Name: Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer nanotopologie van celadhesie meten op substraat met nanometerprecisie via VA-TIRFM-microscopie. Deze methode onthult verschillen in adhesie tussen kankercellen en minder maligne cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de deelstaat Baden-Württemberg en de Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung - voor de financiering van ZAFH-foton n, het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) voor de financiering van onderzoek subsidie ​​niet. 1792C08 evenals de deelstaat Baden-Württemberg-Stiftung GmbH voor de financiering van het project &quot;Aurami&quot;.

1. Zaaien en incubatie van cellen <ol><li> Seed individuele cellen, bijvoorbeeld U373-MG of U-251 MG-glioblastoma cellen bij een typische dichtheid van 100 cellen / mm 2 op een glasplaatje en ze 4872 uur in kweekmedium groeien (bijv. RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en antibiotica) met een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Incuberen met een membraan marker, bijv. 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan) toegepast gedurende 60 min in een concentratie van 8 urn (in kweekmedium) 4, of cytoplasma marker, bijvoorbeeld calceïne acetomethlyester aangevraagde 40 min bij een concentratie van 5 uM 3 of een membraan geassocieerde fotosensibilisator, bijv. protoporfyrine IX geïnduceerd na 4 uur incubatie met de precursor 5-aminolevulinezuur (5-ALA, 1 mM) 4,5. </li><li> Spoel de cellen met kweekmedium of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor fluorescentiemicroscopie. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Gebruik rechtop microscoop, bijvoorbeeld Zeiss Axioplan en vervang de koeler via een belichtingsinrichting, zoals beschreven in Ref. 3 met een hemi-sferisch of hemi-cilindrische glazen prisma optisch gekoppeld met het objectglaasje (zie figuur 1). </li><li> Een parallelle gecollimeerde laserbundel die na beeldvorming door het prisma en verdere optische componenten (bijv. concave spiegel) weer resulteert in een evenwijdige bundel op het oppervlak van het monster (telecentrisch pupil ray). Zorg ervoor dat het elektrisch veld vector is gepolariseerd loodrecht op het invalsvlak. </li><li> Gebruik een verstelbare spiegel zich in de condensor die wordt afgebeeld in het monstervlak en verlicht het monster onder een variabele hoek van inval (object ray). De verstelbare spiegel kan worden aangedreven door een stappenmotor, waarbij elke positie overeenkomt met een welbepaalde invalshoek, zoals bepaald door metingen goniometrische 3 </sup&gt;. </li><li> Kalibreer de hoekstand van de verstelbare spiegel met de kritische hoek Θ c = 61.3 ° voor een glas water overgang als een vaste waarde. Θ c kunnen worden gevisualiseerd bij variatie van Θ wanneer een fluorescerende kleurstof (bijv. 1 mM flavine mononucleotide, FMN) wordt opgelost in water. De positie van de spiegel met Θ = Θ c opgeslagen in de spiegel positionering programma. </li><li> Stel de parameters van de camera (belichting via de achterzijde Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, Verenigd Koninkrijk 6), met inbegrip van temperatuur, te verwerven, opnametijd en shift snelheid. </li><li> Gebruik een objectieflens van geschikte vergroting en bij voorkeur matige numerieke lensopening (bijvoorbeeld 40 × / 0,75 of 63 × / 0,90 onderdompeling in water) en lokaliseren van het object dia in de microscoop. Gebruik immersie olie optisch contact van het monster te verzekeren met de glazen prisma. Noteer fluorescentiebeelden identieke monsters bij variatie van debelichtingshoek (Θ ≥ Θ c met Θ c overeenkomt met 64,5 ° voor een cel-glas interface). Een hoekbereik van 66 ° -74 ° met stappen van 0,5 ° of 1 ° wordt aanbevolen. Gebruik een geschikte lange pass of band pass filter voor fluorescentie detectie. </li></ol> 3. Data-analyse <ol><li> Leest de afbeeldingen (bijvoorbeeld in ASCII-formaat) onder verschillende hoeken Θ, en de camera-instellingen (voor achtergrond discriminatie), de excitatiegolflengte en de brekingsindices voor glas (n 1 = 1,52) en cellen (n2 = 1,37) in het evaluatieprogramma (LabView, NANOCELL). Voor elke set parameters de indringdiepte d (Θ) en de transmissiefactor T (Θ) worden automatisch berekend. </li><li> Selecteer afbeeldingen gebruikt voor de evaluatie van cel-substraat afstanden Δ volgens vergelijking 5 (membraan merker) of vergelijking 4 (cytoplasma marker), afzonderlijke beelden met inhomogeneverlichting (onthullend e, g. strepen) worden uitgesloten. </li><li> Bereken beelden van cel-substraat topologie en kies een passende kleurcode voor weergave. Tijdens de beoordeling profielen van individuele pixels kan worden weergegeven zoals in figuur 2. Deze profielen kunnen gebruikt worden als indicator voor de kwaliteit van de fit. </li><li> Sla de evaluatie protocol. