Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde In-situ Perfusie van het longweefsel en X-gal kleuring van LacZ-Label tumorcellen
21 augustus 2012
De nieuwe protocol gerapporteerd in deze studie kan selectieve detectie van longmetastasen in cel resolutie in muizen door gecombineerde In-situ Longperfusie en fixatie en X-Gal kleuring van LacZ-Gelabeld tumorcellen.
Het algemene doel van deze procedure is om de detectie van micrometastasen in de muizenlong ex vivo te verbeteren terwijl de architectuur van de opgeblazen long wordt behouden. Dit wordt bereikt door eerst de long in situ te perfunderen met PBS om het bloed te verwijderen, wat de belangrijkste bron van kleurachtergrond in dat weefsel is. De volgende stappen zijn het opblazen van de long door injectie van PFA, en vervolgens het afknijpen om het longweefsel onder opblazing te fixeren.
Vervolgens wordt de long verwijderd en verder gefixeerd in PFA of enkele longkwabben worden ingebed voor cryosectie. De laatste stappen zijn het kleuren van de weefsels in Xal-oplossing en het visualiseren van de LA zag-tumorcellen, uiteindelijk kan metastase op hele longkwabben of in longweefselsecties worden gedetecteerd tot op enkelcelniveau met een binoculaire microscoop of een lichtmicroscoop. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals de lucht op zichzelf staan, is dat de detecteerbaarheid van micrometastasen aanzienlijk is verbeterd door de verwijdering van bloedgerelateerde achtergrond.
Begin het protocol door een muis te anesthetiseren met een intraperitoneale injectie van ketamine, xylazine en ace promazine in ongeveer 150 microliter PBS. Wanneer de pijnreflexen van de muis niet meer worden waargenomen, fixeer het op de operatietafel. Kam het haar naar achteren en glad met 70% ethanol.
Open de huid van de buik tot aan de nek. Trek de huid naar de zijkanten of verwijder het. Open voorzichtig het peritoneum in de thorax om scheuring van grote vaten zoals de vena jugulars te voorkomen.
Dit zal de efficiëntie van de perfusie verbeteren. Snijd nu de vena cava cardis onder de lever door met een 20 milliliter spuit met een 21 tot 24 gauge naald. Injecteer langzaam 10 tot 15 milliliter PBS in de rechter ventrikel van het kloppende hart totdat de long volledig wit is en het hart stopt met kloppen.
Knijpt vervolgens de bloedvaten boven de lever en het diafragma af met een vaatklem. Laad een 10 milliliter spuit met 3% paraform aldehyde, en injecteer met een 21 tot 24 gauge naald in de rechter ventrikel. Ongeveer twee milliliter.
Ontdek de trachea buiten de thorax en blaas de long op met een injectie in de trachea van ongeveer drie milliliter aldehyde van buiten de thorax. Knijp dan onmiddellijk na het verwijderen van de naald de trachea dicht bij de punctie af met een vaatklem en wacht 10 minuten om fixatie mogelijk te maken. Snijd vervolgens de bloedvaten boven de vaatklem door.
Verwijder vervolgens de klem en injecteer ongeveer twee milliliter PBS in de rechter ventrikel om overtollig formaldehyde te verwijderen. Prik de onderste delen van alle longkwabben met een naald en verwijder de vaatklem bij de trachea. Injecteer nu drie tot vijf milliliter verdunde inbeddingsoplossing in de trachea dicht bij de andere injectie.
Stop de injectie wanneer de paraform zich in de longkwabben vervangt door de oplossing. Verwijder de long voorzichtig door het hart met een pincet te trekken en door bindweefselligamenten, bloedvaten en de trachea door te snijden. Zorg ervoor dat het hart verbonden blijft met de longen.
Leg een kwab opzij voor cryosecties en gebruik het resterende longweefsel voor hele longkleuring. Plaats de long in een plastic beker met een goed sluitend deksel en fixeer het met 2% formaldehyde en PBS. Leg een stuk gaas op de long om het in de oplossing te houden en laat het 30 minuten op kamertemperatuur staan.
Na een half uur verwijdert u de fixeeroplossing en spoelt u het weefsel grondig met PB S3 keer, bereid vers de klaar voor gebruik xal-oplossing door een milliliter Xal-basisoplossing, een tot 40 in de basiskleuroplossing te verdunnen en minimaal 10 milliliter ervan in de beker toe te voegen. Laat de long met een stuk gaas inzinken. Zet het deksel losjes vast om luchtuitwisseling mogelijk te maken en incubeer het beschermd tegen licht gedurende drie tot vijf uur bij 37 graden Celsius.
Na de incubatie verwijdert u de xal-oplossing. Spoel de longen eenmaal met PBS om resterende xal-oplossing te verwijderen en voeg minimaal 10 milliliter 4% paraform aldehyde in PBS toe. Het weefsel is nu klaar voor histologie en kan langdurig worden bewaard in de 4% PFA bij vier graden Celsius.
Begin door een derde van een inbeddingsmal te vullen met onverdund poly forze inbeddingsmedium. Laad vervolgens de longkwab in de mal en blijf medium toevoegen totdat de kwab volledig is bedekt. Vermijd voorzichtig het maken van luchtbellen en incubeer nu de ingebedde kwab gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.
Bereid vervolgens de ingebedde longen voor op het snijden door ze langzaam te bevriezen in een mengsel van droog ijs en isop pentaan. Indien nodig kunnen ze nu worden overgebracht naar een min 80 graden Celsius vriezer voor opslag op een cryostat. Snijd zeven tot tien micron cryosecties van de kwab, monteer de secties op commercieel verkrijgbare cryosectie-klare dia's. Zodra ze zijn gemonteerd, incubeer de secties onmiddellijk in xal-kleuroplossing bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur in een bevochtigde kamer. De volgende dag spoelt u de dia's twee keer gedurende vijf minuten per spoeling in PBS.
