Name: Reverse genetics Mediated Herstel van infectieuze Murine Norovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Leer twee reverse genetics-methoden voor het herstel van infectieus murine norovirus in celkweek. Deze technieken genereren gekapte RNA-transcripten en gebruiken T7-polymerase-expressie om virale replicatie en pathogenese te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door een Wellcome Trust Senior Fellowship toegekend aan Ian Goodfellow, en een Marie Curie Intra European Fellowship (KP7 European Research Council) uitgereikt aan Armando Arias. We willen graag Io Hong Cheong, dr. Rebecca Robey en Dr Mike Skinner bedanken voor het geven van ons toestemming om hun Agilent bioanalyser te gebruiken en te helpen met het runnen van RNA-monsters.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li>
<li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis%2C+Avon%2C+England%2C+2002-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li>
<li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li>
<li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5%27-end+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
<li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase%3A+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li>
<li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs%3A+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li>
<li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Hier hebben we geïllustreerd twee verschillende omgekeerde genetische benaderingen die het herstel van de besmettelijke MNV in celcultuur mogelijk te maken. Beide benaderingen effectief omzeilen absolute vereiste voor de covalente koppeling van VPG aan het 5&#39;-uiteinde van het virale genoom RNA via de vorming van capped MNV transcripten die vervolgens worden herkend door het cellulaire ribosomen. In vitro transcriptie gevolgd door enzymatisch bovengrens is efficiënter het herstel van infectieuze MNV dan transcriptie van infectieuze plasmiden in cellen die T7 RNA-polymerase, waarbij de transcripten kan worden begrensd door het FPV aftopping enzymen. Virus titers teruggewonnen deze reverse genetics systemen zijn gelijk aan die verkregen door transfectie van virale VPG gekoppelde RNA gezuiverd uit geïnfecteerde celkweken 17 (figuur 5). De transfectie van de afgetopte MNV RNA in permissieve Raw264.7 cellen maakt een virus titer slechts 1-log lager dan experimenten met de transfection van totaal RNA van geïnfecteerde cellen die virale VPG gekoppelde RNA (figuur 5). Dit feit stimuleert verder onderzoek vast te stellen of de toevoeging van een VPG molecule aan het 5 &#39;uiteinde van transcripten die door deze systemen kunnen resulteren in verhoogde virusopbrengst die licht functionele aspecten onderliggende MNV infectiviteit in cellen geassocieerd VPG. Echter we dit reverse genetics systeem een zeer efficiënte een vergelijkbaar met andere RNA virussen reverse genetics die momenteel gebruikt in de in vitro getranscribeerde RNA het herstel van titers maar lager dan 10 tot 100 in reële infecties met virions 19, 20 toelaat. Over het geheel genomen de huidige methodieken vormen een belangrijke stap voorwaarts op het gebied van norovirus moleculaire biologie en geven ons de tools om de functionele rol van eiwitten en RNA geconserveerde motieven in norovirus genomen te onderzoeken. Deze benaderingen zijn reeds gecombineerd met cUIDIGE muismodel beschikbaar zijn en hebben aangetoond dat MNV hersteld van infectieuze cDNA is in staat om dodelijke infectie van&gt; 80% STAT1-/ veroorzaken - muizen in minder dan 10 dagen 4, 21. Door gebruik van dit systeem wij hersteld levensvatbare muizen norovirus mutanten van de capside eiwitten en een polypyrimidine kanaal bij de binding van verschillende factoren gastheer (PTB en PCBP) een enigszins verzwakt fenotypen weergegeven in vivo 21, 22. Daarnaast hebben wij onlangs aangetoond dat virussen die het vermogen van de proteïne VF1 efficiënt drukken van ORF4 repliceren in celkweek maar ook zijn virulentie in muizen verminderd ten opzichte van WT MNV 8. Deze studies moedigen ons aan om verzwakte versies van humane norovirussen op basis van MNV studies die kunnen worden onderzocht als potentiële kandidaat-vaccins te ontwerpen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Lithiumchloride neerslag oplossing </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA-storage-oplossing </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 script </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Plafonnering System </td><td> Epicentre Biotechnologie </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon transfectiesysteem </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon transfectiesysteem kit </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 transfectiereagens </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustraties GFX PCR DNA en Gel Band Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated herstel van infectieuze murine norovirus