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Representatieve experimenten worden uitgevoerd met genetisch gemanipuleerde U251-MG glioblastoma cellen werd geleverd door prof. dr. Jan Mollenhauer, Vakgroep Moleculaire Oncologie, Universiteit van Zuid-Denemarken, Odense. In twee subklonen van deze U251 cellen de tumor suppressor genen TP53 of PTEN worden tot overexpressie gebracht met een Tet-On induceerbaar expressiesysteem, zodanig dat deze cellen een verminderde tumorgeniciteit vertonen en worden beschouwd als minder kwaadaardig. Zeer kwaadaardige U251-MG cellen zonder suppressor gen als controles en U251-MG wild-type cellen dienen voor een verdere vergelijking. Een laser diode uitzenden van een quasi continue reeks van pulsen picoseconde (LDH400 met chauffeur PDL 800-B, Picoquant, Berlijn, Duitsland; golflengte: 391 nm; pulsenergie: 12 pJ; herhalingsfrequentie: 40 MHz) wordt gebruikt als een excitatiebron. In figuur 3 TIRFM beelden van U251-MG glioblastoma cellen met een geactiveerde TP53 tumor suppressor gen en geïncubeerd met laurdan (8 uM, 60 min) worden weergegeven voor invalshoeken van 66,0 °, 69,0 ° en 73,0 ° overeenkomt met penetratiediepten van de evanescent elektromagnetisch veld van ongeveer 140 nm, 75 nm en 60 nm respectievelijk. Met afnemende indringdiepte fluorescentie verminderd is (zie schalen) en afkomstig van meer oppervlakkige gebieden van de cellen (bijvoorbeeld focale contacten op hun randen). Cel-substraat afstanden (gevisualiseerd in figuur 3d door een kleurcode, variërend 0 tot 600 nm) sterk variëren over de cellen tussen de oply een paar nanometer (wit-geel) en 250 tot 300 nm (donker rood), dat wil zeggen focale contacten en grotere cel-substraat afstanden zijn in de directe omgeving. Hetzelfde geldt voor U251-MG glioblastoma cellen met een geactiveerde suppressor gen PTEN (figuur 4d), ​​terwijl cel-substraat afstanden tamelijk constant voor U251-MG en controle wild-type cellen met typische waarden van 80-100 nm (geel; figuur 4b ) en 150-200 nm (oranje-rood, figuur 4a). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Figuur 1. Verlichtingsinrichting voor VA-TIRFM in een rechtopstaande microscoop. Een verstelbare spiegel aangedreven door een stappenmotor maakt een hoekresolutie ± 0,25 °. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Figuur 2. Evaluatie profiel voor een pixel (schematisch). Als ln [I F / T (Θ)] is uitgezet als functie van 1 / d (Θ), de helling is de cel-substraat afstand Δ. Deze helling wordt gewoonlijk bepaald met een precisie van ± 10%. Een waarde - als gevolg van inhomogene verlichting - is gemarkeerd en uitgesloten van de evaluatie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Figuur 3 TIRFM beelden van U251-MG glioblastomacellen met geactiveerde TP53 suppressor gen na incubatie met laurdan (8 uM, 60 min). Opgenomen op verschillende lichtinvals (ac); cel-substraat afstanden in het gebied van 0-600 nm weergegeven door een kleurcode (d); excitatiegolflengte: 391 nm, detectie: ≥ 420 nm; beeldformaat:. 210 micrometer × 210 micrometer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . Figuur 4 Cell-substraat afstanden U251-MG glioblatoma cellen in het bereik van 0-600 nm aangegeven door een kleurcode,. (A) wild type (b) controles, (c) cellen met geactiveerde suppressor gen TP53, (d) cellen met geactiveerde suppressor gen PTEN; excitatiegolflengte: 391 nm, detectie: ≥ 420 nm; beeldformaat:. 210 micrometer × 210 micrometer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+reflection+microscopy%3A+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li>
<li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+%28I%29+Modelling+cell+contact+region+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li>
<li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%3A+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Opt.+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).</li>
<li>Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Pathol.+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li>
<li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device%3A+enhanced+sensitivity%2C+speed+and+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+with+continuous+wave+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li>
<li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li>
<li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitizers%3A+therapy+and+detection+of+malignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+microscopy%3A+technical+innovations+and+novel+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een methode wordt beschreven voor het meten van cel-substraat afstanden nanometer precisie. Op dit moment, de wijze van super-resolutie microscopie, bijvoorbeeld op basis van gestructureerde verlichting 7 of op single molecule detectie 8 tot 10 en stimulated emission depletion (STED) microscopie 11 zijn van groot belang. Geen van deze technieken maakt echter een axiale resolutie van minder dan 50 nm. Bovendien vrij hoge bestraling van 50100 W / cm 2 nodig voor enkel m...

