Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

Dit is een Max MIDI magneet. Er staat: voorzichtig, extreem sterke magnetische velden. Hoi, ik ben Melanie Matthew van het laboratorium van Mike Collins aan de University of California Irvine, Department of Physiology and Biophysics.

Vandaag gaan we u een negatieve selectiepreparatie van CD4-positieve T-cellen laten zien met behulp van de kits van Miltenyi Biotec. Hier hebben we de MiniMACS en de MACS-magneten; de MiniMACS worden gebruikt voor grotere scheidingen. U kunt tot 10⁹ cellen door een kolom leiden die in de MiniMACS past, terwijl de MACS-magneten worden gebruikt voor veel kleinere celvolumes.

Afhankelijk van het feit of u een positieve of een negatieve selectie uitvoert, labelt u de cellen met het juiste antilichaam. Deze zijn voorzien van een magnetische kraal die zich aan de magneet zal hechten. In het geval van een negatieve selectie zullen de cellen waarin u geïnteresseerd bent door de kolom stromen, waarna u het eluaat kunt opvangen, dat uw doelcellen bevat.

Ik moet vermelden dat de technieken die ik u vanavond laat zien niet steriel zijn. Als u deze cellen dus voor celkweek wilt gebruiken, dient u alles in de weefselkweekkap met steriele instrumenten uit te voeren. Hoewel ik u een preparatie voor CD4-positieve T-cellen laat zien, zijn veel van deze technieken toepasbaar bij de zuivering van andere celtypen met behulp van de Miltenyi Biotechnology kits.

Ik heb nu de lymfeklieren uit de muis verwijderd; in nummer zeven van JoVE, "lymph node preparation for two photon imaging", laat ik u zien hoe u dit in detail doet. Vervolgens ga ik de lymfeklieren vermalen tot een enkelcel-suspensie in een cellenzeef van 70 micron. Ik ga de lymfeklieren nu vermalen tot een enkelcel-suspensie met de achterkant van een spuit van 6 ml.

De lymfeklieren bevinden zich in RPMI in een filter, en het is belangrijk om een correcte enkelcel-suspensie te maken. De reden waarom we dit in een filter doen, is om er zeker van te zijn dat er geen celklonten aanwezig zijn. Wanneer ik klaar ben met het vermalen, haal ik het filter uit het medium en gebruik ik het materiaal dat door het zeefje is gegaan als de enkelcel-suspensie.

Tijdens het malen moet u ervoor zorgen dat u al het weefsel zo volledig mogelijk disrupteert. Uit deze suspensie van enkelvoudige cellen zullen we de CD4-positieve T-cellen zuiveren. Oké, ik ben nu klaar met het malen van het weefsel en u kunt zien dat de meeste lymfeklieren vrijwel volledig zijn verdwenen.

We hebben hier nog enkele kleine stukjes vet en een deel van het kapsel van een lymfeknoop met een beetje bindweefsel dat van alle zes de lymfeklieren aan elkaar kleeft. Nu verwijder ik de celzeef. U kunt hier zien dat het medium erg troebel is.

Het zit vol cellen uit de single-cell suspensie om ervoor te zorgen dat we een maximaal aantal cellen uit het filter halen, aangezien sommige daarvan eraan zullen kleven. Ik was dit met een paar ml medium en pipetteer vervolgens al het medium in een Falcon-buis van 15 ml, waarna ik dit centrifugeer om de cellen te pelleten voor latere zuivering. Hier is mijn single-cell suspensie, gecentrifugeerd en gepellet bij 300 G gedurende 10 minuten.

Als u verwacht een hoge populatie dode cellen te hebben in uw single-cell suspensie, is het raadzaam om de kit voor het verwijderen van dode cellen van Miltenyi Biotec te gebruiken. Nu ik dit pellet heb gevormd, ga ik het medium afgieten en een lysis van rode bloedcellen uitvoeren, waarna ik de cellen zal tellen en een CD4-positieve T-cel negatieve selectiekit op deze specifieke cellen zal toepassen. Oké, ik ga nu over tot de RBC-lysis.

We gaan de rode bloedcellen die we samen met de lymfocyten hebben gepellet lyseren door de osmolariteit van de oplossing te verlagen; dit doen we door eerst water toe te voegen en vervolgens de concentratie weer naar een 1X-oplossing te brengen door 10X-DBPS toe te voegen. Onze lymfocyten zijn resistenter tegen de verandering in osmolariteit dan rode bloedcellen, maar we moeten nog steeds snel werken om te voorkomen dat we ook de lymfocyten lyseren, wat we willen vermijden. Om snel te kunnen werken, vul ik de volumes die ik voor de lysis nodig heb al af voordat ik daadwerkelijk water aan het systeem toevoeg.