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Menselijke norovirussen zijn verantwoordelijk voor de meeste gevallen van de menselijke gastro-enteritis (GE) de hele wereld en zijn steeds terugkerend probleem in een omgeving waar bijna van persoon tot persoon contact niet kan worden vermeden 1, 2. Gedurende de laatste jaren een toename in de incidentie van uitbraken in ziekenhuizen gemeld, waardoor hinderlijke storing in hun operationele capaciteit en de grote economische verliezen. De identificatie van nieuwe antivirale benaderingen is te wijten aan het onvermogen van de menselijke norovirussen naar een productieve infectie te voltooien in cel cultuur 3 beperkt. De recente isolatie van een murine norovirus (MNV), nauw verwant aan humane norovirus 4, maar die kunnen worden gekweekt in cellen 5 heeft nieuwe wegen voor het onderzoek van deze pathogenen 6, 7. MNV replicatie resulteert in de synthese van nieuwe positieve zin genoom en subgenomische RNA moleculen deze overeenkomt met de laatste third van het virale genoom (figuur 1). MNV bevat vier verschillende open leesramen (ORFs), waarvan ORF1 neemt de meeste van het genoom codeert en zeven niet-structurele eiwitten (NS1-7) vrij uit een polyproteïne precursor. ORF2 en ORF3 staan ​​in het subgenomische RNA regio coderen capside eiwitten (VP1 en VP2, respectievelijk) (figuur 1). Onlangs hebben we vastgesteld dat extra ORF4 overlappende ORF2 maar in een andere leesraam functioneel en codeert voor een mitochondriaal gelokaliseerde virulentiefactor (VF1) 8. Replicatie van positieve RNA virussen, zoals norovirussen, vindt plaats in het cytoplasma, waardoor de synthese van nieuwe afgetopte RNA-genomen. Om virale het vertalen te bevorderen, virussen te exploiteren verschillende strategieën die gericht zijn op het werven van de cellulaire eiwitsynthese machines 9-11. Interessant is norovirus vertaling gedreven door de multifunctionele virale eiwit-primer VPGcovalent gebonden aan het 5&#39;-uiteinde van zowel genomische en subgenomische RNA 12-14. Dit verfijnde mechanisme van de vertaling zal waarschijnlijk een belangrijke factor in de beperkte efficiëntie van virale herstel door middel van conventionele reverse genetics benaderingen zijn. Hier rapporteren twee verschillende strategieën gebaseerd op het genereren van muizen norovirus-1 (aangeduid als MNV hierbij) transcripten beperkt tot het 5 &#39;uiteinde. Een van de methoden betreft zowel in vitro synthese en de aftopping van de virale RNA, terwijl de tweede benadering houdt in de transcriptie van MNV cDNA in cellen die T7 RNA-polymerase. De beschikbaarheid van deze reverse genetics systeem voor de studie van MNV en een klein diermodel heeft een ongekende mogelijkheid om de rol van virale sequenties in replicatie en pathogenese 15-17 ontleden.

Norovirussen zijn een belangrijke oorzaak van gastro-enteritis nog moleculaire technieken voor de karakterisering zijn nog relatief nieuw. Hier rapporteren wij twee verschillende reverse genetics benaderingen voor de doeltreffende inning van murine norovirus (MNV), het enige lid van dit geslacht die kunnen worden gekweekt in celcultuur.

Reverse genetics Mediated Herstel van infectieuze Murine Norovirus

Humane norovirussen zijn verantwoordelijk voor de meeste gevallen van humane gastro-enteritis (GE) wereldwijd en vormen een terugkerend probleem in omgevingen waar nauw...

