Name: Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde In-situ Perfusie van het longweefsel en X-gal kleuring van LacZ-Label tumorcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer een verbeterde methode voor het detecteren van longmetastasen bij muizen op enkelvoudige celniveau met behulp van in-situ perfusie en X-Gal kleuring. Deze techniek vermindert bloedachtergrond aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Lubor Borsig (Instituut voor Fysiologie, Universiteit van Zürich) bedanken voor zijn advies over de techniek van het long perfusie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Krebsliga van het Kanton Zürich, de Walter L. en Johanna Wolf Foundation, Zürich, de Lydia Hochstrasser Foundation, Zürich, de Zwitserse National Science Foundation, SNF, Zwitserland, de Schweizerischer Verein Balgrist, en de Universiteit van Zürich.

1. In-situ longperfusie en fixatie <ol><li> Verdoven muizen door ip injectie van ~ 150 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 112,5 mg / kg (lichaamsgewicht) ketamine, 16,5 mg / kg xylazine en 15 mg / kg acepromazine (of een andere verdoving die geschikte pijnstillers). Die </li><li> Wanneer reflexen van de muis niet meer waargenomen, bevestig deze op de operatietafel terug naar beneden en nat de vacht met 70% Ethanol die aan de slick de haren naar beneden. </li><li> Open de huid van de buik tot aan de nek en trek het naar de zijkanten of te verwijderen. </li><li> Open het buikvlies en de thorax van een voldoende grootte. Voorkom breuken van grote voorwerpen, (bijv. de vena jugularis) een verminderde efficiëntie van de daarop volgende perfusie te voorkomen. </li><li> Snij de vena cava onder caudalis de lever. </li><li> Gebruik een 20 ml spuit met een 21G - 24G naald langzaam 10-15 ml PBS injecteren in de rechter ventrikel van het kloppende hart totdat de longen volledig withet hart stopt met kloppen (asystolie). </li><li> Knijpen de bloedvaten de lever en het membraan met een vasculaire klem. </li><li> Een 10 ml spuit met een 21G - 24G naald ~ 2 ml 3% paraformaldehyde (PFA) in PBS injecteren in het rechterventrikel. </li><li> Ontdek de luchtpijp buitenkant van de thorax. Gebruik dezelfde spuit ~ 3 ml 3% PFA in PBS geïnjecteerd craniale (buiten thorax) in de luchtpijp tot de long wordt opgeblazen. Onmiddellijk na verwijdering van de naald, knijpen de trachea caudale van het lek met een vasculaire klem en wacht gedurende 10 min om fixatie mogelijk. </li><li> Doorsnijden de bloedvaten boven de vasculaire klem, verwijder de klem en injecteer ~ 2 ml PBS het rechterventrikel om overmaat PFA verwijderen. </li><li> Punctie de lagere delen van longkwabben met een naald, verwijdert de vasculaire klem op de trachea en injecteer 3-5 ml van een oplossing van PolyFreeze inbedding / PBS 01:01 in de luchtpijp caudale van de eerste tot de punctie PFA in de longlobben wordt vervangen door de oplossing. </li><li> Verwijder de long door aan het hart met een forceps en transsecteren bindweefsel bindweefsel, bloedvaten en de luchtpijp. Om het hart verbonden met de longen. </li><li> Afhankelijk van hoe verder te gaan met het longweefsel analyse verder met de protocollen beschreven in de punten 2 en 3. Als u wilt beide analyses te doen, verwijder dan een long kwab en ga verder zoals beschreven onder 3. Verwerk de resterende lobben verbonden met het hart zoals beschreven in 2. </li></ol> 2. Visualisatie van lacZ-tagged gemetastaseerde tumorcellen in hele longkwabben <ol><li> Plaats de long in een plastic beker met strak sluitende deksel en vastzetten met 2% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten. </li><li> Verwijder fixatie-oplossing en grondig wassen 3 maal met PBS. </li><li> Voeg ten minste 10 ml vers 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) kleuroplossing (X-Gal voorraadoplossing [40 mg / ml in bereidingenDimethylformamide] 1:40 verdund in Basic kleuroplossing, pH 7,1 (zie tabel 1); bescherming tegen licht). </li><li> Leg een stuk gaas op de top van het zwembad long volledig houden in de oplossing en leg het deksel slechts losjes op de pot om de uitwisseling van lucht mogelijk te maken. