Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

Dit is een Max MIDI-magneet. Er staat: voorzichtig, extreem sterke magnetische velden. Hallo, ik ben Melanie Matthew van het lab van Mike Collins aan de University of California Irvine, Department of Physiology and Biophysics.

Vandaag laten we u zien hoe u een negatieve selectie voorbereiding van CD4-positieve T-cellen uitvoert met behulp van de kits van Milton Biotechnology. Hier hebben we de minimax en de minimax-magneten; de minimax wordt gebruikt voor grotere scheidingen. U kunt tot 10⁹ cellen door een kolom leiden die in de minimax past, terwijl de minimax wordt gebruikt voor veel kleinere celvolumes.

Afhankelijk van het feit of u een positieve of een negatieve scheiding uitvoert, labelt u uw cellen met het passende antilichaam. Deze zijn voorzien van een magnetische kraal die aan de magneet zal hechten. In het geval van een negatieve selectie zullen de cellen waarin u geïnteresseerd bent door de kolom lopen, waarna u het elueerbaar product kunt opvangen, dat uw cellen van interesse bevat.

Ik moet vermelden dat de technieken die ik u vanavond laat zien niet steriel zijn. Als u deze cellen dus voor celkweek wilt gebruiken, dient u alles in de weefselkweekkap uit te voeren met steriele instrumenten. Hoewel ik u een preparatie voor CD4-positieve T-cellen laat zien, zijn veel van deze technieken toepasbaar bij de zuivering van andere celtypen met behulp van de Miltenyi Biotechnology-kits.

Ik heb nu de lymfeklieren uit de muis verwijderd; ik laat u zien hoe u dit in detail doet in editie zeven van JoVE: lymfeklieren prepareren voor twee-foton-imaging. Nu ga ik de lymfeklieren fijnmalen tot een enkelcel-suspensie in een cellzeef van 70 micron. Ik ga de lymfeklieren nu fijnmalen tot een enkelcel-suspensie met de achterkant van een spuit van 6 ml.

De lymfeklieren bevinden zich in RPMI in een filter, en het is belangrijk om een correcte enkelcel-suspensie te maken. De reden waarom we dit in een filter doen, is om er zeker van te zijn dat er geen celklonters aanwezig zijn. Zodra ik klaar ben met het fijnmalen, haal ik het filter uit het medium en gebruik ik de cellen die door de zeef zijn gegaan als enkelcel-suspensie.

Tijdens het malen moet u ervoor zorgen dat u al het weefsel zoveel mogelijk verbrijzelt. Uit deze suspensie van enkelvoudige cellen zullen we de CD4-positieve T-cellen zuiveren. Oké, ik ben nu klaar met het malen van het weefsel en u kunt zien dat de meeste lymfeklieren vrijwel volledig zijn verdwenen.

We hebben hier nog wat kleine stukjes vet en een soort omhulsel van een lymfeknoop met een klein beetje bindweefsel, dat allemaal samenklontert uit alle zes de lymfeklieren. En nu verwijder ik de cellenzeef. Je kunt hier zien dat het medium erg troebel is.

Het zit vol cellen uit de enkelcel-suspensie om ervoor te zorgen dat we een maximaal aantal cellen van het filter verkrijgen, aangezien sommige cellen eraan zullen kleven. Ik was het met een paar ml medium en pipetteer vervolgens al het medium in een Falcon-buis van 15 ml, waarna ik dit centrifugeer om de cellen als pellet te verzamelen voor latere zuivering. Hier is mijn enkelcel-suspensie, gecentrifugeerd en gepellet bij 300 G gedurende 10 minuten.

Als u verwacht een hoge populatie dode cellen te hebben in uw single cell-suspensie, is het raadzaam om de dead cell removal kit van Miltenyi Biotec te gebruiken. Nu ik dit pellet heb gevormd, ga ik het medium afgieten en een lyse van rode bloedcellen uitvoeren, waarna ik de cellen zal tellen en vervolgens een CD4-positieve T-cel negatieve selectiekit op deze specifieke cellen zal toepassen. Oké, nu ga ik de RBC-lyse uitvoeren.

We gaan de rode bloedcellen die we samen met de lymfocyten hebben gepelletteerd lyseren door de osmolariteit van de oplossing te verlagen, eerst door water toe te voegen en vervolgens terug te brengen naar een 1X-oplossing door 10X-DBPS toe te voegen. Onze lymfocyten zijn resistenter tegen de verandering in osmolariteit dan rode bloedcellen, maar we moeten nog steeds snel werken om te voorkomen dat we onze lymfocyten lyseren, wat we willen vermijden. Om snel te kunnen werken, vul ik de volumes die ik nodig heb voor de lyse al af voordat ik daadwerkelijk water aan het systeem toevoeg.