Ik wil mijn 10 X-D-B-P-S een paar seconden na het toevoegen van het water kunnen toevoegen om er zeker van te zijn dat ik mijn lymfocyten niet lyseer, terwijl ik wel de rode bloedcellen lyseer. Ik neem hiervoor 900 µL water, wat bijna een milliliter is, en 100 µL 10 X-D-B-P-S.

Ik heb beide buisjes klaarstaan. Bij de lysis voeg ik het water toe, wacht ik een paar seconden, schud ik de buis eventueel een beetje en voeg ik daarna de 10 X-D-B-P-S toe, waarna ik de buis nog wat verder schud. Als u veel rode bloedcellen lyseert, zult u zien dat er een grote, amorfe klomp ontstaat van alle gebroken celmembranen.

We hebben hier een kleine hoeveelheid en u kunt zien dat het gaat om enkele gebroken celmembranen. Nadat ik de lyse heb uitgevoerd, voeg ik ter preventie van eventuele pipetteerfouten graag een paar milliliter medium toe aan de cellen om er zeker van te zijn dat de osmolariteit correct is en dat de lyse niet verdergaat. Oké, nu heb ik mijn lymfocyten in de suspensie van enkelvoudige cellen.

Vervolgens heb ik de lyse van de rode bloedcellen uitgevoerd en ga ik ze centrifugeren om ze te pelletteren. Voordat ik dit doe, ga ik ze tellen met de hemocytometer om te bepalen hoeveel antilichamen we moeten toevoegen voor de CD4-positieve T-cel negatieve selectiekit. Oké, nu centrifugeer ik de cellen in MAX-buffer en je kunt zien dat de pellet veel witter is nadat we de RBC-lyse hebben uitgevoerd.

Vervolgens voer ik een negatieve selectie uit voor CD4-positieve T-cellen. Hiervoor giet ik al het medium af, inclusief de Max buffer waarin de cellen zijn gecentrifugeerd. Daarna label ik de cellen met de biotinyl-antilichaamcocktail, wat de eerste stap is in de negatieve selectie van CD4-positieve T-cellen.

Daarna incubeer ik het in de koelkast gedurende 10 minuten. Oké, de initiële incubatie van mijn cellen is nu voltooid. Nu ga ik het antibioticum aan de microbeads toevoegen en ze opnieuw 15 minuten in de koelkast plaatsen.

Voor deze specifieke celseparatie gebruiken we een LS-kolom van Miltenyi Biotec. We plaatsen de kolom op de magnetische houder en bereiden deze voor door 3 mL MACS-buffer erdoorheen te laten lopen. We openen de kolom en plaatsen deze zodanig dat de pinnen naar binnen, richting de magneet, wijzen. Nu voeg ik de MACS-buffer toe aan de kolom; u zult zien dat deze door de LS-kolom stroomt en onderaan begint te druppelen. Maak u geen zorgen als de kolom tijdelijk droog komt te staan.

De oppervlaktespanning van de vloeistof voorkomt dat de kolom uitdroogt voordat u de cellen toevoegt. Voordat u de cellen toevoegt, is het belangrijk dat de max-buffer volledig door de kolom is getrokken. Na de incubatie van 15 minuten met onze biotinylerede magnetische beads, die ik heb toegevoegd aan de cellen en de max-buffer, zal ik de buffer afgieten en de cellen resuspenderen in een buffervolume dat passend is voor ons aantal cellen.

Daarom moet u uw mini-protocol hiervoor raadplegen. Vervolgens breng ik ze aan op de kolom die we zojuist hebben gespoeld met max-buffer. We gaan nu de celsuspensie aan de kolom toevoegen.

En omdat dit een negatieve selectiekolom is, gaan we de cellen opvangen die erdoorheen zijn gestroomd; in dit geval zouden dat allemaal CD four positieve T-cellen moeten zijn. Nu ga ik de kolom wassen met 12 ml max-buffer en opnieuw vangen we het eluaat op, dat enkel CD four positieve T-cellen zou moeten bevatten. Vervolgens ga ik de CD four positieve T-cellen centrifugeren, ze resuspenderen en ze labelen met de geschikte kleurstof die ik voor tau-imaging ga gebruiken.

Ik ga ook een kleine monstername doen van de gezuiverde cellen en deze labelen met anti-CD3 en anti-CD4, om ze vervolgens via FACS te analyseren en zo te bevestigen dat ik een zuivere populatie CD4-positieve T-cellen heb. Hier is een blik op de cellen die we zojuist hebben gecentrifugeerd. Dit zou een populatie van zuivere CD3, CD4-positieve T-cellen moeten zijn.

Ik heb zojuist de negatieve selectie voor CD4-positieve T-cellen gedemonstreerd. Met behulp van de Miltenyi Biotec-kit gaan we deze cellen adoptief overbrengen naar een muis en deze gebruiken voor een van onze eigen T-photon- en machine-experimenten. Veel succes met uw eigen experimenten.