevestigd. Plaats de SEM-houder in een sputtercoater en coat het monster met goud en palladium of platina om het monster af te beelden. Plaats de SEM-houder in de kamer en selecteer de juiste beeldparameters.

Voor dit instrument gebruiken we bijvoorbeeld een versnellingsspanning van 5 kV, een spotgrootte van drie, een werkafstand van 5 mm en de secundaire elektronendetector. Deze tabel bevat gegevens voor verschillende formuleringen, waaronder thermische gebeurtenissen geregistreerd door DSC tijdens het verwarmen van de bevroren formuleringen, de structuur van de droge monsters en de oppervlaktespanning van de formuleringoplossingen. De TG prime van sucrose is -40 °C en sucroseconcentraties onder 20% w/w kunnen moeilijk te detecteren zijn.

De thermische gebeurtenis bij min 35 graden Celsius is waarschijnlijk gerelateerd aan het begin van de ijsoplossing dat hier wordt getoond. Overlevingsgegevens voor gram-negatieve P putter en gram-positieve, a CHLOROPHYL cus geformuleerd in verschillende saccharide-gebaseerde formuleringen. Merk op dat de trend in hoe goed de formulering de celoverleving ondersteunt vergelijkbaar is voor beide bacteriële soorten.

Deze grafiek illustreert de correlatie tussen de overleving na vriesdrogen en de oppervlaktespanningen van de formuleringen, wat aangeeft dat hogere oppervlaktespanningen leiden tot hogere overlevingspercentages. De hier getoonde SEM-beelden representeren droge formuleringen voor vier verschillende polymeren waarvan de matrices de verschijning hebben van bros papier of onderling verbonden gladde vellen met gegolfde patronen van ingebedde bacteriën voor fi, ccal en sucrose. De vellen zijn ongeveer one micron dik en 10 tot 20 microns breed, waarbij fi ccal een gladder oppervlak heeft en HPMC en HEC veel dunnere vellen vertonen.

En de bacteriën zijn gemakkelijker zichtbaar, mogelijk omdat de polymeer-bacterieratio lager is in deze formuleringen op basis van cellulose. Bovendien werden zoutkristallen waargenomen bij HEC en HPMC, waarbij HPMC een grotere hoeveelheid neerslag op het oppervlak van de polymeerlagen vertoonde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de overleving van cellen afhankelijk is van formuleringseigenschappen met behulp van de hier getoonde technieken.