Name: Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer een protocol voor uitputting en reconstitutie van macrofagen in muizen om de rol van gepolariseerde macrofagen in immunologie en ontsteking te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een &#39;Grant ten behoeve van onderzoek&#39; van de Crohn en Colitis Foundation of Canada naar LMS, die wordt bijgestaan ​​door een Canadese Vereniging van Gastro-enterologie / Canadese Vereniging van Health Research / Crohn en Colitis Foundation of Canada New Investigator Award.

1. Aantasten Macrofagen Met behulp van Clodronaat-bevattende liposomen <ol><li> Liposomen zijn opgeslagen bij 4 ° C. Twee uur voor de injectie, verwijder clodronaat-bevattende liposomen, PBS-bevattende liposomen, of steriele PBS (injectie controle) uit de koelkast zodat ze om te acclimatiseren op kamertemperatuur (18 ° C). </li><li> Keren de buizen liposomen 8-10 maal om een ​​gelijkmatige verdeling ontstaat voor het laden 200 pi in een 1 ml spuit. Bevestig een 26 gauge naald voor aan de bovenkant van de spuit. </li><li> Met behulp van je linkerhand, scruff de muis net onder de oren vasthouden genoeg de huid haar hoofd en ledematen te immobiliseren. </li><li> Kantel de muis, zodat het hoofd iets naar de grond, zodat de inwendige organen af ​​te stappen van de injectieplaats, die is gelegen in de rechter kwadrant van de buik. </li><li> Rol de spuit tussen uw handpalmen en keer het 6 keer om het liposoom gelijkmatig oplossing voor de injectie te verdelen. </li> &lt;li&gt; Steek de naald in de rechter zijkant van de muis buik op een 30-40 graden. Injecteer 200 ul liposoom oplossing of PBS. </li><li> Tijdens een geïnduceerde ontsteking model, zoals DSS-geïnduceerde colitis, injecteren muizen 4 dagen voor aanvang van de experimentele ontsteking tot uitputting van de inwoner macrofagen en om de 2 dagen te verzekeren tijdens het protocol bij nieuwe infiltrerende macrofagen afbreken. </li><li> Aan het einde van het experiment, samen met de geplande experimentele analyses, verwijder weefsels van de plaats van belang en bevestig deze met paraformaldehyde tot macrofagen uitputting te bevestigen door immunohistochemische kleuring. </li></ol> 2. Afleiding van gepolariseerde Macrofagen uit beenmerg aspiratae <ol><li> Beenmerg van muizen tussen 8 en 12 weken bepaald de hoogste opbrengst van beenmerg-afgeleide macrofagen. Euthanaseren van de muis, leg het op zijn rug, en vast te pinnen zijn poten, dat zich uitstrekt zijn ledematen zoveel mogelijk. </li><li> Werken in een steriele hood, verwijder het dijbeen en de dij-, weg te snijden zo veel spieren mogelijk te maken. </li><li> Spoel beenmerg van beenderen met IMDM met 10% FCS geladen in een 5 ml uitgerust met een 26 gauge naald. </li><li> Verdun beenmerg zuigt 40 ml in IMDM met 10% FCS, plaats cellen in een 75 cm2 weefselkweek erlenmeyer, en incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 4 uur. Deze stap verwijdert hechtende mesenchymale cellen of rijpe macrofagen van hematopoietische voorlopercellen. </li><li> Transfer kweeksupernatant met niet-hechtende voorlopers 50 ml Falconbuis conische en centrifugeer 5 min bij 1200 rpm. </li><li> Hersuspenderen celpellet in 5 ml IMDM, 10% FCS en tellen kern cellen door verdunnen celsuspensie 1 20 in azijnzuur. Deze procedure lyseert alle cellen met inbegrip van rode bloedcellen en de overige kernen kan worden gerekend op een hemocytometer. </li><li> Hersuspenderen cellen bij een concentratie van 0,5 x 10 6 cellen / ml in compleet medium, IMDM, 10% FCS, 150 uM monothioglycerol (MTG), en 10 ng / ml van een MCSF, GM-CSF of IL-3. MCSF-afgeleide macrofagen zijn klassiek geactiveerde macrofagen terwijl GM-CSF-of IL-3-afgeleide macrofagen worden afwisselend geactiveerd. </li><li> Vervang medium op dag 4, te stoppen met draaien niet-hechtende cellen en de terugzending daarvan aan de kolf, en op dag 7 en gooi niet-hechtende cellen. </li><li> Bovendien kan IFNy (10 ng / ml) of IL-4 (10 ng / ml) toegevoegd flesjes MCSF-afgeleide cellen op dag 7 schuin macrofagen een klassiek geactiveerd of alternatief geactiveerd fenotype, respectievelijk. Incubeer cellen voor 3 dagen. </li><li> Op dag 10, verwijder media en til cellen off van de weefselkweek fles met behulp van Cell Dissociation Buffer (Gibco-BRL). Place 5 ml buffer op cellen gedurende 5 min bij kamertemperatuur (18 ° C) en stoten de zijkant van de kolf met de hiel van de handpalm enkele malen stevig. Zorg ervoor dat de cellen zijn gestart van de kolf door onderzoek van de kolf onder eenmicroscoop. Pipet geresuspendeerd cellen in een 15 ml Falcon buis konische en