Name: Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Leer hoe je fluorescerend gelatine gecoate dekplaatjes maakt voor kwantitatieve analyse van invadopodia-gemedieerde matrixdegradatie. Deze methode omvat celkweek, fixatie en fluorescentiebeeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door fondsen uit schenkingen van de Universiteit van West Virginia Mary Babb Randolph Cancer Center. Wij danken Susette Mueller (Georgetown University) en Laura Kelley voor vroege advies en bijstand. Het gebruik van de Universiteit van West Virginia Microscopie Imaging Facility (ondersteund door de Mary Babb Randolph Cancer Center en, NIH subsidies P20 RR16440, P30 en P30 RR032138 GM103488) wordt dankbaar erkend.

<ol><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Life at the leading edge.</a> Cell. 145, 1012-1022 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+degradation+of+fibronectin+at+sites+of+expression+of+the+transforming+gene+product+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src.</a> Nature. 316, 156-158 (1985).</li>
<li>Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interactions+of+cortactin+and+membrane+type+1+matrix+metalloproteinase+at+invadopodia%3A+defining+the+stages+of+invadopodia+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function.</a> Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).</li>
<li>Ayala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+inputs+converge+on+cortactin+to+control+invadopodia+biogenesis+and+extracellular+matrix+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation.</a> J. Cell Sci. , (2008).</li>
<li>Ammer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+impairs+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+invasion+by+disrupting+invadopodia+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function.</a> J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Seals, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Tks5%2FFish+is+required+for+podosome+formation+and+function%2C+and+for+the+protease-driven+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells.</a> Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+invadopodium+formation%3A+the+role+of+the+N-WASP-Arp2%2F3+complex+pathway+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin.</a> J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).</li>
<li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li>
<li>Oser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+regulates+cofilin+and+N-WASp+activities+to+control+the+stages+of+invadopodium+assembly+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.</a> J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Src+requires+a+wild-type+counterpart+to+regulate+invadopodia+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation.</a> J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+is+not+present+in+the+focal+adhesions+formed+between+normal+cultured+fibroblasts+and+their+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).</li>
<li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transformation-associated+protease%28s%29+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li>
<li>Bharti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src-dependent+phosphorylation+of+ASAP1+regulates+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes.</a> Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).</li>
<li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li>
<li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
<li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li>
<li>Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+unique+methods+for+measurement+of+extracellular+matrix+degradation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro.</a> Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).</li>
<li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li>
<li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubules%2C+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li>
<li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De mogelijkheid om cellen verslechtering van de extracellulaire matrix te visualiseren heeft bijgedragen tot het ontdekken van de moleculaire mechanismen die werkzaam zijn in de vroege stappen van celinvasie. Ontwikkeld door Wen-Tien Chen in de vroege jaren 1980 4,14,15, heeft coating fluorescent gelabelde extracellulaire eiwitten op dekglaasjes voor daaropvolgende microscopische analyse bleek de primaire techniek evaluatie invadopodia functie in een breed bereik aan celtypen. Het voorgeschreven toont de basi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Instrument </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td> Varkens huid </td></tr><tr><td> sucrose </td><td> Visser </td><td> BP220 </td><td></td></tr><tr><td> 12 mm dekglaasjes </td><td> Visser </td><td> 50-121-5159 </td><td></td></tr><tr><td> Platen met 24 putjes </td><td> Visser </td><td> 08-772-1 </td><td> BD Falcon </td></tr><tr><td> salpeterzuur </td><td> Ricca </td><td> R5326000 </td><td> 20% oplossing </td></tr><tr><td> poly-L-lysine </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 19320-B </td><td> 0,1% oplossing </td></tr><tr><td> glutaaraldehyde </td><td> Sigma </td><td> G7526 </td><td> 8% oplossing </td></tr><tr><td&gt; Oregon Green 488-geconjugeerd gelatine </td><td> Invitrogen </td><td> G-13186 </td><td></td></tr><tr><td> natriumboorhydride </td><td> Sigma </td><td> 213462 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Visser </td><td> BP151 </td><td></td></tr><tr><td> rhodamine-phalloidin </td><td> Invitrogen </td><td> R415 </td><td></td></tr><tr><td> anti-cortactine (kloon 4F11) </td><td> Millipore </td><td> 05 tot 180 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-FLAG antilichaam </td><td> Millipore </td><td> MAB3118 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 geit anti-muis IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A21235 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 confocale microscoop </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> Publiek domein </td><td></td><td> <a href="http://www.macbiophotonics.ca/imagej/" target="_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</a> </td></tr><tr><td> AutoQuant X2.2 software </td><td> Media Cybernetica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements-software </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve meting van invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in single en meercellige contexten