Ik wil mijn 10 X-D-B-P-S een paar seconden nadat ik het water heb toegevoegd kunnen toevoegen om er zeker van te zijn dat ik mijn lymfocyten niet lyseer en alleen de rode bloedcellen lyseer. Ik neem dus 900 µL water, wat bijna een milliliter is, en 100 µL 10 X-D-B-P-S.

Ik heb beide buisjes klaarstaan. Bij de lysis voeg ik het water toe, wacht een paar seconden, schud de buis eventueel een beetje en voeg dan de 10 X-D-B-P-S toe, waarna ik de buis nog wat verder schud. Als u veel rode bloedcellen lyseert, zult u zien dat er een grote, amorfe klomp ontstaat van alle gebroken celmembranen.

We hebben hier een klein beetje ervan en u kunt zien dat het een klein beetje gebroken celmembranen zijn. Dus nadat ik de lysis heb uitgevoerd, voeg ik, voor het geval er een pipetteerfout is gemaakt, graag een paar milliliter medium toe aan de cellen om er zeker van te zijn dat de osmolariteit correct is en dat we de lyse niet verder voortzetten. Oké, nu heb ik mijn lymfocyten in de suspensie van enkelvoudige cellen.

Ik heb de lysis van de rode bloedcellen voltooid en ik ga ze nu centrifugeren om een pellet te vormen. Voordat ik dit doe, ga ik ze tellen met een hemocytometer om te bepalen hoeveel antilichamen we moeten toevoegen voor de CD4-positieve T-cel negatieve selectiekit. Oké, ik centrifugeer nu de cellen in max-buffer en u kunt zien dat de pellet veel witter is nadat we de RBC-lysis hebben uitgevoerd.

Vervolgens ga ik een negatieve selectie uitvoeren voor CD4-positieve T-cellen. Hiervoor giet ik al het medium af, namelijk de MAX-buffer waarin de cellen zijn neergesponnen. Daarna label ik de cellen met de biotinyl-antilichaamcocktail, wat de eerste stap is in de negatieve selectie van CD4-positieve T-cellen.

Vervolgens incubeer ik dit 10 minuten in de koelkast. De cellen hebben nu hun eerste incubatie voltooid. Ik ga nu het antibioticum aan de microbeads toevoegen en deze nogmaals 15 minuten in de koelkast plaatsen.

Voor deze specifieke celseparatie gebruiken we een LS-kolom van Miltenyi Biotec. We plaatsen de kolom op de magnetische houder en bereiden deze voor door 3 mL MACS-buffer erdoorheen te laten lopen. We openen de kolom en plaatsen deze zodanig dat de pinnen naar binnen, richting de magneet, wijzen. Nu voeg ik de MACS-buffer toe aan de kolom; u zult zien dat deze door de LS-kolom stroomt en aan de onderzijde begint te druppelen. Maakt u zich geen zorgen als de kolom droog komt te staan.

De oppervlaktespanning van de vloeistof voorkomt dat deze droogvalt voordat u de cellen toevoegt. Voordat u de cellen toevoegt, is het belangrijk dat de max-buffer volledig door de kolom is gelopen. Nadat de incubatie van 15 minuten met onze biotinyl-magnetische beads, de cellen en de max-buffer is voltooid, giet ik de buffer weg en resuspendeer ik ze in een buffervolume dat passend is voor ons celgetal.

Daarom moet u hiervoor uw MiniTiny-protocol raadplegen. Vervolgens ga ik deze aanbrengen op de kolom die we zojuist met Max Buffer hebben gespoeld. We voegen nu de celsuspensie toe aan de kolom.

En omdat dit een negatieve selectiekolom is, gaan we de cellen opvangen die erdoorheen zijn gestroomd; in dit geval zouden dat allemaal CD4-positieve T-cellen moeten zijn. Ik ga de kolom nu wassen met 12 ml MAC-buffer en opnieuw de elutie opvangen, die alleen CD4-positieve T-cellen zou moeten bevatten. Nu ga ik de CD4-positieve T-cellen centrifugeren, ze resuspenderen en vervolgens labelen met de geschikte kleurstof die ik voor tau-imaging ga gebruiken.

Ik zal ook een kleine monstername doen van de cellen die ik heb gezuiverd en deze labelen met anti-CD3 en anti-CD4, om ze vervolgens via FACS te analyseren om er zeker van te zijn dat ik een zuivere populatie CD4-positieve T-cellen heb. Hier ziet u de cellen die we zojuist hebben gecentrifugeerd. Dit zou een populatie van zuivere CD3-, CD4-positieve T-cellen moeten zijn.

Ik heb u zojuist de negatieve selectie voor CD4-positieve T-cellen gedemonstreerd. Met behulp van de Miltenyi Biotec-kit gaan we deze cellen adoptief overbrengen naar een muis en deze gebruiken voor een van onze eigen T-cellen en machine-experimenten. Veel succes met uw eigen experimenten.