Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

Het algemene doel van deze procedure is om een topologie van celhechting op een substraat te meten met nanometerprecisie. Dit wordt bereikt door eerst cellen te kweken op transparante glazen platen en ze vervolgens in te kweken met een fluorescerende marker. Vervolgens wordt de hoekpositie van de verstelbare spiegel van de microscoop gekalibreerd en wordt de positie opgeslagen in het spiegelpositioneringsprogramma.

De volgende stap is om de fluorescentiebeelden op te nemen bij bestraling onder ongeveer 10 verschillende hoeken. De laatste stap is om celsubstraatafstanden te berekenen met een precisie van enkele nanometers. Uiteindelijk worden de resultaten van de topologie van celhechting op substraat gebruikt om verschillen in hechting tussen verschillende cellijnen te tonen, bijvoorbeeld kankercellen en minder kwaadaardige cellen.

Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals confocale microscopie is dat de werkelijke resolutie in de orde van slechts enkele nanometers ligt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in celmembranen. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals kleine blaasjes of nanomaterialen.

De demonstratie van het experiment zal worden uitgevoerd door onze postdoc Petra, die de celmonsters zal voorbereiden, en onze ingenieur, Michael Wagner, die het experiment zal uitvoeren. Om cellen voor variabele hoek, totale interne reflectie voor te bereiden. Fluorescerende microscopie zaai afzonderlijke cellen met een dichtheid van 100 cellen per vierkante millimeter op een glazen plaat in kweekmedium aangevuld met 10% foetaal rund, serum en antibiotica. Laat de cellen 72 uur groeien in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Breng vervolgens op de cellen de fluorescerende membraanmarker aan, zes D, decano twee, dimethylaminonaftaleen of lorane in een concentratie van acht micromolair in het kweekmedium. Incubeer gedurende 60 minuten voorafgaand aan fluorescentiemicroscopie. Was de cellen met PBS en pipetteer de bufferoplossing over de objectslide om het medium te verwijderen, veeg de bufferoplossing van de achterkant van de objectslide. Een rechtopstaande microscoop zoals een Zeiss Axio plan, uitgerust met een achterverlichte en/of exon E-M-C-C-D camera wordt gebruikt voor variabele hoek.

T-I-R-F-M vervangt zijn condensor door een op maat gemaakt verlichtingsapparaat met een halfcilindrisch glazen prisma optisch gekoppeld aan de objectslide. De laserstraal komt binnen vanuit een gecollimeerde monomodevezel, die na beeldvorming door het glazen prisma en verdere optische componenten, weer resulteert in een parallelle straal op het oppervlak van het monster. Zorg ervoor dat de elektrische veldvector gepolariseerd is, loodrecht op het invalsvlak.

Deze positie is gemarkeerd op de uitkoppeler van de vezel. Gebruik een verstelbare spiegel die zich binnenin de condensor bevindt, die wordt afgebeeld in het monstervlak en het monster onder een variabele invalshoek of objectstraal belicht. De verstelbare spiegel kan worden aangedreven door een stapmotor die wordt bestuurd door software.

Elke positie komt overeen met een welgedefinieerde invalshoek, zoals bepaald door go metrische voorafgaande metingen. Om de hoekpositie van de verstelbare spiegel te kalibreren, gebruik een fluorescerende kleurstof zoals één millimolair flavine nucleotide, opgelost in water. Om de kritische hoek bij variatie van de invalshoek te visualiseren, gebruik de kritische hoek van 61,3 graden voor een glas-waterovergang als vaste waarde, de hoekpositie van de spiegel waarbij de invalshoek gelijk is aan de kritische hoek, wordt opgeslagen in het spiegelpositioneringsprogramma.

Gebruik de camerasoftware om de parameters van de E-M-C-C-D camera in te stellen, inclusief temperatuurgewin, opnametijd en snelheid van verschuiving. Gebruik immersieolie om optische contact van het monster te garanderen. Selecteer met een glazen prisma een objectieflens met een geschikte vergroting voor de cellen en een matige numerieke opening.

Gebruik voor het visualiseren van het object in de microscoop een geschikte lang doorlaat- of banddoorlaatfilter voor fluorescentiedetectie. Neem fluorescentiebeelden op van identieke monsters bij variatie van de belichtingshoek. De invalshoek moet hetzelfde zijn of groter dan de kritische hoek.

Met de kritische hoek die overeenkomt met 64,5 graden voor een celglas-interface, wordt een hoekbereik van 66 graden tot 74 graden met stappen van 0,5 graden of één graad aanbevolen. Om de gegevensanalyse te starten, gebruik het lab view-programma om de op verschillende hoeken opgenomen beelden te lezen, evenals de camera-instellingen, de excitatiegolflengte en de brekingsindex. Voor glas, dat 1,52 is, en cellen, dat 1,37 is, worden de instellingen geïmporteerd voor een correcte evaluatie van de gegevens.

Voor elke set parameters worden de penetratiediepte en de transmissiefactor automatisch berekend. Voor het succes van de procedure is het belangrijk dat beelden zorgvuldig worden opgenomen en geselecteerd voor analyse. Selecteer beelden die worden gebruikt voor de evaluatie van celsubstraatafstanden volgens de vergelijking.

Voor een membraanmarker kunnen individuele beelden binnen homogene verlichting, zoals getoond in dit voorbeeld, worden uitgesloten. Bereken beelden van celsubstraattopologie en selecteer een geschikte kleurencode voor weergave tijdens de evaluatie. Profielen van individuele pixels kunnen worden weergegeven zoals afgebeeld in deze figuur.

Deze profielen kunnen worden gebruikt als indicator voor de kwaliteit van de pasvorm. Ten slotte slaat u het evaluatieprotocol op. Deze figuur toont totale interne reflectiebeelden van U2 51 mg glioblastoomcellen met een geactiveerd TP 53-tumorsuppressorgen.

Na incubatie met luan opgenomen onder verschillende invalshoek, 66 graden overeenkomend met een penetratiediepte van het evanescente elektromagnetische veld van ongeveer 140 nanometer, 69 graden, overeenkomend met een penetratiediepte van 75 nanometer en 73 graden overeenkomend met een penetratiediepte van 60 nanometer met afnemende penetratie. Diepte neemt de fluorescentie in intensiteit af en komt uit meer oppervlakkige sites van de cellen, zoals focale contacten op hun randen. Celsubstraatafstanden worden weergegeven in paneel D door een kleurencode variërend van nul tot 600 nanometer zoals hier te zien is.

Celsubstraatafstanden variëren sterk