Wanneer een lichtbundel voortplant door een medium brekingsindex n1 een interface aan een tweede medium brekingsindex n2 &lt;n 1, totale interne reflectie optreedt bij alle invalshoeken Θ, die groter zijn dan de kritische hoek Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Ondanks dat volledig gereflecteerd de invallende lichtbundel roept een verdwijnende elektromagnetisch veld dat in het tweede medium en vervalt exponentieel met loodrechte afstand z van het grensvlak dringt volgens I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) overeenkomt met de intensiteit van het elektromagnetische veld en d (Θ) de penetratiediepte bij golflengte λ, zoals gegeven door d (Θ) = (λ/4π) (1 2 n sin 2 Θ - 2 2 n) -1 / 2 Zoals gemeld in de literatuur 1,2, I 0 </sub&gt; overeenkomt met de intensiteit van invallend licht I e vermenigvuldigd met de transmissiefactor T (Θ) en de verhouding n 2 / n 1. Indien het elektrisch veld vector van deze lichtbundel gepolariseerd loodrecht op het vlak van inval (de vlak opgespannen door de invallende en de gereflecteerde bundel) bevindt het transmissiecoëfficiënt van de T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / nL 1) 2] Voor de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit in TIRFM metingen lichtabsorptie te worden geïntegreerd over alle lagen van het monster en vermenigvuldigd met de fluorescentie quantum opbrengst η van de desbetreffende kleurstof als de ruimtehoek van detectie Ω. Zoals eerder 3, kan deze intensiteit worden beschreven Ik F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz als alle factoren die onafhankelijk zijn f<html> rom de invalshoek Θ en z de coördinaat vallen binnen de experimentele constant A. Vergelijking 3 kan analytisch opgelost als de concentratie c (z) van fluoroforen wordt beschouwd als bijna constant - Op alle coördinaten z ≥ Δ, bijvoorbeeld in het cytoplasma van cellen met een afstand Δ van de interface. In dit geval integraal moet worden berekend z = Δ z = ∞ tot gevolg Ik F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Tussen z = Δ - t / 2 en z = Δ + T / 2, dat wil zeggen in een dunne laag van dikte t, bijvoorbeeld een celmembraan op een afstand Δ van de interface. In dit geval kan de fluorescentie intensiteit berekend als Ik F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), Als t klein in vergelijking met Δ. ent &quot;&gt; Uit de vergelijkingen (4) en (5) cel-substraat afstanden Δ kan worden berekend als de beelden van fluorescentie intensiteit I F opgenomen voor variabele hoeken Θ en als ln (I F / T d) (Vgl. 4) of ln (I F / T) (Vgl. 5) wordt bepaald als functie van 1 / d voor deze hoeken. Voor de membraan marker laurdan die in dit document (s. hieronder) evaluatie werd uitgevoerd volgens Vgl. 5. Zoals eerder gerapporteerd 3, beeldacquisitie en evaluatie vereist - Een homogene verdeling van excitatie licht op het monster, - Geldigheid van een 2-laags model (de brekingsindices n 1 en n 2 voor het substraat en het cytoplasma, respectievelijk). Dit geldt als de plasmamembraan is zeer dun, en indien de laag van het extracellulaire medium (tussen de cel en het substraat) klein is vergeleken met de golflengte van invallend licht. Bovendien een matige numerieke apertuur(Meestal A ≤ 0,90) van de microscoop objectieflens voordeel zijn wanneer afwijkingen van helderheid door anisotropie van straling in het nabije veld van de diëlektrische interface.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Type </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Broedmachine </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminaire stroming </td><td> Holten Safe </td><td> S2010 1,2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% penicilline / streptomycine </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Kweekmedium </td></tr><tr><td> Glazen voorwerp dia&#39;s </td><td> Marienfeld </td><td> Zuiver wit glas </td><td> Speciale gebruikt reinigingsprocedure </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Fluorescente merker (voorraadoplossing: 2 mM in ethanol) </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Laserdiode </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 met chauffeur PDL 800-B </td><td> Golflengte: 391 nm </td></tr><tr><td> Single mode fiber-systeem </td><td> Point Source </td><td> kineFlex </td><td> Gebruikt met optieksysteem </td></tr><tr><td> EMCCD camera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Terug verlicht camera </td></tr></tbody></table>