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 3-5 uur beschermd tegen licht. </li><li> Verwijderen X-Gal oplossing eenmaal spoelen met PBS om resterende X-Gal oplossing (optioneel) verwijderen en 4% PFA voegen. </li></ol> 3. Visualisatie van lacZ-tagged gemetastaseerde tumorcellen in Lung Weefsel secties <ol><li> Prefill een gelabelde inbedding mal tot 1/3 met onverdunde PolyFreeze inbedding medium. Zet de long kwab op de top en vullen met het inbedden van medium tot de lob is volledig bedekt. Probeer bellen te voorkomen. </li><li> Incubeer de geïntegreerde longen bij 4 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Vervolgens bevriezen ingebed longen langzaam in een mengsel van droog ijs en isopentaan en bij -80 ° C. </li><li> Snijd 7 tot 10 micrometer cryohoofdstukken over een cryostaat en plak ze op SuperFrostPlus objectglaasjes. </li><li> Onmiddellijk Incubeer de secties met X-Gal kleuring oplossing bij 37 ° C gedurende 24 uur in een bevochtigde kamer. </li><li> Spoel de glaasjes in PBS 2 keer gedurende 5 minuten en vervolgens kort in gedestilleerd water. </li><li> Counter-vlek met nucleaire snel rood gedurende 10-30 seconden, spoel in gedestilleerd water en monteer de dia&#39;s met Immu-Mount. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Asai et al.. Vermeld in het oorspronkelijke artikel over de Dunn afgeleide LM8 OS muismodel sc primaire tumoren verkregen uit de parentale cellen Dunn, anders dan uit de zeer metastatische LM8 sub cellijn niet spontaan detecteerbare longmetastasen vormen in syngene C3H muizen 14. Met de hier gerapporteerde technieken, we opnieuw onderzocht de vorming van uitzaaiingen in de Dunn/LM8 muis OS-modellen. We maakten gebruik van stabiele lacZ-getransduceerde Dunn en LM8 cels en van een protocol voor in-situ longperfusie en fixatie bij muizen. Representatieve beelden van geperfundeerde en niet-geperfundeerde longen van muizen subcutaan met lacZ-getransduceerde en niet-getransduceerde control Dunn en LM8 cellen worden getoond in Figuur 1. In muizen geïnjecteerd met controle cellen Dunn, macroscopische en microscopische metastasen bleef niet detecteerbaar in niet-geperfundeerde en geperfundeerde longen (Figuur 1A, i-iv). Maar interessant, in muizen geïnjecteerd met Dunn-lacZ cellen, X-gal kleuring toonde blauwe micrometastatische foci van losse cellen of kleine clusters cellen (&lt;0,1 mm) op het oppervlak van niet-geperfundeerde longen (Figuur 1A, vi). In- situ perfusie en fixatie van de longen verbeterde de detecteerbaarheid van Dunn-lacZ micrometastasen (Figuur 1A, viii). Er werd echter uitgroei van macroscopische foci niet waargenomen (Figuur 1A, v, vii). &lt;/ P&gt; In muizen geïnjecteerd met controle cellen LM8, translucent, nauwelijks detecteerbare macrometastatic foci groter dan 0,1 mm in diameter werden opgenomen in niet-geperfundeerde longen (Figuur 1B, i). Perfusie van de long (figuur 1B, iii) verbeterde niet de detectie van de foci. Echter in muizen geïnjecteerd met LM8-lacZ cellen multiple X-Gal blauw gekleurd macro-(Figuur 1B, v) en micrometastasen (Figuur 1B, vi) werden gedetecteerd op het oppervlak van niet-geperfundeerde organen. Bovendien perfusie van de longen verbeterde de detecteerbaarheid van macro-en micrometastasen (fig. 1B, vii - viii). Bijgevolg micro-en macrometastases zichtbaar op een hogere dichtheid en een groter aantal, voornamelijk door de doorschijnendheid van de geperfuseerde weefsel waarin foci onder het orgaanoppervlak werd zichtbaar. Een extra histological analyse met behulp van vriescoupes van longweefsel bevestigde de verbeterde detecteerbaarheid van longmetastasen bij muizen ingespoten met lacZ-getransduceerde Dunn en LM8 cellen. In muizen met tumoren verkregen uit primaire Dunn-lacZ of LM8-lacZ cellen werden tegenstelling tot muizen met primaire tumoren van het betreffende bedieningselement cellen micrometastasen of enkele cel foci opgenomen in longsecties (figuur 2). Bovendien macrometastases waren ook duidelijk zichtbaar in muizen geïnjecteerd met LM8-lacZ cellen dan in dieren geïnjecteerd met de controle LM8 cellen (figuur 2C, D). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figuur 1. Detectie van spontane metastasen van niet-getransduceerde (i-iv) en lacZ-getransduceerde (v-viii) Dunn (A) en LM8 (B) cellen in niet-geperfundeerde (i, ii, v, vi) en geperfuseerd (iii, iv, vii, viii) longen in C3H muizen. Metastasen in representatieve X-Gal-staINED hele longen (v, vii in A en B) en respectieve close-ups (vi, viii in A en B) blauwe kleur. Macrometastatic foci (&gt; 0,1 mm) in de organen van muizen geïnjecteerd met niet-gelabeld LM8 cellen (i-iv in B) zijn aangegeven door sterretjes. Plekken die in close-ups representatief zijn voor de gehele longen. Schaal balken geven 1 mm in beelden van hele longen en 0,1 mm in close-ups. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figuur 2. Detectie van Dunn en LM8 micrometastasen in de longen vriescoupes. Delen van OCT ingebedde longweefsel werden geïncubeerd in X-gal kleuring oplossing bij 37 ° C gedurende 24 uur in een bevochtigde kamer en daarna tegengekleurd met kernechtrood rood. Pijlen wijzen naar micrometastatische foci opgenomen in longsecties van muizen geïnjecteerd met Dunn-lacZ (B) of LM8-lacZ cellen (D). Micrometastases bleef niet detecteerbaar in longsecties van muizen geïnjecteerd met niet-getransduceerde Dunn (A) of LM8 cellen (C). Scale balken geven 0,1 mm.

<ol><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoussens%2C+LM+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 295, 2387-2392 (2002).</li>
<li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li>
<li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538(2011).</li>
<li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li>
<li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li>
<li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+lacZ+gene%3A+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+metastasis+reviews%22%5BJournal%5D)">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li>
<li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li>
<li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li>
<li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+and+cancer+revisited%3A+mechanistic+connections+involving+platelets%2C+P-selectin%2C+carcinoma+mucins%2C+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn%2FLM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li>
<li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+%28LM8%29+with+high+metastatic+potential+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li>
<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier gepresenteerde resultaten in de muis Dunn/LM8 OS model tonen de kracht van de nieuw ingestelde methode die de X-Gal kleuring van lacZ-gelabeld tumorcellen met de in-situ perfusie / fixatie van longweefsel combineert. Deze combinatie van de twee technieken maakt hoge gevoelige detectie van micrometastatische laesies naar de enkele cel en verbetert de visualisatie van macrometastases de long (figuur 1) en in longsecties (figuur 2). Hoewel de X-Gal kleuring kan ook de detectie van (micro) metastasen in andere organen, in-situ perfusie / bevestiging verbetert de detecteerbaarheid van metastatische foci in andere weefsels dan de long lopen omdat de natuurlijke bloed-en weefsel-gerelateerde color Deze organen 13. Zelfs als de perfusie wordt naar een ander orgaan, bijvoorbeeld de lever, de verwijdering van het bloed slechts gedeeltelijk verbeteren contrast betsen X-gal kleuring en de natuurlijke kleur van het