was de kolf met een extra 10 ml IMDM, 10% FBS. Pool en spin down van de cellen gedurende 5 min bij 300 × g. </li><li> Tellen levensvatbare cellen door een hemocytometer en hersuspenderen bij een concentratie van 10 7 cellen / ml in steriel PBS pH 7,4. Macrofagen zijn er klaar voor injectie in muizen. </li><li> Reserve 1,0 × 10 6 macrofagen voor de beoordeling van de macrofaag fenotype. Klassiek geactiveerde macrofagen gestimuleerd met lipopolysaccharide scheiden een hoog niveau van stikstofoxide en IL-12p70 en lage niveaus van IL-10 in vergelijking met alternatief geactiveerde macrofagen. Ook geactiveerde macrofagen constitutief drukken YM1 en arginase I (Argi), dat kan worden gedetecteerd door Western immunoblotting. </li></ol> 3. Overmaking van macrofagen in muizen <ol><li> Hersuspenderen macrofagen in steriele PBS in een concentratie van 10 7 cellen / ml. Dit maakt een intravenous injectie van 10 6 macrofagen in een totaal volume van 100 pi, die een volume kan worden veilig en gemakkelijk in muizen geïnjecteerd staartader. </li><li> Warm muizen met behulp van een verwarmingselement of warmte schoot gedurende 5-10 minuten tot de staartader verwijden. Bewaken van de muis te allen tijde op tekenen van hyperthermie. </li><li> Breng de muis om een ​​beveiligingssysteem dat de toegang tot de staart aderen mogelijk maakt. </li><li> Draai de staart 90 °, zodat de ader naar boven is gericht. Aders lopen zijwaarts op beide zijden van de staart en een ader kan worden gebruikt. </li><li> Reinig de injectieplaats met een alcoholdoekje en injecteer langzaam 100 ul (10 6 macrofagen) met een 1 ml spuit met een 26 of 28 gauge naald. Steek de naald met de schuine kant naar boven en onder een lichte hoek, bijna parallel aan de ader. </li><li> Als de naald correct is geplaatst zonder weerstand moet worden gevoeld en de ader moet duidelijk worden na de injectie. Als de naald zich niet in deader, de staart zal bult. Als dit gebeurt, verwijder de naald en probeer het opnieuw proximaal van de laatste poging of in de andere ader. Een nieuwe naald moet worden gebruikt voor elke injectie als de staart is taai en de naalden dof snel tijdens staartader injectie. </li><li> Na de injectie, verwijder de naald, druk zachtjes op de injectieplaats tot de bloeding stopt, en toezicht houden op de muis voor een extra 5min om ervoor te zorgen dat de bloeding is gestopt. </li><li> Herhaal macrofaag injecties om de 4 dagen een continue levering van gepolariseerd macrofagen tijdens de experimentele procedure te garanderen. </li><li> Aan het einde van het experiment, samen met experimentele analyses, verwijder weefsels van de plaats van belang en bevestig deze met paraformaldehyde of formaline tot het effectief bereiken van gepolariseerd macrofagen door immunohistochemische kleuring te bevestigen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Het aantal en de fenotype van de ingezeten macrophages in elk weefsel afhankelijk van het weefsel onderzocht en zal veranderen infectie of ontsteking. Ook zal het vermogen van clodronaat bevattende liposomen macrofagen putten uit een weefsel afhangen van de route van toediening en effectieve de doelweefsel. Intraperitoneale injectie van clodronaat bevattende liposomen resulteert in een afname F4/80 + macrofagen in de muis colon bij DSS colitis-zichtbaar door immunohistochernische kleuring voor het macrofaag marker F4/80 (figuur 1A). Histologische vlekken kunnen ook worden gebruikt om kwantitatieve verschillen in macrofagen aantal en fenotype in weefselcoupes bepalen. Figuur 1b toont dat gemiddeld 55% van macrofagen is uitgeput door clodronaat bevattende liposomen in vergelijking met geen afbraak gedetecteerd muis zuilen bij muizen geïnjecteerd PBS alleen een injectie controle. Elke waarde wordt bepaald door het tellen van F4/80 en Argi vleked positieve cellen in serie weefselcoupes van 6 muizen op 3 punten, in 3 delen per muis met het tellen wordt uitgevoerd door twee personen blind voor experimentele conditie. Deze resultaten demonstreren dat intraperitoneale injecties clodronaat liposomen colon bij muizen macrofagen afbreken. Afleiding van macrofagen van beenmerg in de aanwezigheid van verschillende groeifactoren opbrengst macrofagen die klassiek geactiveerd (MCSF gewonnen of MCSF afkomstige en behandeld met IFNy) of geactiveerde (GM-CSF of IL-3 afgeleide of MCSF afgeleid en behandeld met IL-4). Vlissingen beenmerg van 2 dijbeen en 2 dij van een 8 weken oude muis meestal levert 6 × 10 7 cellen met een kern per muis en levert 8 × 10 6 MCSF-afgeleide macrofagen, 10 × 10 6 GM-CSF-afgeleide macrofagen, of 12 × 10 