Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

Het algemene doel van het volgende experiment is om een vooraf geoptimaliseerde Eliza-test voor TNF Alpha-cytokine over te zetten naar het Xap-platform terwijl alternatieve antilichaamparen worden geëvalueerd. Dit wordt bereikt door de opvangantilichaam uit de ELIZA-kit, samen met drie andere kandidaat-opvangantilichamen, te koppelen aan vier verschillende microsphere- of beadsets wanneer deze samen worden gemengd. Deze vier sets maken het mogelijk om alle vier de kandidaten tegelijkertijd te testen met vier afzonderlijke detectie-antilichamen om het beste antilichaamplek te bepalen.

Vervolgens worden twee Xap-tests geconstrueerd met de twee meest optimale antilichaamparen. De prestaties van de tests worden vervolgens vergeleken met die van de oorspronkelijke EISA-test met betrekking tot signaalsterkte, dynamisch bereik en gevoeligheid. De resultaten laten zien dat vergelijkbare antilichamen onder dezelfde omstandigheden heel verschillend kunnen presteren en dat meerdere antilichamen tegelijkertijd kunnen worden gescreend met behulp van de Luminex Xap-test, wat aantoont dat de test een hogere gevoeligheid en een groter dynamisch bereik heeft in vergelijking met EISA.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals EIS A is dat xap-gebaseerde immunoassays de onderzoeker in staat stellen om meerdere doelen te testen, of in dit geval meerdere antilichamen tegelijkertijd te testen. Om het beste antilichaam aan te tonen. De procedure zal worden uitgevoerd door Erica Lopez, een geassocieerd wetenschapper bij Luminex Corporation.

Begin dit protocol met de selectie en voorbereiding van vier opvangantilichamen en vier detectie-antilichamen specifiek voor humaan TNF alpha zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Bereid ook één bevestigingsantilichaam specifiek voor de gastheersoort van de opvangantilichamen. Breng de reagentia in het antilichaamkopplingskit op kamertemperatuur.

Label vier reactiebuisjes met de beadregionummers geselecteerd voor de koppelingsreactie. Breng de inhoud van de vier flesjes mag plex-microsferen over in de vier gelabelde reactiebuisjes. Was elk van de beadsets twee keer in 500 microliter activeringsbuffer en activeer elke beadset met de sulf ONHS- en EDC-oplossingen zoals beschreven in het antilichaamkopplingskit.

Gebruiksaanwijzing na een incubatie van 20 minuten op een rotator, herhaal de vorige wasstap met de nu geactiveerde beads in totaal drie keer met 500 microliter activeringsbuffer. Bereid voor elke wasstap vier aparte 500 microliteroplossingen voor. Elk bevat 7,5 microgram opvangantilichaambereikingsbuffer.

Voeg deze vier opvangantilichaamoblossingen toe aan hun respectievelijke reactiebuisjes. Vortex elk buisje onmiddellijk en incubeer gedurende twee uur op een rotator. Herhaal de wasstap met de nu gekoppelde beads in totaal drie keer met 500 microliter van de wasbuffer die bij het antilichaamkopplingskit is inbegrepen.

Na de laatste wasstap voegt u 500 microliter wasbuffer toe aan elk reactiebuisje om een ​​​​uiteindelijke voorraadconcentratie van 5 miljoen antilichaambereikingsbeads per milliliter te verkrijgen, vortex en soniceer vervolgens de reactiebuisjes om de beads te verspreiden. Tel het aantal beads dat na de koppelingsreactie is teruggewonnen met behulp van een celteller of hemo cytometer. De terugwinning uit de koppelingsreactie is typisch meer dan 90% Bevestig de koppelingsreactie met het succes door testoplossingen van de gekoppelde beadvoorraden voor elke set voor te bereiden met een eindconcentratie van 100 korrels per microliter in assaybuffer, bereid verdunning van de FICO erything gelabelde antisoorten.

IgG-bevestigingsantilichaam op vier microgram per milliliter in assaybuffer verdeel 50 microliter van elke testoplossing in vier putjes van een ronde bodem 96-putjesplaat voor een totaal van 16 putjes. Voeg vervolgens 50 microliter assaybuffer toe aan acht van de putjes om de achtergrond te meten en 50 microliter verdund bevestigingsantilichaam in de acht overgebleven putjes. Meng de reacties voorzichtig door meerdere keren op en neer te pipetteren met een multikanaals pipetter.

Dek de plaat af en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een plate shaker. Plaats de plaat op een magnetische plaatscheider gedurende een tot twee minuten om de beads uit de oplossing te trekken. Vervolgens verwijdert u de vloeistof door de plaat krachtig te kantelen terwijl deze op de scheider over een afvalbak staat.

Was elk putje twee keer door 100 microliter assaybuffer toe te voegen en de SANE van de plaat te verwijderen op een vergelijkbare manier. Gebruik de magnetische plaatscheider om de beads te resuspenderen in 100 microliter assaybuffer door vijf keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een multikanaals pipetter. Analyseer op Luminex XAP-instrument zoals het Magix-instrument.

De intensiteit van het fluorescente signaal van deze reactie is direct evenredig met de hoeveelheid eiwit op het oppervlak van de beads, waardoor een snelle beoordeling van de relatieve hoeveelheid eiwit die aan de beads is gekoppeld, mogelijk is. Om het meest effectieve antilichaamplek in de xap-test te bepalen, bereidt u een initiële mengsel van alle vier de beadsets voor door 10 microliter van elk toe te voegen aan 0,96 milliliter assaybuffer. Bereid de detectie-antilichaamoblossingen voor door elk antilichaam te verdunnen tot één microgram per milliliter in assaybuffer.

Ook een assaybuffer. Bereid de r- en d-systemen TNF alpha-eiwitstandaard voor op 2000 picogram per milliliter en verdun de Streptavidin R FICO eryn tot acht microgram per milliliter. Voeg 50 microliter van het antilichaambereikingsbeadmengsel toe aan elk van de 16 putjes van een CoStar ronde bodem 96-putjesplaat voor de screeningtest.

Voeg vervolgens 50 microliter assaybuffer toe aan acht van de 16 putjes om de achtergrond te meten. Pipetteer vervolgens 50 microliter van de TNF alpha-standaard in de andere acht putjes om de respons te meten. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht terwijl geschud op een assayplate shaker.

Voeg vervolgens 50 microliter van elk van de vier detectie-antilichamen toe aan vier putjes, waarvan er twee achtergrondputjes