Name: Antilichaam Transfectie in Neuronen als een instrument om de ziekte Pathogenese Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer antilichaamtransfectie in neuronen voor neuro-immunologisch onderzoek met fluorescentielabeling. Deze methode maakt snelle visualisatie van auto-antilichaaminteracties mogelijk om neurologische ziektepathogenese te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het Bureau van Onderzoek en Ontwikkeling, Medische Research Service, Department of Veterans Affairs. Deze studie werd gefinancierd door een VA Merit Beoordeling Award (voor MCL) en de Universiteit van Tennessee Health Science Center Multiple Sclerose Onderzoek Fonds.

1. Labeling antilichaam (figuur 1) <ol><li> Maak 0,1 M NaHCO3 buffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCO3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 liter H 2 O </li></ul></li><li> Breng de buffer tot een pH van 8,4 met deze oplossing (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0). </li><li> Voeg 35 ul Atto550 NHS tot 70 pi anti-hnRNPA1 en 500 ul buffer NaHCO3 en draaien gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na de een uur durende rotatie, injecteren het mengsel in een kunstnier en overnachting dialyseren in 2 liter PBS. </li><li> De volgende dag concentreren gedialyseerde Atto550 NHS anti-hnRNPA1 met een spin kolom (Amicon Ultra 0,5). </li><li> Na de Atto550 NHS gemerkte anti-hnRNPA1 antilichaam is geconcentreerd, nano-drop monster om de concentratie te bepalen. </li></ol> 2. Transfectie antilichaam (figuur 2) <ol><li> Seed 10 5 cellen / putje in 500 ui Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (+10% FBS DMEM/F12 +1% antibioticum) in een 8 ook slide 24 uur voorafgaand aan transfectie. Cell confluentie ten minste 70%. </li><li> Vierentwintig uur na uitzetten, voeg 2 pl Ab-DeliverIN reagens in een Eppendorf buis. </li><li> Voeg vervolgens 2 ug Atto550 NHS gelabeld anti-antilichaam hnRNPA1 (0,5 ug / ul) aan dezelfde Eppendorf buis en incubeer 10-15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Tijdens de incubatie media zuigen en voeg 394 pl vers DMEM media aan de cellen. </li></ol> Opmerking: Voeg 500 ul DMEM een kamer van ongerepte cellen als een controle. <ol start="5"><li> Na incubatie voeg 100 ul DMEM aan het antilichaam mengsel gemengd zijn en neer te pipetteren, en aan de cellen in DMEM voor een totaal volume van 500 ul. </li><li> Wijzig de media na 48 uur van antilichaam levering. </li></ol> Opmerking: Protocol werd herhaald met FITC gemerkte Rigg als positieve controle. 3. Live en Vaste Imaging om de efficiëntie te bepalen <ol><li> Afbeelding cellen live at 48 uur met behulp van de Cy3 filter op een fluorescentiemicroscoop om het imago van de getransfecteerde Atto550 NHS gelabelde antilichamen. </li><li> Na live beeldvorming is voltooid, zuigen de media en fix cellen. </li><li> Na afzuigen media, behandelen cellen met 0,4% paraformaldehyde gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Was de cellen 4 x 5 min elk met PBS. Vervolgens monteren cellen met montage media met DAPI reagens en fix dekglaasje aan. Meten transfectie efficiëntie van de gefixeerde cellen met AxioVision software. Als AxioVision software is niet bij de hand, gewoon tellen de gebeurtenissen uit je afbeelding met de hand en steek de stekker resultaten in berekening 3.7. Alternatief kan software worden ImageJ voor deze berekeningen. </li><li> Gebruik eerst de &quot;Gebeurtenissen&quot; meting van het totale aantal cellen tellen in uw beeld van de keuze bij een vergroting van 20x. </li><li> Vervolgens gebruikt u de &quot;Gebeurtenissen&quot; meting aan de cellen die niet meetellensuccesvol getransfecteerde met antilichamen in dezelfde 20x beeld. </li><li> Om de gemeten &quot;Gebeurtenissen&quot; in een Excel-stijl formaat openen, klikt u op &quot;Eigenschappen&quot;, klik op de &quot;Meting&quot; tab, en klik om te bekijken &quot;Zoals tabel.&quot; </li><li> Tot slot kunt u de volgende berekening om uw transfectie efficiëntie te bepalen door het vergelijken van de twee eerder gemeten gebeurtenissen: ((Totale cellen - niet-getransfecteerde cellen) / Totaal cellen) x 100 = transfectie-efficiëntie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten De live beelden van getransfecteerde (Figuur 3A) ten opzichte van getransfecteerde (Figuur 3B) neuronen blijkt dat de kenmerken van de antilichamen (rood of groen in elke figuur) duidelijk wordt waargenomen in cellen (Figuur 3B, C, D). Na aspiratie en wassen met media antilichamen tussen of aansluitend aan het oppervlak van cellen te verwijderen, gemerkte antilichamen zijn nog aanwezig in neuronen (Figuur 3C, D).<html> Om de transfectie-efficiëntie te berekenen, gebruikt de software AxioVision totale cellen berekenen vergeleken met cellen die niet met succes zijn getransfecteerd. Deze waarden zijn opgenomen in een transfectie-efficiëntie formule om de transfectie-efficiëntie te verkrijgen als percentage van het totale aantal cellen (figuur 4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomdiagram van de procedures die worden gebruikt om het etiket antilichamen met de Atto 550 NHS-ester gevolgd door stappen die nodig zijn om de gelabelde antilichamen concentreren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> Figuur 2. Stroomdiagram van de procedures om gemerkte antilichamen transfecteren in levende cellen in kweek.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> Figuur 3. Live beelden van de getransfecteerde neuronen 48 uur na transfectie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> Figuur 4. Vaste en gespoeld beelden met gebeurtenissen geteld om transfectie efficiëntie te bepalen.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li>
<li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum.+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li>
<li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry%3A+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons%3A+implications+for+molecular+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Om hypothesen specifieke moleculen en hun expressie testen worden genen en andere vectoren gewoonlijk getransfecteerd in cellen. Het unieke aspect van deze procedure is de mogelijkheid om eenvoudig antilichamen transfecteren in doelcellen. We hebben deze methode in vijf verschillende experimenten elk in duplo. Transfectie efficiëntie resultaten waren vergelijkbaar voor alle experimenten. Belangrijk is dat de methode kan toegang van antilichamen in de cel zonder dat antilichaam structuur of functie. Verder met het gebrui...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Fluorescerende Microscoop AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision versie 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC anti-Rigg gelabeld </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS ester </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> +10% FBS DMEM/F12 +1% antibiotica </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-lysine 8-en Cultuur Slides </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Wetenschappelijke Industries Inc </td><td> Model 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montage Media </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Kunstnier </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (4% oplossing) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antilichaam transfectie in neuronen als een instrument om de ziekte pathogenese studie