6 IL-3 afgeleide macrofagen. Figuur 2A toont sup nitriet en IL-12p70/IL-10 verhouding macrofaagernatants behandeld met lipopolysaccharide 24 uur Figuur 2B toont een typische Western blot analyse van 0,5 x 10 6 macrofagen van MCSF + / -. IL-4 afleiding voorwaarden onderzocht met antilichamen voor alternatief geactiveerde macrofagen markers, Argi, YM1 of met een GAPDH laden van controle. Deze gegevens tonen aan dat het beenmerg-afgeleide macrofagen kunnen worden scheef naar een gepolariseerde fenotype tijdens de afleiding. Efficiënte overdracht van ex vivo verkregen gepolariseerde macrofagen een weefsel is afhankelijk van de wijze van toediening en de toegang tot het weefsel. Tijdens de DSS-geïnduceerde colitis, macrofagen intraveneus te reizen naar de plaats van de ontsteking en als alternatief geactiveerde macrofagen te verminderen ernst van de ziekte. Figuur 3A toont het totale aantal van macrofagen en het aantal Argi + (als alternatief geactiveerd) macrofagen geteld in histologische coupes van muizen geïnjecteerd met gepolariseerde beenmergAfgeleid macrofagen. De impact van de overdracht van gepolariseerd macrofagen om de dikke darm tijdens DSS-geïnduceerde colitis wordt aangegeven door activiteit van de ziekte-index, een additief score op basis van gewichtsverlies, rectale bloedingen en een verminderde consistentie van de ontlasting (Figuur 3B). Deze resultaten tonen aan dat de ex vivo verkregen, adoptief overgedragen macrofagen kan het verkeer naar de dikke darm en de impact geïnduceerde ontsteking. M1 macrofagen hebben geen invloed op ontstekingen terwijl M2 macrofagen aanzienlijk verminderen ziekte activiteit index. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Clodronaat-bevattende liposomen effectief F4/80 afbrekende + en F480 + Argi + cellen in muis dubbele punten in vivo. Een F2 generatie van wild-type muizen op een gemengde C57BL / 6 × 129Sv achtergrond kregen 5% DSS voor 7 dagen en geïnjecteerde IP met PBS (Control) of clodronaat-bevattende liposomen (Clodronaat) 4 dagen voorafgaand aan de behandeling DSSen op dag 0, 2, 4 en 6 in DSS behandeling. (A) dikke darmen werden verwijderd, vast, en secties werden gekleurd door immunohistochemie voor de rijpe macrofagen (F4/80) en de M2 ​​macrofaag marker, Argi. (B) Kwantificering van F4/80 + en + Argi macrofagen. Positief gekleurde cellen werden geteld door twee personen blind voor experimentele conditie bij 40 x vergroting in 6 velden van 3 secties / muis en vanaf 6 muizen / groep. * P &lt;0.01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. MCSF-afgeleide macrofagen drukken een klassiek geactiveerde fenotype en MCSF-afgeleide macrofagen behandeld met IL-4 te drukken een alternatief geactiveerde macrofagen fenotype. (A) Overeenkomstig een klassiek geactiveerde fenotype MCSF afgeleide macrofagen produceren hogere stikstofmonoxide in reactie op lipopolysaccharide en kan gemeten worden door de Griess test, die het stroomafwaartse metaboliet nitriet detecteert. Ze ALSo produceren hogere IL-12p70/IL-10 verhouding die kan worden gemeten met ELISA. * P &lt;0,01 voor n = 3. (B) Overeenkomstig een alternatief geactiveerde fenotype MCSF afgeleide macrofagen behandeld met IL-4 constitutief express YM1 en Argi, dat kan worden gedetecteerd door Western immunoblotting. De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten met vergelijkbare resultaten. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Intraveneuze geïnjecteerd, ex vivo-afgeleid alternatief geactiveerde macrofagen verkeer naar de dikke darm en vermindering van intestinale ontsteking. Een F2 generatie van wild-type muizen op een gemengde C57BL / 6 × 129Sv achtergrond kregen 5% DSS in het drinkwater voor zes dagen. M1 en M2 macrofagen werden geïnjecteerd IV op de dagen 0 en 4 tijdens de DSS-behandeling. (A) dikke darmen werden verwijderd, vast, en secties werden gekleurd door immunohistochemie voor de rijpe macrofagen (F4/80) en een M2-macrofaag marker (Argi).Kwantificering van macrofagen de controle PBS geïnjecteerde muizen (C) werden muizen geïnjecteerd met M1 macrofagen (+ M1) en muizen ingespoten met M2 macrofagen (+ M2) uitgevoerd door het tellen positief aangekleurde cellen bij 40 x vergroting in 6 gebied van 3 delen / muis en van 6 muizen / groep. Tellen werd uitgevoerd door twee personen blind voor experimentele conditie. (B) ziekte-activiteit werd gevolgd en dagelijks gescoord tijdens de behandeling en is een additief score op basis van gewichtsverlies, rectale bloedingen en een verminderde consistentie van de ontlasting. * P &lt;0,05 voor n = 6 muizen 2 onafhankelijke experimenten.

