Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Deze standaardtechniek produceert met fluorescentie gelabelde gelatine-gecoate dekglasjes die geschikt zijn voor kwantitatieve assays van matrixdegradatie door invadopodia. Nadat de dekglasjes zijn gecoat met fluorescentieel gelabelde gelatine, worden de cellen geplaatst en gekweekt voor matrixdegradatie. Fixeer vervolgens de cellen en kleur ze fluorescent voor markerproteïnen van invadopodia, neem de beelden op en kwantificeer de matrixdegradatie.

Typische resultaten kunnen de verschillen in podia-gemedieerde matrixdegradatie kwantificeren tussen cellen met differentiële manipulatie van geselecteerde genen of behandeling met farmacologische middelen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de bereiding van met gelatine gecoate dekglasjes met een homogene fluorescentie moeilijk te realiseren is vanwege een ongelijkmatige coating van fluorescerende gelatine of onjuiste hantering van de met gelatine gecoate dekglasjes. De procedure wordt gedemonstreerd door research assistant professor Karen Martin, postdoctoral associate Mandy Ammer en promovendi Elise Walk, Karen Hayes en Steve Markwell.

Om de ongelabelde 5% gelatin-sucrose-stamsoplossing te bereiden, combineert u de gelatine en sucrose in PBS en laat u dit volledig oplossen bij 37 °C. Bewaar de oplossing vervolgens bij 4 °C. Ga verder met het reinigen van de glazen dekglasjes.

Plaats in elke put van een plastic weefselkweekplaat met 24 putjes een individueel dekglas, voeg aan elke put 500 µL 20% salpeterzuur toe en incubeer gedurende 30 minuten. Was de dekglazen na verwijdering van de salpeterzuuroplossing drie keer met gedeïoniseerd water. Breng vervolgens de coating aan.

Breng op elk dekglas 500 µL van 50 µg/mL poly-L-lysine aan en incubeer dit gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de polylysine-oplossing en was drie keer met PBS. Coating met poly-L-lysine vergemakkelijkt een gelijkmatige coating en binding van de bovenliggende gelabelde gelatine. Plaats 24-wells platen op ijs en voeg aan elke well 500 µL vers bereide 0,5% glutaaraldehyde toe.

Incubeer de platen 15 minuten op ijs. Voer drie wasbeurten uit met koud PBS en aspireer vervolgens alle resten PBS voordat de gelatinecoating wordt aangebracht. Reconstitueer ondertussen, tijdens de incubatie met glutaraldehyde, de Oregon Green 4 88-geconjugeerde gelatine.

Verwarm het monster en de ongelabelde 5% gelatine-sucrose-stamoplossing tot 37 °C, conform het protocol van de fabrikant. Verdun vervolgens 500 µL gelabelde gelatine in vier mL ongelabelde gelatine-sucrose. Pipetteer 100 µL van het verdunde 4 88 gelatinemengsel op elk dekglas.

Gebruik voldoende gelatine om het dekglas te coaten zonder handmatig te verspreiden. Het is belangrijk om het verdunde 4 88 gelatinemengsel tijdens de coatingprocedure op 37 °C te houden om voortijdige stolling te voorkomen. Houd daarnaast de dekglazen vanaf deze stap zoveel mogelijk in het donker om mogelijk fotobleken te vermijden.

Zodra alle dekglasjes in één plaat zijn gecoat, houdt u de plaat onder een hoek en verwijdert u het overtollige gelatine uit elke put door middel van vacuümaspiratie. Incubeer de gecoate dekglasjes vervolgens 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Was de dekglasjes drie keer met PBS en voeg daarna 500 µL natriumboorhydride toe.

Hydride is bruisend en er zullen kleine belletjes zichtbaar zijn op en rond elk dekglas; incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur om resterend glutaraldehyde te reduceren en te inactiveren. Verwijder de natriumborohydride-oplossing via vacuümaspiratie met een snelle veegbeweging rond de buitenkant van elke well. Let erop dat er geen zwevende dekglazen worden meegezogen die tijdens de behandeling met natriumborohydride los zijn geraakt van de bodem van de weefkweekplaat. Na drie wasbeurten met PBS worden de dekglazen 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in 70% ethanol.

Breng met steriele techniek het dekglas met de plaatjes over naar een type II B-celkweek laminaire flowkast en spoel de dekglazen drie keer met steriele PBS met behulp van een steriele naald en een pincet. Verplaats de dekglazen voorzichtig naar een lege put van een nieuwe 24-wells plaat en laat de dekglazen equilibreren met het kweekmedium voor het specifieke celtype dat wordt gebruikt.