nanotopology van celadhesie op variabele-angle total internal reflection fluorescentie microscopie (va-tirfm)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Oppervlakte topologie, bijv. cellen die groeien op een substraat, wordt bepaald met nanometer precisie door Variable Angle-Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM). Cellen worden gekweekt op objectglaasjes transparante en geïncubeerd met een fluorescente merker homogeen verdeeld in de plasmamembraan. Verlichting vindt plaats door een parallelle laserbundel onder variabele hoek van totale interne reflectie (TIR) ​​met verschillende penetratiediepten van het evanescente elektromagnetische veld. Opnemen van fluorescentiebeelden bij bestraling ongeveer 10 verschillende hoeken toestaat cel-substraat afstanden te berekenen met een nauwkeurigheid van enkele nanometers. Verschillen van hechting tussen verschillende cellijnen, bijv. kankercellen en minder kwaadaardige cellen zijn dus bepaald. Bovendien kunnen mogelijke veranderingen van celadhesie op chemische of fotodynamische behandeling onderzocht. In vergelijking met andere methoden van super-resolutie microscopie belichting wordt gehoudenzeer klein, en geen beschadiging van levende cellen wordt verwacht.

Topologie van celhechting op een substraat wordt gemeten met nanometer precisie door variabele hoek totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM).

Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

De oppervlaktetopologie, bijvoorbeeld van cellen die op een substraat groeien, wordt met nanometerprecisie bepaald met Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Het algemene doel van deze procedure is om de topologie van celadhesie op een substraat met nanometerprecisie te meten. Dit wordt bereikt door eerst cellen op transparante glazen objectglazen te kweken en deze te incuberen met een fluorescente marker. Vervolgens wordt de hoekpositie van de verstelbare spiegel van de microscoop gekalibreerd en wordt deze positie opgeslagen in het spiegelpositioneringsprogramma.De volgende stap is het vastleggen van de fluorescentiebeelden na bestraling onder ongeveer 10 verschillende hoeken. De laatste stap is het berekenen van de cel-substraat afstanden met een precisie van enkele nanometers. Uiteindelijk worden de resultaten van de topologie van celadhesie op het substraat gebruikt om verschillen in adhesie tussen diverse cellijnen aan te tonen, bijvoorbeeld tussen kankercellen en minder maligne cellen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals confocale microscopie, is dat de werkelijke resolutie in de orde van slechts enkele nanometers ligt. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in celmembranen, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals kleine vesikels of nanomaterialen.De experimenten worden gedemonstreerd door onze postdoc Petra, die de celmonsters zal voorbereiden, en onze engineer Michael Wagner, die het experiment zal uitvoeren. Om cellen voor te bereiden voor fluorescentiemicroscopie met totale interne reflectie onder variabele hoek, worden individuele cellen gezaaid met een dichtheid van 100 cellen per vierkante millimeter op een glazen objectglas in kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en antibiotica. Kweek de cellen gedurende 72 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.Breng vervolgens het fluorescerende membraanmarker 6D, decano-2-dimethylaminonaftaleen, of Lorane aan op de cellen in een concentratie van 8 µM in het cultuurmedium en incubeer gedurende 60 minuten voorafgaand aan de fluorescentiemicroscopie. Was de cellen met PBS en pipetteer de buffersolutie over het objectglas om het medium te verwijderen; veeg daarna de buffersolutie van de achterzijde van het objectglas af. Een rechtopstaande microscoop, zoals een Zeiss Axio plan, uitgerust met een achtergrondverlichting en/of een exon E-M-C-C-D camera, wordt gebruikt voor variabele hoeken.Vervang bij TIRFM de condensor door een op maat gemaakt belichtingsapparaat met een hemicylindrisch glazen prisma dat optisch gekoppeld is aan het objectglas. De laserstraal is incident vanuit een gecollimeerde single-mode vezel, die na beeldvorming door het glazen prisma en verdere optische componenten opnieuw resulteert in een parallelle bundel op het oppervlak van het monster. Zorg ervoor dat de elektrische veldvector gepolariseerd is, loodrecht op het invalsvlak.Deze positie is aangegeven op de outputkoppelaar van de vezel. Gebruik een verstelbare spiegel in de condensor, die wordt afgebeeld in het monsterplan en het monster verlicht onder een variabele invalshoek of objectstraal. De verstelbare spiegel kan worden aangedreven door een stappenmotor die via software wordt aangestuurd.Elke positie komt overeen met een nauwkeurig gedefinieerde invalshoek, zoals bepaald door metrische metingen. Om de hoekpositie van de verstelbare spiegel te kalibreren, wordt een fluorescerende kleurstof gebruikt, zoals 1 mM flavinnucleotide opgelost in water. Om de kritische hoek te visualiseren bij variatie van de invalshoek, wordt de kritische hoek van 61,3 graden voor een glas-waterovergang als vaste waarde gehanteerd; de hoekpositie van de spiegel waarbij de invalshoek gelijk is aan de kritische hoek wordt opgeslagen in het programma voor spiegelpositionering.Stel met de camera-software de parameters van de E-M-C-C-D camera in, waaronder de temperatuurversterking, de opnametijd en de verschuivingssnelheid. Gebruik immersie-olie om optisch contact met het monster te waarborgen. Selecteer met een glazen prisma een objectief met een geschikte vergroting voor de cellen en een gematigde numerieke apertuur.Om het object in de microscoop te visualiseren, dient een geschikt longpass- of bandpassfilter voor fluorescentiedetectie te