<ol><li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+dendritic+cells%2C+macrophages%2C+and+epithelial+cells+in+the+gut%3A+implications+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).</li>
<li>Heinsbroek, S. E., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in inflammatory bowel diseases.</a> Expert Rev. Mol. Med. 11, e14(2009).</li>
<li>Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+putative+role+of+inflammation+in+the+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome.</a> Gut. 49, 743-745 (2001).</li>
<li>Maeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer-derived+factors+activate+NF-kappaB+in+myeloid+cells+via+TLR2+to+link+inflammation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med.+Report%22%5BJournal%5D)">Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis.</a> Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).</li>
<li>van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes%3A+perspectives+in+research+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics.</a> J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).</li>
<li>Hunter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-derived+alternatively+activated+macrophages+reduce+colonic+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice.</a> Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).</li>
<li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP-deficient%2C+alternatively+activated+macrophages+protect+mice+during+DSS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).</li>
<li>Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+colitis+by+intestinal+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).</li>
<li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+mediated+depletion+of+macrophages%3A+mechanism+of+action%2C+preparation+of+liposomes+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li>
<li>Smith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+a+helminth+parasite+prevents+experimental+colitis+via+a+macrophage-mediated+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism.</a> J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).</li>
<li>van Rooijen, N., Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+for+specific+depletion+of+macrophages+from+organs+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).</li>
<li>Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+vitreal+macrophages+and+circulating+leukocytes+in+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).</li>
<li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages+by+IL-4+requires+SHIP+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation.</a> Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).</li>
<li>Cailhier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+demonstrates+that+resident+macrophages+initiate+acute+peritoneal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation.</a> J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Macrofagen zijn fagocyterende cellen die een belangrijke rol in het immuunsysteem spelen. Zij zijn verantwoordelijk voor de inleiding van de aangeboren immuunrespons en de leiding van de verworven immuunrespons. Typisch, zijn klassiek geactiveerde macrofagen geactiveerd door IFNy of LPS en zijn verantwoordelijk voor het elimineren van pathogenen en het monteren van een ontstekingsreactie 1. Omgekeerd worden afwisselend geactiveerde macrofagen geactiveerd door IL-4 of IL-13 en een rol puin spoelen en weefselre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Clodronaat bevattende liposomen </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS bevattende liposomen </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> Steriele PBS pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Foetaal Kalf Serum (FKS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> azijnzuur </td><td> BDH ARISTAR </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monothioglycerol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombinant muizen MCSF </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Recombinant muizen GM-CSF </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Recombinant muriene IL-3 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Recombinant muizen IFNy </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Recombinant muriene IL-4 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Cell Dissociatie Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Rat anti-F4/80 Antilichaam </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Muis anti-Argi antilichaam </td><td> BD Transduction Laboratories </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia in dit protocol.