Zaai de cellen nu, na een passende incubatietijd, direct op de dekglasjes. Verwerk de monsters voor immunofluorescentie-imaging om de monsters te monteren. Plaats een druppel prolonged gold anti-fade of een vergelijkbaar reagens op een objectglas en positioneer het omgekeerde dekglas voorzichtig; neem vervolgens beelden op voor analyse.

Deze analyse biedt het genormaliseerde gebied van matrixdegradatie ten opzichte van het gebied van de cellen of het aantal cellen. Het is nuttig voor het analyseren van volledige microscopische gezichtsvelden waarin meerdere cellen aanwezig zijn die collectief zijn behandeld met irna-groeifactoren of therapeutische middelen. Voor deze analyse worden afbeeldingen verzameld bij een lagere vergroting, die voldoende is om efficiënt informatie over celpopulaties te verzamelen.

Open de afbeelding in ImageJ. Controleer de schaalinformatie en selecteer de meetinstellingen. Kies de opties voor oppervlakte en drempelwaardebeperking. Bereken de degradatieoppervlakte met behulp van de fluorescerende gelatine-afbeelding; corrigeer voor ongelijkmatige belichting over de gelatine door de achtergronddrempelwaarde af te trekken en de afbeelding te gebruiken om de bovenste en onderste pixelintensiteitswaarden in te stellen.

In de volgende afbeeldingen. Gebruik de set-knop in het drempelwaardevenster om voor alle afbeeldingen dezelfde drempelwaarde in te stellen als objectieve methode om het degradatiegebied te selecteren. Gebruik de functie 'analyze particles' om de drempelwaarde in gebieden met matrixdegradatie te meten.

Kies een partikelgrootte groter dan nul om ruis uit de selectie te verwijderen. Toon de contouren om de regio's van belang te identificeren. Vink vervolgens 'resultaten weergeven' en 'samenvatten' aan om de metingen te tonen als de tekening alle degradatiegebieden specifiek heeft omlijnd.

Kopieer de meting van het totale oppervlak naar een spreadsheet; als er andere objecten zijn geselecteerd, zoals debris, registreer dan alleen de oppervlakten van de relevante regio's van belang. Open vervolgens om de celoppervlakte te berekenen het foid en de drempelwaarde van de gekleurde afbeelding om de bovenste en onderste pixelintensiteitswaarden in te stellen, zodat de randen van de cellen in opeenvolgende afbeeldingen worden geselecteerd. Gebruik de set-knop in het drempelwaardevenster om dezelfde drempelwaarde voor alle afbeeldingen in te stellen.

Als objectieve methode om het celoppervlak te selecteren. Gebruik de functie 'analyze particles' om de drempelwaarde van het oppervlak van de cellen te meten. Kies een partikelgrootte groter dan nul om ruis uit de selectie te verwijderen.

Toon contouren om regio's voor analyse te identificeren, controleer de weergave van de resultaten en vat deze samen om oppervlaktemetingen te tonen. Niet aanvinken. Neem gaten mee als er ruimtes zijn tussen cellen en een cluster.

Maak nu een keuze. Kopieer de oppervlakteresultaten voor de relevante regio's van interesse naar een spreadsheet en bereken het oppervlak van de gelatinedegradatie per totaal oppervlak van de cellen. Een alternatieve benadering is om het degradatieoppervlak te normaliseren naar het aantal cellen, bepaald door het tellen van de met DAPI gekleurde kernen.

Dit is belangrijk indien manipulaties het gemiddelde celoppervlak wijzigen. Gebruik voor deze aanpak de nucleus counter-plugin om kernen automatisch te tellen. Pas de opties aan om deze te optimaliseren voor uw beelden. Als kernen elkaar grotendeels overlappen, biedt automatisch tellen in dit geval mogelijk geen nauwkeurige enumeratie.

Handmatig tellen kan worden vergemakkelijkt door gebruik te maken van de cellenteller-plugin wanneer dit correct wordt uitgevoerd. Dekglasjes worden gelijkmatig gecoat met Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine. Tijdens het coaten en verwerken van met gelatine gecoate dekglasjes kunnen verschillende artefacten optreden.

