Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines
June 27th, 2012
Een protocol voor de voorbereiding van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten wordt beschreven. Dit protocol is waardevol voor testen die het gebruik van kleine populaties van cellen, zoals cellen behandeld met medicijnen of RNAi vereisen. De methode moet voor diverse genexpressie assays en andere celtypes, die onder andere cellen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om genexpressie te meten met behulp van functionele nucleaire machines die uit cellen zijn geëxtraheerd. Dit wordt bereikt door eerst de hela-cellen te oogsten door ze te laten zwellen. Vervolgens worden de cellen door een centrifuge gehaald om de kernen in de derde stap te pellen.
De kernen worden geëxtraheerd met zout, geconcentreerd en gedialyseerd om oplosbare en functionele genexpressie-machines te verkrijgen. Uiteindelijk kan de functionaliteit van de nucleaire extracten worden geëvalueerd op basis van hun transcriptie- en splitsingsactiviteiten, zoals beoordeeld met een gekoppelde RNA-polymerase naar transcriptie en splitsingssysteem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals bulk-nucle-extractvoorbereiding, is dat met deze techniek een kleine hoeveelheid cellen kan worden gebruikt om de nucleaire extract voor te bereiden.
Begin met het plateren van hela-cellen op drie 150 millimeter platen met DMEM-medium aangevuld met FBS en antibiotica. Laat de culturen groeien in een 37 graden Celsius-incubator met 5%CO2 totdat de cellen 90% confluency bereiken. Aspiseer op dit punt het medium van de HELOC-celculturen en was ze eenmaal met 13 milliliter kamertemperatuur PBS per plaat, en aspiseer vervolgens. Laat de PBS op elke plaat enkele seconden op zijn kant staan en aspiseer de rest van de PBS.
Gebruik vervolgens een cellifter om de cellen naar de onderkant van elke plaat te schrabben en trek de cellen vervolgens in een 1,5 milliliter einorbuis. Pel de cellen ten slotte vijf minuten in een microfuge bij honderd keer G en bij vier graden Celsius. Aspiseer nu het PBS van de cellenpellet en schat het gepakte celvolume of PCV door naar de graduatie op de buis te kijken.
Voeg vervolgens twee keer het volume hypotone buffer toe als het PCV aan de cellenpellet. Schud de buis voorzichtig om op te schorten. De cellen worden voorzichtig gepipetteerd met de cellensuspensie omhoog en omlaag met een 1000 microliter pipette om celclusters indien nodig los te maken.
Pel de cellen vervolgens onder dezelfde centrifugeomstandigheden als eerder. Na centrifugatie aspiseer voorzichtig de hypotone bufferlaag. De cellen zijn begonnen te zwellen en het celvolume is toegenomen tot ongeveer 750 tot 1000 microliters.
Voeg nieuwe hypotone buffer toe tot een eindvolume van 1,5 milliliter en suspendeer de cellen opnieuw in de buffer. Opnieuw. Eindelijk, incubeer de opgezette gezwollen cellen op ijs gedurende 10 minuten terwijl de cellen afkoelen. Spoel een downhomogenisator af met hypotone buffer en plaats deze vervolgens op ijs samen met de cellen.
Gebruik vervolgens een delicaat tastbare doek, zoals een Kim-doek, om de stamper droog te wrijven. Gebruik een 1000 microliter verlengde micropipettip om de buffer uit de downs te verwijderen. Gebruik nu de pipette om de gekoelde gezwollen cellen over te brengen naar de downs Down.
Is het lastigste deel van deze procedure om een succesvolle invoer te controleren. Controleer na elke downs onder de microscoop op lysis. Beweeg langzaam de strakke stamper van de downs vijf keer op en neer om de cellen te lyseeren, wees voorzichtig om bellen te vermijden. Draag vervolgens een vijf microliter Eloqua van de lyse celsuspensie over naar een einorbuis en voeg 10 microliters trianblauw en 15 microliters van een XPBS toe.
Voeg de celoplossing toe aan een dia en onderzoek de cellen onder een lichtmicroscoop voor lysis, de kernen van lyse cellen zullen blauw verschijnen na drie ounces. Er is niet genoeg lysis omdat er nog talrijke levende cellen zichtbaar zijn. Na vijf ounces is er genoeg lysis.
Breng tenslotte de lyse cellen over in de voorgekoelde einorbuis en pel de celsuspensie vijf minuten in een microfuge bij 1500 keer G en vier graden Celsius. Draag vervolgens voorzichtig de super natin over naar een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren. Schat nu het patch nucleair volume of PNV door naar de graduatie op de buis te kijken.
Vul een micropipettip met laag zout buffer op de helft van het PNV. Steek vervolgens de micropipettip in de kernen op de bodem van de einorbuis. Spuit langzaam de buffer in de kernen terwijl u voorzichtig mengt.
Klap voorzichtig de buis om te zorgen dat de pellet volledig opgeschort is. Voeg vervolgens hoog zout buffer toe op de helft van het PNV en meng snel één keer door de buis om te draaien. Draai de buis gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Eindelijk, pel de kernen in de microfuge gedurende 15 minuten bij 18.000 keer G en vier graden Celsius. Begin met het overbrengen van 500 microliters van het supernatant in gekoelde microcons. Pel de hoog-zout nucleaire extract gedurende 15 minuten bij 14.000 keer G en vier graden Celsius. Na centrifugatie, draai de mini racon om en plaats deze in een nieuwe individuele EOR-buis.