uitputting en reconstitutie van macrofagen in muizen

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrofagen zijn kritisch spelers in de aangeboren immuunrespons op infectueuze uitdaging of letsel, de inleiding van de aangeboren immuunrespons en de leiding van de verworven immuunrespons. Macrofagen disfunctie kan leiden tot een onvermogen om een ​​adequate immuunrespons en als zodanig, zijn in vele ziekteprocessen, zoals inflammatoire darmziekten. Macrofagen weer te geven gepolariseerde fenotypen die in het algemeen onderverdeeld in twee categorieën. Klassiek geactiveerde macrofagen, geactiveerd door stimulatie met IFNy of LPS, spelen een essentiële rol in reactie op bacteriële uitdaging terwijl alternatief geactiveerde macrofagen, geactiveerd door IL-4 of IL-13, deel te nemen aan puin wegvangen en weefselremodellering en zijn betrokken bij de resolutie fase van ontsteking. Tijdens een ontstekingsreactie in vivo, zijn macrofagen gevonden te midden van een complex mengsel van infiltrerende immuuncellen en kunnen deelnemen door verergeren of resolving ontsteking. De rol van macrofagen bepalen in situ in een geheel diermodel is worden onderzocht het effect van afbreken macrofagen van de complexe omgeving. Voor vragen over de rol van de macrofaag fenotype in situ te vragen, kan fenotypisch gedefinieerd gepolariseerde macrofagen worden ontleend ex vivo, uit het beenmerg zuigt en toegevoegd terug naar muizen, met of zonder voorafgaande uitputting van de macrofagen. In de hier gepresenteerde protocol clodronaat bevattende liposomen versus PBS geïnjecteerd controles werden gebruikt colon macrofagen afbreken in dextran natriumsulfaat (DSS) geïnduceerde colitis bij muizen. Daarnaast werden gepolariseerde macrofagen afgeleid ex vivo en overgedragen aan muizen door intraveneuze injectie. Een waarschuwing deze benadering is dat clodronaat bevattende liposomen afbreken alle professionele fagocyten, zowel dendritische cellen macrofagen, zodat om het effect waargenomen door depletie macrofagen specifieke reconstitutie of fenotype van adoptieve overdracht van macrofagen noodzakelijk. Systemische macrofaag depletie in muizen kunnen worden bereikt door het terugkruisen muizen op een CD11b-DTR achtergrond, hetgeen een uitstekende complementaire aanpak. Het voordeel van clodronaat bevattende liposoom-gemedieerde afbraak is dat het niet de tijd en kosten in terugkruisen muizen vereist en kan worden gebruikt bij muizen ongeacht de achtergrond van de muizen (C57BL / 6, BALB / c, of gemengd achtergrond ).