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antilichamen de mogelijkheid om nieuwe inzicht te krijgen in de verschillende evenementen die plaatsvinden in levende systemen. De mogelijkheid om zeer specifieke antistoffen doeleiwitten is toegestaan ​​voor zeer precieze biologische vragen worden aangepakt. Belangrijker is dat antilichamen betrokken bij de pathogenese van een aantal menselijke ziekten zoals systemische lupus erythematosus (SLE), reumatoïde artritis (RA), paraneoplastische syndromen, multiple sclerose (MS) en menselijk T-lymfotroop virus type 1 (HTLV-1) bijbehorende myelopathie / tropische spastische paraparese (HAM / TSP) 1-9. Hoe antilichamen veroorzaken ziekte is een gebied van verder onderzoek, en gegevens suggereren dat de interacties tussen antilichamen en verschillende intracellulaire moleculen resulteert in ontsteking, cellulaire messaging en apoptose 10 veranderd. Het is aangetoond dat patiënten met MS en HAM / TSP auto-antilichamen te produceren voor de intracellulaire RNA bindend eiwit heterogene ribonuclear proteïne A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recente gegevens wijzen erop dat antilichamen tegen zowel intra-neuronale en oppervlakteantigenen pathogene 3, 5-9, 11. Zo een procedure waarbij voor de studie van intracellulaire antilichamen: eiwit interacties zijn goed inzicht geven in ziekte pathogenese. Genen worden gewoonlijk getransfecteerd in primaire cellen en cellijnen in cultuur is echter transfectie van antilichamen in cellen gehinderd door verandering van antilichaamstructuur of slechte transfectie-efficiëntie 12. Andere werkwijzen voor transfectie omvatten antilichaam transfectie gebaseerd op kationische liposomen (bestaande uit DOTAP / DOPE) en polyethyleeniminen (PEI), die resulteerden in een tienvoudige afname in antilichaam transfectie in vergelijking met controles 12. De werkwijze uitgevoerd in ons onderzoek is vergelijkbaar met kationische lipidegemedieerde werkwijzen en gebruiken van een lipide-gebaseerd mechanisme niet-covalente complexen met de antilichamen door elektrostatische en hydrophobic interacties 13. We gebruik Ab-DeliverIN reagens, een lipide formulering kan vastleggen antilichamen door niet-covalente elektrostatische en hydrofobe interacties en hen in cellen. Zo chemische en genetische koppelingen zijn niet noodzakelijk voor de levering van functionele antilichamen in levende cellen. Deze methode heeft ons u verschillende antilichaam opsporing en eiwit lokalisatie experimenten, alsmede de analyse van de moleculaire gevolgen van intracellulaire antilichamen: eiwitinteracties 9. In dit protocol zullen we zien hoe antilichamen transfecteren tot neuronen snel, reproduceerbaar en met een hoge transfectie-efficiëntie. Als voorbeeld zullen we anti-hnRNP A1 en anti-IgG antilichamen. Voor eenvoudige kwantificering van transfectie efficiency we anti-hnRNP A1 antilichamen gemerkt met Atto-550-NHS en FITC-gelabelde IgG. Atto550 NHS is een nieuw label met een hoog moleculair absorptie en quantum yield. Excitatiebron en fluorescerende filters voor Atto550 zijn vergelijkbaar met Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Bovendien Atto550 een hoge fotostabiliteit. FITC-gelabelde IgG werden gebruikt als controle om aan te tonen dat deze methode is veelzijdig en niet afhankelijk verven. Deze aanpak en de gegevens die gegenereerd zal helpen bij het begrijpen van de rol die antilichamen tegen intracellulaire doelantigenen zouden kunnen spelen in de pathogenese van ziekten.

