Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

Het algemene doel van deze procedure is om de topologie van celadhesie op een substraat met nanometerprecisie te meten. Dit wordt bereikt door eerst cellen op transparante glazen objectglazen te kweken en deze te incuberen met een fluorescente marker. Vervolgens wordt de hoekpositie van de verstelbare spiegel van de microscoop gekalibreerd en wordt deze positie opgeslagen in het spiegelpositioneringsprogramma.

De volgende stap is het vastleggen van de fluorescentiebeelden na bestraling onder ongeveer 10 verschillende hoeken. De laatste stap is het berekenen van de cel-substraat afstanden met een precisie van enkele nanometers. Uiteindelijk worden de resultaten van de topologie van celadhesie op het substraat gebruikt om verschillen in adhesie tussen diverse cellijnen aan te tonen, bijvoorbeeld tussen kankercellen en minder maligne cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals confocale microscopie, is dat de werkelijke resolutie in de orde van slechts enkele nanometers ligt. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in celmembranen, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals kleine vesikels of nanomaterialen.

De experimenten worden gedemonstreerd door onze postdoc Petra, die de celmonsters zal voorbereiden, en onze engineer Michael Wagner, die het experiment zal uitvoeren. Om cellen voor te bereiden voor fluorescentiemicroscopie met totale interne reflectie onder variabele hoek, worden individuele cellen gezaaid met een dichtheid van 100 cellen per vierkante millimeter op een glazen objectglas in kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en antibiotica. Kweek de cellen gedurende 72 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.

Breng vervolgens het fluorescerende membraanmarker 6D, decano-2-dimethylaminonaftaleen, of Lorane aan op de cellen in een concentratie van 8 µM in het cultuurmedium en incubeer gedurende 60 minuten voorafgaand aan de fluorescentiemicroscopie. Was de cellen met PBS en pipetteer de buffersolutie over het objectglas om het medium te verwijderen; veeg daarna de buffersolutie van de achterzijde van het objectglas af. Een rechtopstaande microscoop, zoals een Zeiss Axio plan, uitgerust met een achtergrondverlichting en/of een exon E-M-C-C-D camera, wordt gebruikt voor variabele hoeken.

Vervang bij TIRFM de condensor door een op maat gemaakt belichtingsapparaat met een hemicylindrisch glazen prisma dat optisch gekoppeld is aan het objectglas. De laserstraal is incident vanuit een gecollimeerde single-mode vezel, die na beeldvorming door het glazen prisma en verdere optische componenten opnieuw resulteert in een parallelle bundel op het oppervlak van het monster. Zorg ervoor dat de elektrische veldvector gepolariseerd is, loodrecht op het invalsvlak.

Deze positie is aangegeven op de outputkoppelaar van de vezel. Gebruik een verstelbare spiegel in de condensor, die wordt afgebeeld in het monsterplan en het monster verlicht onder een variabele invalshoek of objectstraal. De verstelbare spiegel kan worden aangedreven door een stappenmotor die via software wordt aangestuurd.

Elke positie komt overeen met een nauwkeurig gedefinieerde invalshoek, zoals bepaald door metrische metingen. Om de hoekpositie van de verstelbare spiegel te kalibreren, wordt een fluorescerende kleurstof gebruikt, zoals 1 mM flavinnucleotide opgelost in water. Om de kritische hoek te visualiseren bij variatie van de invalshoek, wordt de kritische hoek van 61,3 graden voor een glas-waterovergang als vaste waarde gehanteerd; de hoekpositie van de spiegel waarbij de invalshoek gelijk is aan de kritische hoek wordt opgeslagen in het programma voor spiegelpositionering.

Stel met de camera-software de parameters van de E-M-C-C-D camera in, waaronder de temperatuurversterking, de opnametijd en de verschuivingssnelheid. Gebruik immersie-olie om optisch contact met het monster te waarborgen. Selecteer met een glazen prisma een objectief met een geschikte vergroting voor de cellen en een gematigde numerieke apertuur.

Om het object in de microscoop te visualiseren, dient een geschikt longpass- of bandpassfilter voor fluorescentiedetectie te worden gebruikt. Leg fluorescentiebeelden vast van identieke monsters bij variatie van de belichtingshoek. De invalshoeken moeten gelijk aan of groter zijn dan de kritieke hoek.

Met een kritieke hoek van 64,5 graden voor de interface tussen de cel en het glas, wordt een hoekbereik van 66 graden tot 74 graden met stappen van 0,5 graad of één graad aanbevolen. Gebruik voor de start van de data-analyse het LabView-programma om de beelden die onder verschillende hoeken zijn opgenomen te lezen, evenals de camera-instellingen, de excitatiegolflengte en de brekingsindices. Voor glas, die 1,52 is, en cellen, die 1,37 is, worden de instellingen geïmporteerd voor een correcte evaluatie van de gegevens.

Voor elke set parameters worden de penetratiediepte en de transmissiefactor automatisch berekend. Voor het slagen van de procedure is het belangrijk dat beelden zorgvuldig worden vastgelegd en geselecteerd voor analyse. Selecteer de beelden die worden gebruikt voor de evaluatie van cel-substraat-afstanden aan de hand van de vergelijking.

Voor een membraanmarker kunnen individuele beelden met een homogene verlichting, zoals weergegeven in dit voorbeeld, worden uitgesloten. Bereken beelden van de cel-substraattopologie en selecteer een passende kleurcode voor weergave tijdens de evaluatie. Profielen van individuele pixels kunnen worden weergegeven zoals afgebeeld in deze figuur.

Deze profielen kunnen worden gebruikt als indicator voor de kwaliteit van de fit. Sla tot slot het evaluatieprotocol op. Deze figuur toont total internal reflection-beelden van U2 51 mg glioblastoomcellen met een geactiveerd TP 53 tumorsuppressorgen.

Na incubatie met luan, geregistreerd onder verschillende invalshoeken, waarbij 66 graden overeenkomt met een indringdiepte van het evanescente elektromagnetische veld van ongeveer 140 nanometer, 69 graden overeenkomt met een indringdiepte van 75 nanometer en 73 graden overeenkomt met een indringdiepte van 60 nanometer bij een afnemende indringdiepte, neemt de intensiteit van de fluorescentie af en is deze afkomstig van meer oppervlakkige plaatsen van de cellen, zoals focale contacten aan hun randen. De afstanden tussen de cel en het substraat zijn in Paneel D weergegeven met een kleurcode variërend van nul tot 600 nanometer, zoals hier te zien is.

De afstanden tussen cel en substraat variëren sterk over de cellen, van slechts enkele nanometers (weergegeven van wit tot geel) tot 250 tot 300 nanometers (weergegeven in donkerrood). Dit geeft aan dat focale contacten en grotere cel-substraatafstanden zich in elkaars directe nabijheid bevinden. Een vergelijkbare variatie in cel-substraatafstanden is berekend voor U2 51 mg glioblastoomcellen met een geactiveerd tumorsuppressorgene P 10.

In tegenstelling hiermee zijn de cel-substraatdistanties vrij constant voor U2 51 mg controlecellen, weergegeven in geel, en wildtype-cellen, weergegeven in oranje tot rood, na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van cel-substraattopologie om tumorcellen en de morfologische veranderingen na lasertherapie te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe oppervlakken kunnen worden gevisualiseerd met een werkelijke resolutie in het nanometerbereik bij een lage lichtblootstelling, wat goed verdraaglijk is voor levende organismen.