Na het twee minuten draaien bij 1000 keer G en vier graden Celsius, zal het hoog-zout nucleaire extract worden geconcentreerd tot ongeveer 115 microliters. Draag nu 45 microliter aliquots van het hoog-zout nucleaire extract over naar mini dialyse SLIs. Zorg ervoor dat de bodem van de dia's samenvallen met de bodem van de floater.
Plaats vervolgens de SLIs in 500 milliliter gekoelde dialysebuffer. Roer de aliquots tenslotte een tot twee uur bij vier graden Celsius, het nucleaire extract zal troebel lijken na dialyse. Deze figuur toont representatieve gegevens die een gekoppelde RNA-polymerase twee transcriptie en splitsingsreactie vergelijken in een kleinschalig nucleair extract versus een bulk nucleair extract.
Toen A-C-M-V-D-N-A-construct werd geïncubeerd in de bulk of kleinschalige extracten, werden vergelijkbare niveaus van de natiese pre-mRNA gesynthetiseerd bij de vijf minuten tijdstip na toevoeging van alfa en manin om verdere transcriptie te blokkeren, de splitsingsintermediates en splitsingsproducten accumuleerden met vergelijkbare kinetiek in beide soorten extracten. Deze representatie
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het bereiden van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten, wat waardevol is voor analyses die kleine populaties cellen vereisen. De methode is toepasbaar op verschillende genexpressie-analyses en andere celtypen, inclusief patiëntcellen.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Genexpressie
- Biochemie
Achtergrond
- HeLa-cellen worden veel gebruikt in onderzoek voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Nucleaire extracten zijn essentieel voor het begrijpen van genexpressiemechanismen.
- Traditionele methoden vereisen vaak grote celpopulaties, wat hun toepassing beperkt.
- Dit protocol maakt het mogelijk om kleine hoeveelheden cellen te gebruiken, waardoor de veelzijdigheid wordt vergroot.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het bereiden van kleinschalige nucleaire extracten uit HeLa-cellen.
- Om genexpressie-analyses met beperkte celaangetallen mogelijk te maken.
- Om de functionaliteit van nucleaire extracten in transcriptie- en splitsingsactiviteiten te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Oogsten en zwellen van HeLa-cellen.
- Centrifugatie om kernen te pelleten en zoutextractie.
- Dialyse van nucleaire extracten om oplosbare componenten te verkrijgen.
- Evaluatie van transcriptie- en splitsingsactiviteiten met behulp van een gekoppeld RNA-polymerasesysteem.
Belangrijkste resultaten
- Kleinschalige nucleaire extracten tonen vergelijkbare transcriptie- en splitsingsefficiënties vergeleken met bulkextracten.
- Functionele analyses bevestigen de bruikbaarheid van de kleinschalige methode.
- Resultaten tonen de toepasbaarheid van de methode aan voor cellen behandeld met remmers.
- Gegevens ondersteunen de effectiviteit van het protocol voor verschillende genexpressieonderzoeken.
Conclusies
- De kleinschalige nucleaire extractbereiding is efficiënt en veelzijdig.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende analyses die beperkte celaangetallen vereisen.
- Toekomstige studies kunnen dit protocol gebruiken voor diverse biologische onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Small-scale nuclear extract preparation enables functional gene expression assays from limited cell populations, supporting rapid evaluation of cellular responses to diverse treatments. This capability is critical for biopharma teams working with scarce patient samples, engineered cell lines, or drug-exposed populations where bulk extraction is impractical. The method enhances predictive confidence in early discovery and mechanistic de-risking by allowing direct assessment of transcription and splicing machinery under relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression pathways in cells exposed to drugs, RNAi, or DNA-damaging agents.
- Supports mechanistic de-risking by directly measuring transcription and splicing activity post-treatment.
- Facilitates functional target validation using minimal cell input, including rare or patient-derived samples.
Screening & Assay Development
- Provides validated nuclear extracts for quantitative transcription and splicing assays.
- Improves assay reproducibility and standardization across small-scale experiments.
- Enables rapid screening of compound effects on gene expression machinery.
Translational & Preclinical Research
- Allows functional assessment of gene expression in disease-relevant or patient-derived cells.
- Supports translational biomarker studies by enabling mechanistic assays with limited clinical material.
- Bridges discovery and preclinical validation by maintaining assay continuity across cell types and treatments.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional gene expression assays from early target validation through translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring transcription and splicing outputs after specific cellular perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready nuclear extracts for reproducible, quantitative evaluation of compound or genetic interventions.
- Analytics: Provides direct readouts of transcription and splicing efficiency, enabling robust comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates continuity from in vitro discovery to preclinical studies using limited or patient-derived samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for functional nuclear extract preparation across diverse cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes extract preparation for reproducibility and scalability in small-scale settings.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions and efficient resource allocation by supporting functional assays with minimal material.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization by allowing functional validation in rare or limited cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell handling, nuclear extraction, and functional gene expression assays.
- Needs access to centrifugation, dialysis, and quantitative assay infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible extract quality and assay outputs.
- Adaptable to various cell types, but optimization may be needed for non-HeLa systems.
- Limited by the minimum cell number required for detectable transcription and splicing activity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Growing and Harvesting HeLa Cells for Nuclear Extraction
1:56
Swell HeLa Cells in Hypotonic Buffer
3:00
Lyse Cells using a Dounce Homogenizer
4:27
Salt-extract the Nuclei
5:15
Concentrate and Dialyze the Nuclear Extract
6:16
Results: Small-scale Nuclear Extract Technique for Functional Assays of Gene Expression Machineries
7:51
Conclusion