Een snelle benadering van interacties en effecten op moleculaire mechanismen van de aanwezigheid van antilichamen in een intracellulaire omgeving onderzoeken beschreven. De werkwijze omvat transfectie van antilichamen in levende cellen met een niet-covalente complexvorming gebaseerd op een lipide formulering. De techniek is toepasbaar voor geïmmortaliseerde cellijnen en primaire cellen.

Antilichaam Transfectie in Neuronen als een instrument om de ziekte Pathogenese Studie

Antilichamen bieden de mogelijkheid om nieuwe inzichten te verkrijgen in diverse processen die plaatsvinden in levende systemen. De mogelijkheid om zeer specifieke ...

Het doel van deze procedure is om een snelle en reproduceerbare methode te bieden om te onderzoeken hoe antilichamen, auto-moleculaire mechanismen gerelateerd aan neuronale functies en de pathogenese van neurologische ziekten werken. Eerst worden de antilichamen gelabeld met een ATO five 50 NHS fluorescerend label. Vervolgens worden de antilichamen gemengd met het transfectiereagens en daarna getransfecteerd in neuronale cellen.In kweek worden neuronen 48 uur na transfectie gefixeerd, gemonteerd met DPI-medium en gevisualiseerd met immunofluorescentiemicroscopie. De transfectie-efficiëntie kan worden berekend met behulp van beeldsbehandelingssoftware. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen en neuro-immunologie, zoals de wijze waarop autoantilichamen moleculaire mechanismen beïnvloeden die verband houden met de neuronale functie en de pathogenese van immuungeestuurde neurologische ziekten.Het idee voor deze methode ontstond toen we de hypothese wilden testen dat antilichamen tegen h en RPA één en RNA-bindend eiwit, die overgeëxpresseerd zijn in neuronen, bijdroegen aan het mechanisme van neurodegeneratie; de procedure wordt gedemonstreerd door Josh Douglas, een promovendus. Zorg ervoor dat er vóór aanvang van de procedure, de dag voor de experimenten, hoogwaardige intacte neuronale cellen beschikbaar zijn die zijn geplaatst met een dichtheid van 100.000 cellen per putje en ten minste 80% confluent zijn. Observeer de cellen op de dag van de assay om te controleren of ze gezond zijn.Begin met het bereiden van 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer door 8,4 gram natriumbicarbonaat en 29,2 gram natriumchloride te mengen in één liter water. Stel vervolgens de pH van de buffer in op 8,4 voor 500 µL buffer. Voeg 70 µL toe van het te transfecteren antilichaam, in dit geval anti H-N-R-N-P-A one, en 35 µL van het labelingsreagens, hier NHS-ester.Roteer de oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur, injecteer deze vervolgens in een dialyser en dialyseer deze gedurende de nacht in twee liter PBS bij vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag een spincolumn om het gedialyseerde gelabelde antilichaam te concentreren. Bepaal tot slot de antilichaamconcentratie met een NanoDrop-spectrofotometer.Zaai in een slide met acht putjes 10.000 cellen per putje in een volume van 500 µL compleet DMEM. Incubeer de cellen bij 37 °C overnacht of tot de confluentie van de cellen ten minste 70% bereikt. Zodra de cellen 70% confluent zijn, begint de procedure door twee µL antilichaam, de transfectiereagentia en twee µg gelabeld antilichaam met een concentratie van 0,5 µg/µL in een Eppendorf-buisje te mengen en de oplossing 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.Verwijder ondertussen het SUP natum uit de putjes voor celkweek en vervang dit door precies 394 microliters vers medium per putje. Zodra de transfectie-oplossing gereed is, voeg dan 100 microliters DMEM toe en meng dit door herhaaldelijk te pipetteren. Voeg vervolgens precies 106 microliters van het transfectiemengsel toe aan elk putje met cellen, om een eindvolume van 500 microliters per putje te verkrijgen.Zorg ervoor dat een niet-getransfecteerde negatieve controleput wordt opgenomen waarin DMEM in plaats van antilichamen wordt toegevoegd. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 °C. Vervang na deze incubatie het medium door vers DMEM en voer 48 uur na de labeling live-imaging uit met een fluorescentiemicroscoop.Om vijf 50 NHS-gelabelde ATO-antilichamen te visualiseren, gebruikt u na live-imaging filter drie van de SI; aspireer het medium en fixeer de cellen door 4% paraldehyde toe te voegen en de slide 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Zodra de cellen gefixeerd zijn, wast u ze vier keer met PBS, met een incubatietijd van vijf minuten in PBS per wasbeurt. Verwijder vervolgens het PBS en voeg een druppel montagevloeistof toe die DPI bevat.Plaats met behulp van een fluorescentiemicroscoop voorzichtig een dekglas bovenop de cellen in elke put. Begin met het beelden van de cellen. In dit experiment hebben we live fluorescentie-imaging uitgevoerd van neuronen die succesvol waren getransfecteerd met ATO five 50 NHS gelabelde anti H-N-R-N-P-A one antilichamen.Deze afbeelding toont antilichamen binnen de neuronale cellen, inclusief het cytoplasma van de neuronale uitlopers, evenals de nucleusfixatie en nucleuskleuring. Het gebruik van DPI, hier in blauw weergegeven, maakt het mogelijk om de transfectie-efficiëntie te bepalen door het aantal getransfecteerde cellen te delen door het totale aantal cellen. In dit geval is de efficiëntie 50% na het volgen van deze procedure.Andere methoden, zoals immunocytochemie, RNA-extractie, microarray-analyse en western blots, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de colokalisatie van antilichamen binnen cellulaire organellen, evenals veranderingen in de neuronale functie en integriteit gerelateerd aan de specificiteit van het antilichaam voor het doelantigeen. In deze video hebben we laten zien hoe antilichamen met een fluorescent label kunnen worden gelabeld, hoe een complex van transfectiereagens met fluorescent gelabelde antilichamen kan worden voorbereid, hoe neuronen kunnen worden getransfecteerd en hoe de transfectie-efficiëntie kan worden berekend. Deze methode is nuttig bij de evaluatie van hoe autoantilichamen cellulaire functies beïnvloeden, zoals levensvatbaarheid, apoptose en neuronaal transport, alsook de moleculaire mechanismen die verband houden met de neuronale functie en de pathogenese van neurologische ziekten.

antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the process of transducing human neuronal cells with a lentivirus encoding a mutant human tau protein tagged with yellow fluorescent protein (YFP) to study protein aggregation. It outlines the steps from viral entry to mutant tau expression, culminating in the formation of visible cytoplasmic tau aggregates in the neurons.

Lentiviral-Mediated Transduction of Human Neurons for Tau Protein Aggregation Analysis

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Het regelen van eiwitexpressie is niet alleen essentieel voor elk levend organisme, maar ook een belangrijke strategie om eiwitfuncties in cellulaire modellen te onderzoeken. Het gepresenteerde protocol toont de toepassing van antilichaaminterferentie in zoogdiercellen, inclusief primaire hippocampale neuronen, en demonstreert het gebruik van driedimensionale reconstructies bij het bestuderen van eiwitfuncties.

Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies

Dit manuscript beschrijft hoe virale vector-gemedieerde lokale gen-levering een aantrekkelijke manier biedt om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie te brengen. Het protocol schetst alle cruciale stappen om een injectie met een virologisch vector uit te voeren in de substantia nigra van de rat om een op een virologisch vector gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.

Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

Auto-immune encefalitis is een nieuwe categorie van antilichaam-gemedieerde ziekten van het centrale zenuwstelsel. Hippocampusneuronen kunnen worden gebruikt om deze antilichamen te ontdekken en te karakteriseren. Dit artikel biedt een protocol voor primaire celkweek en immunostaining om auto-antilichamen in het serum en cerebrospinale vloeistof van patiënten te bepalen.

Hippocampale neuronale culturen om nieuwe pathogene antilichamen te detecteren en te bestuderen die betrokken zijn bij auto-immune encefalitis

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Leer antilichaamtransfectie in neuronen voor neuro-immunologisch onderzoek met fluorescentielabeling. Deze methode maakt snelle visualisatie van auto-antilichaaminteracties mogelijk om neurologische ziektepathogenese te bestuderen.

Antilichaam Transfectie in Neuronen als een instrument om de ziekte Pathogenese Studie

Meer video's verkennen