Macrofagen spelen een centrale rol in homeostase en pathologie in vele weefsels. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft methoden voor uitputting van macrofagen<em&gt; In vivo</em&gt;, Die voortvloeien gepolariseerde macrofagen uit het beenmerg zuigt, en adoptief overdracht van macrofagen in muizen. Deze technieken laten toe de bepaling van de rol die gepolariseerde macrofagen spelen bij gezondheid en ziekte.

Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen

Macrofagen zijn cruciale spelers in de aangeboren immuunrespons op infectieuze uitdagingen of letsel, waarbij zij de aangeboren immuunrespons initiëren en sturen ...

Het doel van het volgende experiment is om de rol van gepolariseerde macrofagen in een biologisch proces in vivo te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst macrofagen uit muizen te depleteren. Vervolgens worden er nieuwe macrofagen gegenereerd die unieke kenmerken tot expressie brengen en over verschillende functies beschikken.Vervolgens worden de gepolariseerde macrofagen adoptief overgebracht in muizen om hun rol in het biologische proces van belang te bepalen. Uiteindelijk kunnen verschillen in macrofaag-gemedieerde ontsteking op basis van klinische en histologische ziektebeelden worden gemeten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het kruisen van muizen op een CD 11 BDTR-achtergrond, is dat deze methode sneller is dan het fokken van muizen.Voor experimenten. Het is relatief eenvoudig en kosteneffectief en kan worden uitgevoerd met muizen van elke genetische achtergrond. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de rol van macrofagen in de darm, kan deze ook worden toegepast op diverse andere organen, waaronder de lever, milt en long.Haal de buisjes met liposomen en PBS twee uur voor de injectie uit de opslag bij vier graden Celsi

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk...

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

We presenteren de methoden voor de beoordeling van de fagocytische capaciteit van primaire lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van fluorescently geëtiketteerde myeline puin en intracellulaire lipide druppel kleuring.

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

We illustreren een straight-forward methode om te ontlenen lymfkliertest primaire macrofagen van beenmergcellen en een eenvoudige methode om te bereiden BSA-vetzuur conjugaten. Dan tonen we dat verzadigde vetzuren leiden de dood van de cel van de macrofaag tot kan, en dergelijke celdood positief geassocieerd met cellulaire accumulatie van ceramide niveaus wordt.

Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Deze studie toont aan dat het gebruik van stroom cytometry te detecteren van reactieve zuurstof soorten (ROS) productie als gevolg van de activering van de FcγR. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen van veranderingen in de antimicrobiële en redox signaalfunctie van fagocyten in reactie op immuuncomplexen, opsonized micro-organismen of directe FcγR dwarsbinding.

Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Leer een protocol voor uitputting en reconstitutie van macrofagen in muizen om de rol van gepolariseerde macrofagen in immunologie en ontsteking te bestuderen.

Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen

Meer video's verkennen