Het algemene doel van deze procedure is het herstellen van infectieus mu-oogneurovirus met behulp van twee reverse genetische systemen. Hallo, ik ben Armando Arias van de afdeling Virologie aan het Imperial College London. In onze groep zijn we geïnteresseerd in het ontleden van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de replicatie van het neurovirus.Norovirussen zijn een belangrijke oorzaak van gastro-enteritis. Wereldwijd zijn moleculaire technieken voor hun karakterisering nog relatief nieuw. De identificatie van nieuwe antivirale benaderingen en inzichten in de levenscyclus van het norovirus zijn beperkt gebleven vanwege het onvermogen van deze virussen om een productieve infectie in celcultuur te voltooien.De recente isolatie van een antiviraal middel dat in staat is om muizen te infecteren en zich in celculturen te vermenigvuldigen, namelijk het mirror neurovirus, heeft nieuwe wegen geopend voor het onderzoek naar deze belangrijke pathogenen. In dit verslag zullen we twee strategieën demonstreren waarmee genetisch gedefinieerde neuro neurovirus-isolaten in celcultuur kunnen worden gegenereerd. Beide strategieën zijn gebaseerd op de generatie van virale transcripten met een cap aan het five prime-uiteinde.De eerste methode omvat de synthese en capping van viraal RNA in vitro voorafgaand aan transfectie in cellen. De tweede aanpak houdt in dat het cDNA van het neuro-norovirus wordt getranscribeerd binnen cellen die T7 RNA-polymerase tot expressie brengen. Overzicht van de procedure. Het protocol voor het herstel van het neuro-norovirus uit gecappte RNA-transcripten begint met linearisatie.Het plasmide dat MV CD NA bevat voor mmv one. Dit wordt gedaan met het restrictie-enzym NHE one. Het DNA wordt vervolgens in vitro getranscribeerd naar RNA met behulp van T seven RNA polymerase.Vervolgens wordt het M-M-V-R-N-A in vitro gecapt en getransfecteerd in cellen om het herstel van infectieus MMV mogelijk te maken; direct herstel van infectieus MNV met behulp van FAL PX-virus dat T7 RNA-polymerase tot expressie brengt voor MMV-herstel uit direct getransfecteerde cDNA-klonen. De cellen worden eerst geïnfecteerd met een recombinant FAL PX-virus dat T7 RNA-polymerase tot expressie brengt. FAL PX-infectie resulteert in de expressie van T7 RNA-polymerase alsook virale RNA-capping-enzymen die een deel van het gesynthetiseerde RNA kunnen capten. Het M-M-V-C-D-N-A wordt vervolgens in de FPV-geïnfecteerde cellen getransfecteerd via lipid-gemedieerde transfectie. Het T7 RNA-polymerase produceert vervolgens het M-M-V-R-N-A, waarvan een deel vervolgens gecapt kan worden door het F-P-V-R-N-A-capping-mechanisme.Een ribozymsequentie garandeert dat elk RNA-transcript een gedefinieerd 3'-uiteinde bevat. De gecapte MMV-transcripten zullen vervolgens in eiwit worden vertaald voorafgaand aan de replicatie, wat leidt tot de productie van nieuwe infectieuze deeltjes. Protocol voor RNA-transcriptie en capping voor het herstel van infectieuze MMV synthese van infectieuze gecapte MMV-transcripten.Meng eerst de volgende reagentia: transcriptiebuffer, nucleotiden, water en het gelineariseerde plasmide dat het M-M-V-C-D-N-A bevat. Voeg vervolgens RNA en T7 RNA-polymerase toe aan het reactiemengsel. Voor dit doel zijn veel commerciële kits beschikbaar die een reproduceerbare methode voor RNA-synthese bieden.De transcriptiereactie wordt uitgevoerd door het mengsel gedurende ten minste twee uur te incuberen bij 37 °C. Analyseer een klein deel van deze transcriptiereactie op een niet-denaturerende agarosegel. Reinig eerst de gelapparatuur met detergent en spoel deze voor gebruik af met RNAse-vrij water.Zorg ervoor dat agarosegels worden bereid met RNAse-vrije reagentia. M-V-RNA zal migreren op ongeveer drie kilobasen op een niet-denaturerende agarosegel. Daarnaast kan een Agilent Bioanalyzer worden gebruikt om een snelle methode voor het analyseren van de RNA-integriteit te bieden.Het RNA moet vervolgens worden gezuiverd om niet-ingebouwde nucleotiden te verwijderen. Er zijn veel methoden beschikbaar, maar in dit protocol zuiveren we het RNA via lithiumchloride-precipitatie als een kosteneffectief alternatief; het RNA wordt gepellet door centrifugatie op maximale snelheid gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant zorgvuldig zodat het doorschijnende pellet niet wordt verstoord en was dit met 70% ethanol.Resuspendeer het MMV-transcript in RNA-oplossing voor bewaring en zorg ervoor dat het volledig is opgelost. Het verhitten van het RNA tot 65 °C kan dit proces later vergemakkelijken. Kwantificeer het RNA via spectrometrie.Analyseer de RNA-integriteit door een klein aliquot op een 1% niet-denaturerende agarosegel te laden. Zoals te zien is, zou de RNA-integriteit na precipitatie met lithiumchloride gelijk moeten blijven om de capping-efficiëntie te verbeteren. Verhit een aliquot van het RNA gedurende 10 minuten bij 65 °C.Plaats de buis onmiddellijk op ijs. Om degradatie of refolding te voorkomen, wordt een capping-reactiemengsel bereid zoals gesuggereerd door de fabrikant. Wij voegen doorgaans ongeveer 60 µg M-N-V-R-N-A toe aan een uiteindelijke reactie van 100 µL.Hoewel de reactie kan worden geschaald, meng deze dan grondig en incubeer bij 37 °C gedurende één uur; zuiver het RNA vervolgens