orgel. De werkwijze is toepasbaar op elk type lacZ-gelabelde tumorcellen zal drastisch verbeteren van de detecteerbaarheid van longmetastase tot het niveau van de slapende eencellige micrometastasen en maakt een eenvoudige en betrouwbare kwantificering van macro-en micrometastasen. Een beperking van deze werkwijze en alle andere technieken die gebaseerd zijn op reportergenen, zoals luciferase en fluorescerende eiwitten, is de stabiliteit van de transgenexpressie. Zoals weergegeven in figuur 2d, niet alle tumorcellen in de macrometastatic foci blauw gekleurd, hetgeen een gebrek aan beta-galactosidase activiteit. Dit kan gerelateerd aan necrose, maar het is waarschijnlijk te wijten aan een verlies van transgenexpressie. We observeerden dat de Dunn en LM8 cellen zijn zeer effectief in de down-regulatie van lacZ en andere transgenen zelfs onder continue selectie voor expressie. Daarom geschakeld recente studies op de murine K12en K7M2 en de menselijke HOS, 143B en Saos-2 osteosarcoom cellijnen, die alle stabiele lacZ expressie gehandhaafd in vitro als in vivo tot 100% in de tijd. Zodra stabiele lacZ-expressie gegarandeerd kan deze techniek worden toegepast in studies met gen-gemanipuleerde tumorcellen, bijvoorbeeld tot mechanistische onderzoeken proces van kolonisatie weefsel 13 alsmede voor het ontwikkelen en testen van nieuwe therapieën gericht op uitroeiing van metastasen 15 , 16. Verder kan het dienen als een benchmark voor de verbetering van de huidige radiologische beeldvormende technieken, zoals PET, (micro) CT en MRI, gebruikt voor de vroegtijdige opsporing van metastatische laesies. In een recente studie PET (niet gepubliceerd) met verschillende tracers nagegaan in vivo gedetecteerd longmetastasen vervolgens ex vivo met de beschreven protocol. In een lopende studie met een nieuwe kleine dieren micro-CT (SkyScan) zijn we tot nu toe able long metastasen op in vivo tot een grootte van 0,5 mm en ex vivo tot 0,3 mm, maar gericht op een resolutie van 0,1 mm. Interessant, dit is de maximale grootte die we onderscheiden macro-uit micrometastasen met de gecombineerde methode van in-situ perfusie en X-gal kleuring. Hieruit blijkt nogmaals de gevoeligheid en het nut van deze gemakkelijke en kosteneffectieve techniek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamine) </td><td> Vetoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml oplossing </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml oplossing </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazine) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml oplossing </td></tr><tr><td> Bulldog Type Serrefine vasculaire klem </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18.051-35 </td><td> gebogen, 35 mm </td></tr><tr><td> Plastic beker met deksel </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml bekers met deksels </td></tr><tr><td> 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); poeder </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> lossen in N, N-Di-methylformamide tot 40 mg / ml, store licht beschermd bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Basic kleuroplossing, geëquilibreerd op pH 7,1, opgeslagen licht beschermd bij 4 ° C max. 1 maand </td><td> self-made </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% natrium-deoxycholaat </td></tr><tr><td> PolyFreeze Embedding Medium </td><td> Polysciences; Zwitserse distributeur: Brunschwig </td><td> 19.636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Inbedding schimmel </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 cryostaat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost dia&#39;s </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear-Fast Red - Aluminium sulfaat-oplossing </td><td> Divisie Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, Zwitserse distributeur: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia en apparatuur.