Bijvoorbeeld, een ongelijkmatige coating is het resultaat van een onjuiste bedekking van het dekglas tijdens het coatingproces als gevolg van slechte menging, handmatig verspreiden of gedeeltelijke stolling van het gelatinemengsel. Krassen duiden op de verwijdering van de gecoate matrix door bekrassen met naalden of pincetten tijdens de hantering. Uitdroging van het oppervlak van het dekglas tijdens langdurige bewaarperiodes kan leiden tot een kasseienachtig uiterlijk. Dit gebied weerspiegelt fotobleken van het fluorescerende gelatineoppervlak tijdens de beeldvorming door langdurige of hoogintensieve lichtblootstelling.

Let op hoe een goed geprepareerd dekglas een homogene fluorescentie vertoont wanneer dit via microscopie wordt gevisualiseerd. De resulterende dunne matrices die tijdens deze procedure worden geproduceerd, bieden een gevoelige methode om het vermogen van cellen om ECM af te breken te evalueren. Bijvoorbeeld.

Deze afbeeldingen leggen de degradatieactiviteit van de geïnvadeerde podiummatrix vast van een OSC 19 hoofd-halskankercel. Hier werden cellen geplaatst op een dekglas met Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine en in beeld gebracht via fluorescentiemicroscopie, weergegeven in zowel 2D- als 3D-afbeeldingen. Deze OSC 19-cellen, geplaatst op dekglazen met Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine, werden gelabeld met R-domine-geconjugeerd Phin en anti-cortactine-antilichamen, gevisualiseerd met een ANOR 647-secundair antilichaam en pseudogekleurd groen geïnvadeerd.

Podia zijn duidelijk zichtbaar in de samengevoegde afbeelding als focale cytoplasmatische concentraties van F actin en cortan die overlappen met gebieden van gelatin clearing volume fill. De visualisatie toont hoe de binnendringende podia penetreren in het ECMA sub volume; dit is gemaakt om een rand binnen de cel te tonen waar inve podia aanwezig zijn. Het dorsale randzicht demonstreert de inve podia die zijn ingevoegd in de onderliggende gelatine.

Het ventrale randzicht toont uitstulpingen in de Veda-podia en gebieden van gelatinedegradatie onder het dekglas, waarbij rode regio's de groene matrix presenteren. Deze afbeeldingen tonen enkele van de belangrijke stappen voor de kwantificering van genormaliseerde cellen die de gelatinematrix degraderen binnen een volledige microscopische afbeelding. Alle fluorescentiebeelden zijn omgezet naar grijstinten om de rode drempelwaarde-instellingen en de markeringen van het interessegebied beter weer te geven.

Deze afbeelding van met Oregon Green 488 geconjugeerde gelatine toont de donkere gebieden waar degradatie is opgetreden. Na drempelwaarde-instelling (thresholding) van de gelatine-afbeelding worden de gebieden van degradatie geaccentueerd, waarvan geselecteerde regio's van belang worden gemeten om de oppervlakte van de degradatie te bepalen. Deze afbeelding toont rumine, foid en kleuring van f actine zoals verwacht.

De drempelwaarde bij het actin-beeld markeert het totale celoppervlak waarvan de te meten celgebieden worden geselecteerd. Op dezelfde wijze kan de techniek worden toegepast op beelden van met DAPI gekleurde celkernen. Dit paneel toont geselecteerde stappen die betrokken zijn bij het kwantificeren van fluorescente gelatinemodificatie door individuele cellen binnen een gemengde celpopulatie.

Deze eenvoudige kwantificering is van een enkele getransfecteerde OSC 19-cel die recombinant cort actine tot overexpressie brengt, gefuseerd aan de flag-epitope-tag. Let op hoe de matrixdegradatie door getransfecteerde cellen ook kan worden geanalyseerd binnen een gemengde populatie van getransfecteerde en niet-getransfecteerde cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met een aantal zaken.

Zorg er allereerst voor dat uw fluorescente celmarkers niet overlappen met de kleur van de fluorescente gelatine. Bij het verzamelen van beelden is het belangrijk om velden te kiezen op basis van de aanwezigheid van cellen. Zoek niet bij voorkeur naar gebieden met degradatie, aangezien dit de data kan beïnvloeden vanwege variabiliteit tussen cellijnen en reacties op diverse therapeutische middelen.

Factoren zoals de degradatietijd van het aantal zitplaatsen en de eiwitselectie voor immunofluorescente labeling moeten worden geoptimaliseerd voor uw specifieke experiment. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dekglasplaatjes genereert die gelijkmatig zijn gecoat met fluorescerende gelatine uit beta-podia-gemedieerde degradatie-assays, evenals methoden voor de kwantificering van matrixdegradatie.