door middel van lithiumchloride-precipitatie zoals voorheen. Het is essentieel om de integriteit van het RNA opnieuw te controleren voordat men overgaat tot de transfectie. Stapsgewijs protocol voor MMV-herstel door RNA-elektroporatie in ruwe cellen. Resus.Suspendeer de kolf met ruwe cellen in DMEM. Zorg ervoor dat er een enkelvoudige cel-suspensie wordt gevormd. Bepaal de concentratie levensvatbare cellen in een hemocytometer met behulp van tryanblauw-uitsluiting.Pellet de cellen en resuspendeer ze voorzichtig. Suspendeer ze in verse antibioticavrije media, 8 miljoen cellen per transfectie, en pellet ze in een microcentrifuge. Verwijder het medium en was de cellen in 500 µL PBS; centrifugeer opnieuw en verwijder de PBS. Resuspendeer de cellen in 130 µL op kamertemperatuur.Neon-resuspensie-oplossing. Voeg de juiste hoeveelheid gecapt RNA toe, gewoonlijk 1,3 µg per 130 µL cellen, wat overeenkomt met 1 µg RNA per 6 miljoen cellen. De cellen gemengd met transcripten worden opgevangen in de 100 µL Neon-transfectietip.Er moet uiterste zorg worden betracht om in dit stadium geen luchtbellen te introduceren. Voer vervolgens de elektroporatie uit met een enkele puls van 1700 volt gedurende 25 milliseconden. Breng de cellen over in een Eppendorf-buisje met 1 ml antibioticavrij medium.Verdeel de cellen vanuit de buis over afzonderlijke wells met antibioticavrije DMEM met 10% FCS en incubeer de cellen gedurende 24 tot 72 uur bij 37 °C. MMV-herstel door RNA-lipofectie in BSR T7-cellen zoals eerder beschreven. CAP MMV-transcripten worden gegenereerd middels MMV cDNA-plasmide linearisatie, T7-polymerase in vitro transcriptie en in vitro capping; de transcripten worden vervolgens gelipofecteerd in BSR T7-cellen. Trypsiniseer een monolayer van BSR T7-cellen en zaai 7,5 × 10⁵ levensvatbare cellen uit in six-well platen.Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Verwijder het medium van de cellen en vervang dit door 3 mL vers medium zonder antibiotica. Om de maximale transfectie-efficiëntie te waarborgen, mengt u 1 tot 2 µg gecapte M-M-V-R-N-A met 100 µL optimum.Meng daarnaast 4 µL lipectomy 2000 met 100 µL optimum. Voeg de monsters die RNA en lipectomy bevatten samen en meng deze grondig door 15 keer op en neer te pipetteren. Laat het mengsel 20 minuten bij kamertemperatuur staan.Voeg vervolgens de transfectiecomplexen met gecapte MMV-transcripten druppelsgewijs toe aan de cellaag. Schud de plaat in loodrechte richtingen. Incubeer de cellen gedurende 24 tot 72 uur.Protocol voor directe herwinning van infectieus MMV uit CDNA in cellen die T seven RNA-polymerase tot expressie brengen, zoals eerder beschreven. Dit protocol is gebaseerd op de expressie van T seven RNA-polymerase en oxx virale capping-enzymen in cellen die zijn geïnfecteerd met een help-oxx-virus. M-N-V-C-D-N-A onder controle van een T seven-promotor wordt vervolgens in de cellen getransfecteerd.Verwijder eerst het celkweekmedium en voeg aan elke put 700 µL F pox-virus toe, verdund in antibioticumvrij medium. Over het algemeen wordt een multipliciteit van infectie (MOI) van ongeveer 0,5 PFU per cel gebruikt; schud de platen loodrecht en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 2 mL antibioticumvrij medium toe en incubeer de cellen nog een uur bij 37 °C om expressie van T7 RNA-polymerase MNV CG NNA-transfectie mogelijk te maken. Verwijder het medium van de geïnfecteerde cellen en voeg 3 mL vers medium zonder antibiotica toe.Bereid een mengsel voor van één microgram M-M-V-C-D-N-A en lipectomie zoals uitgelegd in de vorige sectie. Meng grondig door het mengsel herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Bewaar de buis gedurende 20 minuten op kamertemperatuur, meng vervolgens opnieuw en voeg druppelsgewijs toe aan de cellaag.Schud de plaat voorzichtig in loodrechte richtingen. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 24 tot 72 uur om het herstel van infectieus MMV te bevestigen via de verschillende reverse genetics-benaderingen die in de loop van deze video worden getoond. Maak infectieuze varionen uit de cellen door herhaaldelijk invriezen en ontdooien. Bepaal de titer in elk monster via standaardprocedures zoals TCID 50 of een plaque-assay voor representatieve resultaten.De beschikbaarheid van deze reverse genetische systemen om het Neurovirus te bestuderen, heeft een ongekende mogelijkheid geboden om de rol van virale sequenties in de replicatie en pathogenese van het neurovirus in de natuurlijke gastheer te ontleden. Beide in deze video uitgelegde benaderingen van reverse genetica zijn zeer efficiënt voor het terugwinnen van infectieus neuro- en neurovirus in celculturen. Zoals in deze figuur wordt getoond.Infectieuze MMV, met een titer die 10⁵ TCID₅₀ per ml overschrijdt, wordt teruggewonnen na transfectie van capped MMV-transcripten in respectievelijk RAW-cellen of BSRT7-cellen. De transfectie van MMV-cDNA in BSRT7-cellen die vooraf zijn geïnfecteerd met het fowl pox-virus resulteert in virale titers die 10⁴ TCID₅₀ per ml overschrijden. De virale titers verkregen via reverse genetica-benaderingen zijn vergelijkbaar met de titers die zijn gered door transfectie met RNA geïsoleerd uit infectieus virus, wat de hoge efficiëntie van de hier beschreven reverse genetica-systemen benadrukt.