verbeterde visualisatie van longmetastasen bij single cell resolutie in muizen van de gecombineerde<em&gt; in-situ</em&gt; perfusie van het longweefsel en x-gal kleuring van<em&gt; lacz</em&gt;-label tumorcellen

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastase is de belangrijkste oorzaak van overlijden in de meeste vormen van kanker en dus een belangrijke focus in het kankeronderzoek. De detectie van micrometastasen van radiologische beeldvorming en het succes in hun therapeutische uitroeiing beperkt blijven. Terwijl diermodellen hebben bewezen van onschatbare waarde voor kankeronderzoek 1, de monitoring / visualisatie van micrometastasen blijft een uitdaging en onnauwkeurig evaluatie van metastatische verspreiding in preklinische studies mogelijk leidt tot teleurstellende resultaten in klinische studies 2. Bijgevolg is er grote belangstelling voor het verfijnen van de methoden om uiteindelijk toe reproduceerbare en betrouwbare detectie van uitzaaiingen naar de enkele cel niveau in normaal weefsel. Het zwaartepunt ligt dus op technieken die de detectie van tumorcellen in vivo mogelijk, zoals micro-computer tomografie (micro-CT), positron emissie tomografie (PET), bioluminescentie of fluorescentie beeldvorming &lt;sup&gt; 3,4. We momenteel optimaliseren van deze technieken voor in vivo monitoring van primaire tumorgroei en metastase in verschillende modellen osteosarcoma. Sommige van deze technieken kunnen ook worden gebruikt voor ex vivo analyse van metastase naast klassieke methoden zoals qPCR 5, 6 of FACS verschillende histologische kleuring. Als referentiepunt, hebben we in de onderhavige studie de stabiele transfectie of transductie van tumorcellen met het lacZ-gen dat codeert voor het bacteriële enzym β-galactosidase dat het chromogene substraat 5-broom-4-chloor-3-indolyl-beta-D metaboliseert -galactopyranoside (X-Gal) aan een onoplosbare indigo blauwe kleurstof 7 en een zeer gevoelige en selectieve histochemische blauwe kleuring van tumorcellen in muizen weefsel ex vivo naar de enkele cel niveau zoals ze zijn. Dit is een low-cost en niet die apparatuur-intensieve tool, die zorgt voor een precieze validatie van metastase 8 in studies waarin de nieuwe eenticancer therapieën 9-11. Een beperkende factor van X-gal kleuring is het lage contrast van bloed-gerelateerde kleuring van goed gevasculariseerde weefsels bijvoorbeeld. In longweefsel dit probleem kan worden opgelost door in-situ longperfusie, een techniek die recent werd door Borsig et al. 12. Die de longen van muizen geperfuseerd onder verdoving om ze van bloed en op te lossen en te bedden in-situ onder inflatie door de trachea. Deze methode voorkomt tevens het uiteenvallen van de longen en daardoor behoudt de morfologie van functionele longblaasjes, waardoor de kwaliteit van het weefsel voor histologische analyse verbetert. In deze studie beschrijven we een nieuw protocol, dat gebruik maakt van een combinatie van X-gal kleuring van lacZ tot expressie brengende tumorcellen en in-situ perfusie en bevestiging van longweefsel. Deze verfijnde protocol maakt hoge gevoeligheid detectie van enkele metastatische cellen in de longen en stelde ons in staat in een recente studie aan detect &quot;slapende&quot; long micrometastasen in een muizenmodel 13, oorspronkelijk beschreven als niet-metastatische 14.

De nieuwe protocol gerapporteerd in deze studie kan selectieve detectie van longmetastasen in cel resolutie in muizen door gecombineerde<em&gt; In-situ</em&gt; Longperfusie en fixatie en X-Gal kleuring van<em&gt; LacZ</em&gt;-Gelabeld tumorcellen.

Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusie van het longweefsel en X-gal kleuring van<em&gt; LacZ</em&gt;-Label tumorcellen

Metastasering is de belangrijkste doodsoorzaak bij de meeste kankertypes en is bijgevolg een centraal aandachtspunt in het kankeronderzoek. De detectie van ...