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellulaire invasie in de lokale weefsels is een proces van belang in de ontwikkeling en homeostase. Malregulated invasie en daaropvolgende cel beweging is kenmerkend meerdere pathologische processen, waaronder ontsteking, cardiovasculaire ziekte en tumorcel metastase 1. Gefocaliseerd proteolytische afbraak van extracellulaire matrix (ECM) in de epitheliale of endotheliale basaalmembraan is een kritische stap in de inleiding cellulaire invasie. In tumorcellen is uitgebreid in vitro analyse vastgesteld dat ECM afbraak wordt bereikt door ventrale actine-rijke membraan protrusive structuren genoemd invadopodia 2,3. Invadopodia vorm in nauwe appositie de ECM, waar ECM afbraak matigen door de werking van matrix metalloproteinases (MMP&#39;s). Het vermogen van tumorcellen om invadopodia vormen correleert direct met de mogelijkheid om binnen te dringen in lokale stroma en geassocieerde vasculaire componenten 3. _content &quot;&gt; Visualisatie van invadopodia-gemedieerde ECM afbraak van cellen door fluorescentiemicroscopie met kleurstof gemerkte eiwitten matrix aangebracht op dekglaasjes heeft zich ontwikkeld tot de meest voorkomende techniek voor het evalueren van de mate van proteolyse en cellulaire matrix invasieve potentieel 4,5. Hier beschrijven we een versie van de standaard werkwijze voor het fluorescentie-gemerkte dekglaasjes met behulp van een commercieel verkrijgbare Oregon Green-488 gelatine conjugaat. Deze methode is eenvoudig geschaald snel worden grote aantallen beklede dekglaasjes. We tonen enkele van de gemeenschappelijke microscopische artefacten die vaak optreden tijdens deze procedure en hoe deze kan worden vermeden. Tenslotte we gestandaardiseerde methoden met behulp van gemakkelijk verkrijgbare computersoftware voor kwantificering van gemerkt gelatine matrix afbraak gemedieerd door individuele cellen en gehele celpopulaties kunnen beschrijven. beschreven procedures de mogelijkheid bieden om nauwkeurig en reproduceerbaar te controleren invadopodiaactiviteit, en kan ook dienen als een platform voor het evalueren van de werkzaamheid van modulerende eiwitexpressie of testen van anti-invasieve verbindingen op extracellulaire matrix afbraak in enkele en meercellige instellingen.

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Cellulaire invasie in lokale weefsels is een proces dat van groot belang is bij ontwikkeling en homeostase. Een ontregelde invasie en de daaropvolgende celbeweging is ...

Deze standaardtechniek produceert met fluorescentie gelabelde gelatine-gecoate dekglasjes die geschikt zijn voor kwantitatieve assays van matrixdegradatie door invadopodia. Nadat de dekglasjes zijn gecoat met fluorescentieel gelabelde gelatine, worden de cellen geplaatst en gekweekt voor matrixdegradatie. Fixeer vervolgens de cellen en kleur ze fluorescent voor markerproteïnen van invadopodia, neem de beelden op en kwantificeer de matrixdegradatie.Typische resultaten kunnen de verschillen in podia-gemedieerde matrixdegradatie kwantificeren tussen cellen met differentiële manipulatie van geselecteerde genen of behandeling met farmacologische middelen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de bereiding van met gelatine gecoate dekglasjes met een homogene fluorescentie moeilijk te realiseren is vanwege een ongelijkmatige coating van fluorescerende gelatine of onjuiste hantering van de met gelatine gecoate dekglasjes. De procedure wordt gedemonstreerd door research assistant professor Karen Martin, postdoctoral associate Mandy Ammer en promovendi Elise Walk, Karen Hayes en Steve Markwell.Om de ongelabelde 5% gelatin-sucrose-stamsoplossing te bereiden, combi

quantitative-measurement-invadopodia-mediated-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

This video describes the technique of utilizing a native matrix to study tumor cell invasion. The technique used in this assay provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix.

Tumor Cell Invasion Assay: A 3D In Vitro Native Matrix-based Method to Assess Epithelial-mesenchymal Cell Interactions

This video showcases quantitative time-lapse microscopy for evaluating extracellular matrix stiffness-dependent Listeria monocytogenes dissemination through endothelial cells. A softer hydrogel facilitates faster bacterial dissemination through endothelial cells compared to stiffer counterparts, highlighting the influence of matrix stiffness on bacterial dissemination.

Quantitative Time-Lapse Microscopy for Assessing Extracellular Matrix Stiffness-Dependent Bacterial Dissemination

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

Hier presenteren we een protocol continu kwantificeren celadhesie en de adhesie processen met hoge tijdsresolutie op niet-invasieve wijze door cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze benaderingen onthullen de dynamiek van cel adhesie / de-adhesieprocessen getriggerd door matrixmodificatie en hun temporele relatie tot adhesie-afhankelijke signalering evenementen.

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Dit protocol beschrijft hoe u een 2D gemengde matrix voorbereidt, bestaande uit gelatine en collageen I, en een 3D collageen I plug om lineaire invadosomen te bestuderen. Deze protocollen staan ​​voor de studie van lineaire invadosoomvorming, matrixdegradatieactiviteit en de invasiemogelijkheden van primaire cellen en kankercellijnen.

2D en 3D matrices om Lineaire Invadosome Formatie en Activiteit te bestuderen

Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.

Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Leer hoe je fluorescerend gelatine gecoate dekplaatjes maakt voor kwantitatieve analyse van invadopodia-gemedieerde matrixdegradatie. Deze methode omvat celkweek, fixatie en fluorescentiebeeldvorming.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Meer video's verkennen