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.

Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children&#39;s Krukken Door Taqman een stap RT-PCR

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Hier beschrijven we een methode om infectieuze deeltjes van murine norovirus (MNV), de enige norovirus die efficiënt repliceert in celkweek kwantificeren. De plaque assay maakt gebruik van tropisme MNV voor murine macrofagen en kan worden aangepast voor gebruik met biologische of milieumonsters met MNV.

Plaque assay voor Murine Norovirus

Source: Leuthold, M. M., et al. Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the purification of recombinant human norovirus P domain using size exclusion chromatography, highlighting the separation of the target protein from higher and lower molecular weight impurities based on differential pore accessibility. The process is monitored by UV absorbance and confirmed through SDS-PAGE analysis of eluted...

Purification of Bacteria-Derived Recombinant P Domain Proteins of Human Norovirus

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter...

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.

Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Het doel van dit protocol is het kwantificeren van binding van de eukaryotische pathogene menselijke norovirus aan bacteriën. Na het uitvoeren van een eerste virus-bacterie gehechtheid test, flow cytometrie wordt gebruikt om viraal gebonden bacteriën te detecteren binnen de bevolking.

Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Leer twee reverse genetics-methoden voor het herstel van infectieus murine norovirus in celkweek. Deze technieken genereren gekapte RNA-transcripten en gebruiken T7-polymerase-expressie om virale replicatie en pathogenese te bestuderen.

Reverse genetics Mediated Herstel van infectieuze Murine Norovirus

Meer video's verkennen