Het algemene doel van deze procedure is om de detectie van micrometastasen in de long van de muis ex vivo te verbeteren, terwijl de architectuur van de opgeblazen longen behouden blijft. Dit wordt bereikt door de long eerst in situ te perfunderen met PBS om het bloed te verwijderen, wat de belangrijkste bron is van kleurachtergrond in dat weefsel. De volgende stappen zijn het opblazen van de long door injectie van PFA, waarna deze wordt afgeknepen om het longweefsel onder inflatie te fixeren.Vervolgens wordt de long verwijderd en verder gefixeerd in PFA, of worden individuele longlobben ingebed voor cryosectie. De laatste stappen bestaan uit het kleuren van de weefsels in Xal-oplossing en het visualiseren van de LA zag-tumorcellen; uiteindelijk kunnen metastasen in volledige longlobben of in longweefselcoupes tot op het niveau van individuele cellen worden gedetecteerd met een binoculair microscoop of een lichtmicroscoop. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de sky standing on its own, is dat de detecteerbaarheid van micrometastasen aanzienlijk is verbeterd door de verwijdering van bloedgerelateerde achtergrond.Begin het protocol door een muis te anesthetiseren met een intraperitoneale injectie van ketamine, xylazine en acepromazine in ongeveer 150 µL PBS. Wanneer de pijnreflexen van de muis niet langer waarneembaar zijn, wordt deze gefixeerd op de operatietafel. Scheer de rugzijde en maak het haar glad met 70% ethanol.Open de huid vanaf de buik tot aan de nek. Trek de huid naar de zijkanten of verwijder deze. Open voorzichtig het peritoneum in de thorax om ruptuur van grote vaten, zoals de venae jugulares, te voorkomen.Dit zal de efficiëntie van de perfusie verbeteren. Snijd nu de vena cava cardis onder de lever door met een spuit van 20 milliliter voorzien van een naald met een gauge van 21 tot 24. Injecteer langzaam 10 tot 15 milliliter PBS in de rechterventrikel van het kloppende hart totdat de long volledig wit is en het hart stopt met kloppen.Klem vervolgens de bloedvaten boven de lever en het diafragma af met een vaatklem. Vul een spuit van 10 milliliter met 3% paraformaldehyde en injecteer ongeveer twee milliliter in de rechterventrikel met een naald van 21 tot 24 gauge.Leg de trachea buiten de thorax vrij en ventileer de long door vanuit de thorax ongeveer drie milliliters aldehyde in de trachea te injecteren. Knijp direct na het verwijderen van de naald de trachea af bij de punctiestelle met een vaatklem en wacht 10 minuten om fixatie mogelijk te maken. Transecteer vervolgens de bloedvaten boven de vaatklem.Verwijder vervolgens de klem en injecteer ongeveer twee milliliters PBS in de rechterventrikel om overtollig formaldehyde te verwijderen. Puncleer de onderste delen van alle longkwabben met een naald en verwijder de vasculaire klem bij de trachea. Injecteer nu drie tot vijf milliliters verdunde inbeddingsoplossing in de trachea, in tegenovergestelde richting van de andere injectie.Stop de injectie wanneer het paraformehyde in de longkwabben is vervangen door de oplossing. Verwijder de long zorgvuldig door het hart met een pincet naar buiten te trekken en door het bindweefsel, de ligamenten, de bloedvaten en de trachea door te snijden. Zorg ervoor dat het hart met de longen verbonden blijft.Zet één lob opzij voor cryosneden en gebruik het resterende longweefsel voor kleuring van de gehele long. Plaats de long in een plastic beker met een goed sluitend deksel en fixeer deze met 2% formaldehyde en PBS. Leg een stukje gaas bovenop de long om deze in de oplossing te houden en laat dit 30 minuten bij kamertemperatuur staan.Verwijder na een half uur de fixatieoplossing en was het weefsel grondig drie keer met PBS. Bereid de gebruiksklare Xal-oplossing vers door één milliliter Xal-stockoplossing in een verhouding van 1:40 te verdunnen in de basiskleuringsoplossing en voeg er ten minste 10 milliliters van toe aan het bakje. Dompel de long onder met een stukje gaas. Sluit het deksel losjes om luchtuitwisseling mogelijk te maken en incubeer het gedurende drie tot vijf uur bij 37 °C, beschermd tegen licht.Verwijder na de incubatie de xal-oplossing. Spoel de longen eenmaal met PBS om resterende xal-oplossing te verwijderen en voeg ten minste 10 milliliters 4%paraform aldehyde in PBS toe. Het weefsel is nu klaar voor histologie en kan langdurig worden bewaard in de 4%PFA bij vier graden Celsius.Begin met het vullen van één derde van een inbedmal