Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in C. elegans

Het doel van deze procedure is om de afmetingen en helderheid van punctvormige fluorescente signalen in gans efficiënt te kwantificeren. Hierdoor kunnen grote populaties objecten worden geanalyseerd. Synaptische eiwitten worden statistisch in beeld gebracht.

In deze demonstratie is de eerste stap van de procedure het genereren van gesynchroniseerde culturen met een hoge dichtheid van de betreffende ELEGANS. Vervolgens worden confocale beelden van de gelabelde synapsen verkregen, waarbij de variabiliteit tussen de beelden tot een minimum wordt beperkt. Synaptische puncta worden automatisch geïdentificeerd en onderscheiden van de achtergrondfluorescentie.

De laatste stap is het tabuleren en organiseren van de gegevens voor een efficiënte analyse in een later stadium. Uiteindelijk kunnen de resultaten nauwkeurig aantonen hoe experimentele condities de distributie van synaptische eiwitten of elk ander eiwit dat gelokaliseerd is in contrastrijke puncta beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de analyse van Zack-projecties, is dat alle gegevens behouden blijven, inclusief synapsvolumes, en dat automatische identificatie het snel verzamelen van honderden monsters per conditie mogelijk maakt.

Dit protocol vereist hoogdensiteitsculturen van volwassen CL egan's wormen, gekweekt op 10 centimeter hoge peptide NGM-agarplaten met NA 22 E. coli-bacteriën; zorg dat er precies één plaat klaarstaat voor elke geplande immunologische kleuring. Begin met het oogsten van de wormen met een paar milliliter water. Breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter en herhaal dit proces totdat de meeste wormen zijn verzameld.

Centrifugeer de wormen om een pellet te vormen en was de pellet tot drie keer met water totdat het supernatant helder is. Dit verwijdert residuele bacteriële overdrachtsoluties; gebruik altijd plastic pipetten voor het overbrengen van oplossingen die wormen of eitjes kunnen bevatten, aangezien deze aan glas kunnen hechten. Het is nu cruciaal om de overige stappen snel uit te voeren om verlies van de levensvatbaarheid van de eitjes te voorkomen.

Bevrijd de eitjes van de worm door ze te laten weken in vijf milliliter alkalische hypochlorietoplossing. Schud de buisjes voorzichtig en controleer ze ongeveer elke minuut onder een dissectiemicroscoop. Doe dit gedurende vijf minuten, of zodra ongeveer de helft van de wormen in een buisje gebogen en opengebroken lijkt.

Vul de buis tot aan de rand met ei-buffer en keer deze meerdere keren om. Na het pelleten van de wormen wordt het supernatant opgezogen en weggegooid. Was vervolgens de pellet drie keer met ei-buffer.

Na het wassen resuspendeert Reese het pellet in vijf milliliter water, waarna vijf milliliter steriele 60% sucrose in water wordt toegevoegd en goed gemengd. Na het centrifugeren van de suspensie bevinden de eieren zich bij de meniscus en zien ze er troebel uit.

Breng elke eiercollectie over naar een eigen ongeënt NGM-agarplaat van 10 centimeter. Water kan worden gebruikt om de eieren naar de plaat te spoelen, maar probeer de hoeveelheid overgedragen vloeistof tot een minimum te beperken. Incubeer de platen gedurende de eerste paar uur bij 20 °C en vervolgens de rest van de nacht. Laat de platen ventileren door de deksels iets open te laten staan, maar zorg ervoor dat ze gedurende de nacht volledig gesloten zijn.

Breng na het uitkomen de L1-larven over naar een conische buis van 15 milliliter gevuld met S basil. Pellet de L1-larven en resuspendeer ze in een minimaal volume S basil. Verdeel vervolgens elke L1-collectie over twee NGM-agarplaten van 10 centimeter geënt met NA 22-bacteriën.

Controleer de culturen één of twee keer per dag. Als er risico is op uithongering, moeten ze worden overgebracht naar verse NA 22-platen voordat ze uithongeren, aangezien type N2-verzamelingslijnen zich als een golf samen bewegen, weg van voedingsarme zones op deze platen; het voedsel zal binnen enkele uren volledig uitgeput raken.

Wanneer de wormen de gewenste leeftijd hebben bereikt, zijn ze klaar voor immunostaining of live imaging om de wormen te mounten. Gebruik voor confocale imaging Antifa mounting media om hun dichtheid aan te passen naar enkele honderden wormen per µL.

Met ervaring kan deze dichtheid worden herkend aan de troebelheid van de suspensie. Idealiter liggen de wormen dicht op elkaar op het microscoopglas, maar zonder elkaar overmatig te overlappen. Maak op het objectglas een druppel van 2% aros in ESP basil, omringd door een dunne ring Vaseline.

Om verdamping tijdens de beeldvorming te voorkomen, brengt u de Vaseline aan via een spuit van drie milliliter voorzien van een afgeknipte naald van 25 gauge. Pipetteer nu enkele microliters van de wormsuspensie op een dekglas met een pipetpunt waarvan het uiteinde is afgeknipt om afschuiving van de wormen te voorkomen en plaats het agarose-kussen op het dekglas, waarbij de wormen onder de microscoop gelijkmatig over het kussen worden verspreid. Synapsen van belang moeten zo georiënteerd zijn dat ze direct naar de lens wijzen of zich binnen 45 graden van de lens bevinden.