worden gebruikt. Leg fluorescentiebeelden vast van identieke monsters bij variatie van de belichtingshoek. De invalshoeken moeten gelijk aan of groter zijn dan de kritieke hoek.Met een kritieke hoek van 64,5 graden voor de interface tussen de cel en het glas, wordt een hoekbereik van 66 graden tot 74 graden met stappen van 0,5 graad of één graad aanbevolen. Gebruik voor de start van de data-analyse het LabView-programma om de beelden die onder verschillende hoeken zijn opgenomen te lezen, evenals de camera-instellingen, de excitatiegolflengte en de brekingsindices. Voor glas, die 1,52 is, en cellen, die 1,37 is, worden de instellingen geïmporteerd voor een correcte evaluatie van de gegevens.Voor elke set parameters worden de penetratiediepte en de transmissiefactor automatisch berekend. Voor het slagen van de procedure is het belangrijk dat beelden zorgvuldig worden vastgelegd en geselecteerd voor analyse. Selecteer de beelden die worden gebruikt voor de evaluatie van cel-substraat-afstanden aan de hand van de vergelijking.Voor een membraanmarker kunnen individuele beelden met een homogene verlichting, zoals weergegeven in dit voorbeeld, worden uitgesloten. Bereken beelden van de cel-substraattopologie en selecteer een passende kleurcode voor weergave tijdens de evaluatie. Profielen van individuele pixels kunnen worden weergegeven zoals afgebeeld in deze figuur.Deze profielen kunnen worden gebruikt als indicator voor de kwaliteit van de fit. Sla tot slot het evaluatieprotocol op. Deze figuur toont total internal reflection-beelden van U2 51 mg glioblastoomcellen met een geactiveerd TP 53 tumorsuppressorgen.Na incubatie met luan, geregistreerd onder verschillende invalshoeken, waarbij 66 graden overeenkomt met een indringdiepte van het evanescente elektromagnetische veld van ongeveer 140 nanometer, 69 graden overeenkomt met een indringdiepte van 75 nanometer en 73 graden overeenkomt met een indringdiepte van 60 nanometer bij een afnemende indringdiepte, neemt de intensiteit van de fluorescentie af en is deze afkomstig van meer oppervlakkige plaatsen van de cellen, zoals focale contacten aan hun randen. De afstanden tussen de cel en het substraat zijn in Paneel D weergegeven met een kleurcode variërend van nul tot 600 nanometer, zoals hier te zien is.De afstanden tussen cel en substraat variëren sterk over de cellen, van slechts enkele nanometers (weergegeven van wit tot geel) tot 250 tot 300 nanometers (weergegeven in donkerrood). Dit geeft aan dat focale contacten en grotere cel-substraatafstanden zich in elkaars directe nabijheid bevinden. Een vergelijkbare variatie in cel-substraatafstanden is berekend voor U2 51 mg glioblastoomcellen met een geactiveerd tumorsuppressorgene P 10.In tegenstelling hiermee zijn de cel-substraatdistanties vrij constant voor U2 51 mg controlecellen, weergegeven in geel, en wildtype-cellen, weergegeven in oranje tot rood, na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van cel-substraattopologie om tumorcellen en de morfologische veranderingen na lasertherapie te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe oppervlakken kunnen worden gevisualiseerd met een werkelijke resolutie in het nanometerbereik bij een lage lichtblootstelling, wat goed verdraaglijk is voor levende organismen.

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

Source: Daniele, F., et. al TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging of human neuroblastoma cells using a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope to visualize fluorophore-tagged synaptic vesicles. The cells are first focused in epifluorescence mode. Adjustments are then made to achieve total internal reflection,...

Cell Imaging Using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

We beschrijven een beeldvormings aanpak voor de bepaling van de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor oligomeren geïnduceerd door ligand binding in het plasma membraan van levende cellen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N &amp; B) analyse.

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Leer nanotopologie van celadhesie meten op substraat met nanometerprecisie via VA-TIRFM-microscopie. Deze methode onthult verschillen in adhesie tussen kankercellen en minder maligne cellen.

Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

Meer video's verkennen