Volg dit op met een korte spoeling in gedistilleerd water. Maak nu de dia's tegenkleuren met nucleair fast red gedurende 10 seconden om een zwakke tegenkleuring te krijgen die de xal dominanter maakt en spoel de tegenkleuring onmiddellijk af met gedistilleerd water. Voor een donkerdere tegenkleuring verlengt u de tijd tot 30 seconden of meer.
Monteer de dia's met immuno mount. De vorming van metastasen in de done LM acht muizen OS-modellen werd opnieuw onderzocht. Met behulp van hier beschreven representatieve beelden van geperfundeerde en niet-geperfundeerde longen van muizen die gelijktijdig werden geïnjecteerd met laxy getransduceerde en niet-transduceerde gecontroleerde done en LM acht cellen in muizen die geïnjecteerd werden met gecontroleerde done cellen.
Macroscopische en microscopische metastasen bleven ondetecteerbaar in niet-geperfundeerde
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor de selectieve detectie van longmetastasen met een resolutie van één cel bij muizen. De methode combineert in-situ longperfusie, fixatie en X-Gal-kleuring van lacZ-gelabelde tumorcellen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Histologie
Achtergrond
- Micrometastasen in de long zijn moeilijk te detecteren vanwege de bloed-gerelateerde achtergrond.
- Bestaande methoden hebben niet de mogelijkheid om metastasen met een resolutie van één cel te visualiseren.
- Verbeterde detectietechnieken zijn essentieel voor een beter begrip van tumorverspreiding.
- Deze studie heeft tot doel de zichtbaarheid van micrometastasen in longweefsels te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen dat de detectie van longmetastasen op enkelcelniveau mogelijk maakt.
- Om de longarchitectuur tijdens het detectieproces te behouden.
- Om de algehele detecteerbaarheid van micrometastasen te verbeteren in vergelijking met bestaande methoden.
Gebruikte methoden
- In-situ perfusie van longen met PBS om bloed te verwijderen.
- Inflatie en fixatie van longweefsel met behulp van paraformaldehyde.
- Inbedding en cryosectie van longkwabben voor gedetailleerde analyse.
- X-Gal-kleuring om lacZ-gelabelde tumorcellen te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde detectie van micrometastasen in geperfuseerde longen vergeleken met niet-geperfuseerde controles.
- Enkelvoudige cellen of kleine clusters van metastasen waren identificeerbaar met behulp van X-Gal-kleuring.
- Het protocol vermindert de achtergrondinterferentie van bloed aanzienlijk.
- Representatieve afbeeldingen tonen de effectiviteit van de methode.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het detecteren van longmetastasen met een resolutie van één cel.
- Deze methode verbetert bestaande technieken door achtergrondruis te verminderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen het begrip van tumorbiologie en metastase verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate detection of micrometastases is critical for preclinical oncology studies, as undetected disease burden can lead to false-negative efficacy signals and costly late-stage failures. This protocol enhances target validation by enabling single-cell resolution visualization of lacZ-tagged tumor cells in lung tissue, reducing background interference from blood. The improved sensitivity supports mechanistic de-risking and predictive confidence in metastasis models, directly informing go/no-go decisions in therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing micrometastatic burden at single-cell resolution.
- Operational Value: Provides a low-cost, equipment-light method for functional target validation in metastasis models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing dormant or early metastatic events otherwise missed by conventional imaging.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible tissue preparations suitable for quantitative metastasis scoring.
- Quantitative Output: X-Gal staining yields a chromogenic readout enabling digital pathology and automated counting of lacZ-positive cells.
- Platform Reuse: The perfused lung preparation serves as a reusable platform for screening anticancer compounds across multiple studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains alveolar architecture and tissue morphology, ensuring metastasis detection reflects physiologically relevant lung microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing consistent, histology-based metastasis readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Improves confidence in preclinical efficacy data, reducing attrition due to undetected metastatic progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a reliable ex vivo endpoint for metastasis assessment that complements in vivo imaging modalities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of tumor cell dissemination and colonization in lung tissue.
- Screening: Delivers standardized, background-reduced tissue samples for consistent compound evaluation in metastasis assays.
- Analytics: Produces quantitative, single-cell resolution readouts that facilitate statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Ensures histological fidelity for preclinical-to-clinical extrapolation by preserving lung structure and metastatic niche.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable protocol for metastasis detection across oncology discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metastasis models by reducing false-negative detection due to vascular background.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories through defined perfusion, fixation, and staining parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing the reliability of preclinical metastasis data, reducing wasted investment in ineffective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on accurate micrometastatic burden assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery, perfusion techniques, and histological processing.
- Dependent on access to perfusion equipment, cryostat, and standard histology tools (microscopes, embedding molds).
- Necessitates cross-team standardization between in vivo pharmacology and histology teams for consistent tissue handling.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of perfusion pressure and fixation timing.
- Practical limitation: X-Gal staining sensitivity depends on lacZ expression levels and may require signal amplification for low-expressing models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
In-situ Lung Perfusion and Fixation
8:00
Conclusion
3:30
Visualizing lacZ-tagged Metastatic Tumor Cells in Entire Lung Lobes
4:31
Visualizing lacZ-tagged Metastatic Tumor Cells in Lung Cryosections
5:48
Metastases Analysis in Dunn/LM8 Osteosarcoma-bearing Mice