Besteed hier enkele seconden aan om fotobleken te voorkomen. De cultuur en de condities moeten voldoende wormen opleveren om aan dit strikte criterium te voldoen, hier getoond als een ideale oriëntatie waarbij het ventrale zenuwstreng direct naar de objectieflens is gericht. De volgende zou worden afgewezen omdat het ventrale zenuwstreng direct van de objectieflens af is gericht.

Let op hoe het rugstreng die in dit specimen naar de lens is gericht, een scherper gefocust beeld produceert. Hier is een ander specimen dat zou worden afgewezen omdat de rug- en buikstrengen aan de randen van de worm zijn georiënteerd. Hierdoor moet het excitatie- en emissielicht door meer wormweefsel passeren en zou het beeld vervormd raken.

De grootste uitdaging is het minimaliseren van de variabiliteit binnen behandelingsgroepen; synchronisatie van de leeftijd en het kiezen van wormen waarbij de structuur van belang direct naar de objectieflens is georiënteerd, kan hierbij sterk helpen. Door te beginnen met grote culturen wordt de keuze uit wormen vergroot voor een maximale consistentie. Voor de beste beelresultaten kiest u relatief platte monsters die binnen een stack van 14 of minder beelden kunnen worden opgenomen.

Snedes met een dikte van 0,4 micron. Beelden met een hoge snelheid en lage resolutie zijn voldoende voor een snelle en nauwkeurige gegevensverzameling. Vermijd verzadiging van de detector door overmatige signaalsterktes, aangezien dit zal leiden tot een onderschatting van de fluorescentiesignalen.

Deze demonstratie maakt gebruik van het commercieel verkrijgbare softwarepakket velocity, waarvoor minimaal versie 4.0 vereist is. Veel alternatieve softwarekeuzes gaan ten koste van de driedimensionale informatie. Selecteer na het openen van de multi-tiff-outputbestanden van de confocale microscoop de optie image, vervolgens extended focus en daarna freehand.

Kies nu met de ROI de delen van de afbeelding die de structuur van belang niet bevatten en crop deze weg. Met behulp van de geactiveerde tool biedt extended focus een Z-vlakprojectie om de ROI-selectie te vergemakkelijken. Dit heeft geen invloed op de onderliggende gegevens.

Hetzelfde geldt voor aanpassingen in helderheid en contrast; deze hebben geen invloed op de onderliggende gegevens. Voltooi het bijsnijden door 'actions' en vervolgens 'crop to selection' te selecteren. Meet daarna de lengte van het geanalyseerde gebied.

Met de lijntool wordt de lengte van de lijn berekend en aan de datatabel toegevoegd. Identificeer nu objecten met behulp van het filter 'objects by intensity' in de meetmodus. De toevoeging van een onafhankelijke synaptische marker, gelabeld met een unieke kleur, kan helpen om synapsen eenduidig te identificeren; bepaal een drempelwaarde zodat synaptische clusters worden gemarkeerd en de niet-synaptische achtergrond niet.

Voer dit slechts één keer uit met een controlemonster en gebruik dit voor alle volgende monsters; het bepalen van de drempelwaarde voor elk monster afzonderlijk is onaanvaardbaar omdat dit de kans op experimentele bias introduceert. Objecten worden automatisch geselecteerd en getabelleerd. Typische synapsen variëren van enkele voxels tot enkele honderden voxels; sorteer de gegevens op objectgrootte voordat u de gegevens exporteert.

Dit vergemakkelikt de daaropvolgende verwijdering van objecten van twee voxels of minder, wat meestal slechts achtergrondspikkels zijn. Exporteer de gegevens nu in CSV-formaten, die met elk spreadsheetprogramma kunnen worden geopend. Elke afbeelding produceert één uitvoerbestand om micrografen van het ventrale zenuwstelsel van de CL gans te sorteren en te exporteren, waarbij er met het beschreven protocol 49 GABA-receptoren zijn aangetroffen.

Alle dieren leken zeer vergelijkbaar in grootte en rijpheid. De totale synaptische fluorescentiewaarden voor vijf wormen werden genormaliseerd naar de lengte van het geanalyseerde zenuwkoord. Deze gegevens vertoonden standaardfoutwaarden van ongeveer 10% van het gemiddelde.

De afbeelding links is onbewerkt, zonder drempelwaarde-instelling en verwijdering van achtergrondspeculariteit. De synapsen werden behandeld met muscarine, een GABA-receptoragonist die ervoor zorgt dat receptoren na langdurige blootstelling worden gedownreguleerd. De totale fluorescentie werd gekwantificeerd en genormaliseerd naar de cumulatieve waarschijnlijkheid van de lengte van het zenuwsnoer.

Histogrammen van de fluorescentie-inhoud van individuele synapsen werden berekend. Hetzelfde werd berekend voor het synaptisch volume. Deze metingen tonen aan dat blootstelling aan een agonist de synaptische inhoud en het volume significant vermindert.

Over het algemeen moeten kwantitatieve resultaten altijd een weerspiegeling zijn van wat visueel waarneembaar is. Indien dit niet het geval is, moet inspectie van de beelden en de objecten die op basis van snelheid zijn geïdentificeerd, uitwijzen waar de fout is ontstaan en aanleiding geven tot correctieve maatregelen, zoals drempelwaarde-instelling of het verwijderen van artefacten tijdens deze procedure. Het is essentieel om wormen voor beeldvorming te selecteren op basis van hun geometrische oriëntatie in plaats van een subjectieve beoordeling van de beeldkwaliteit; waar mogelijk wordt blinde scoring sterk aanbevolen.