met onverdund poly forze inbedmedium. Plaats vervolgens de longkwab in de mal en voeg medium toe totdat de kwab volledig is bedekt. Vermijd zorgvuldig de vorming van luchtbellen en incubeer de ingebedde kwab vervolgens gedurende 20 minuten bij 4 °C.Bereid vervolgens de ingebedde longen voor op het maken van coupes door ze langzaam te bevriezen in een mengsel van droogijs en isopentaan. Indien nodig kunnen ze nu worden overgebracht naar een vriezer van -80 °C voor bewaring. Snijd op een cryostaat cryocoupes van 7 tot 10 micron van de lob. Monteer de coupes op commercieel verkrijgbare cryosectie-glazen. Zodra ze zijn gemonteerd, worden de coupes onmiddellijk 24 uur lang bij 37 °C geïncubeerd in XAL-kleuringsoplossing in een bevochtigde kamer. Spoel de glazen de volgende dag twee keer gedurende vijf minuten per spoelbeurt met PBS.Volg dit met een kort spoelen in gedestilleerd water. Zet de coupes nu tegen met nuclear fast red gedurende 10 seconden om een zwakke tegenkleuring te verkrijgen waardoor de xal dominanter wordt, en spoel de tegenkleuring onmiddellijk af met gedestilleerd water. Voor een donkerdere tegenkleuring kan de tijd worden verlengd tot 30 seconden of langer.Monteer de preparaten met immuno mount. De vorming van metastasen in de done LM eight muis-OS-modellen werd opnieuw onderzocht. Gebruik hiervoor de beschreven representatieve afbeeldingen van geperfuseerde en niet-geperfuseerde longen van muizen die gelijktijdig werden geïnjecteerd met laxy-getransduceerde en niet-getransduceerde controle done- en LM eight-cellen in muizen die werden geïnjecteerd met controle done-cellen.Macroscopische en microscopische metastasen bleven ondetecteerbaar in niet-geperfuseerde en geperfuseerde longen. Interessant genoeg onthulde xgl-kleuring bij muizen die waren geïnjecteerd met dun LA Z-cellen echter blauwe micrometastatische foci van individuele cellen of kleine celclusters op het oppervlak van niet-geperfuseerde longen; in situ perfusie en fixatie van de longen verbeterden de detecteerbaarheid van dun la z-micrometastasen verder. De uitgroei tot macroscopische foci werd echter niet waargenomen bij muizen die waren geïnjecteerd met controle LM acht-cellen. Translucente, nauwelijks detecteerbare macro-metastatische foci met een diameter groter dan 0,1 millimeter werden herkend in niet-geperfuseerde longen. Perfusie van de longen verbeterde de detectie van de foci niet.Echter, bij muizen die waren geïnjecteerd met ate LAC Z-cellen, werden meerdere X gal-blauw gekleurde macrometastasen gedetecteerd op het oppervlak van niet-geperfundeerde organen. Ook micrometastasen werden gedetecteerd op het oppervlak van niet-geperfundeerde organen. Bovendien verbeterde perfusie van de longen de detecteerbaarheid van macro- en micrometastasen verder.Bijgevolg werden micro- en macrometastasen zichtbaar met een hogere dichtheid en in groter aantal, hoofdzakelijk door de translucentie van het geperfuseerde weefsel, waardoor ook foci onder het organoppervlak zichtbaar werden. Een aanvullende histologische analyse met cryosecties van longweefsel bevestigde de verbeterde detecteerbaarheid van longmetastasen bij muizen die waren geïnjecteerd met LAX Z-getransduceerde done- en LM eight-cellen, en bij muizen met primaire tumoren afgeleid van Dun LAX Z-cellen. Micrometastasen of zelfs single-cell foci werden herkend in de longsecties.Dit werd niet waargenomen bij muizen met primaire tumoren van de respectievelijke controlecellen. Bovendien waren macro-metastasen duidelijker zichtbaar bij muizen die waren geïnjecteerd met LM eight LA C-cellen dan bij dieren met de controle LM eight-cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van longperfusie en fixatie in ZI twee en de daaropvolgende exci-kleuring van de metastasen in de uitgebeelde longen.Deze techniek is een zeer gevoelige endpoint-meting voor de distributie van metastasen in de long bij elk type kankerstudie, en kan tevens dienen als benchmark voor de verbetering van huidige in vivo beeldvormingstechnieken, zoals micro CT, PET en MRI, die worden gebruikt voor de vroege detectie van metastatische laesies.

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.

Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Dit protocol beschrijft het gebruik van multifotonmicroscopie om longtermijn, hoog-resolutie, enkelcellimago van de intacte long in real time uit te voeren met behulp van een vacuüm gestabiliseerd beeldvormingsvenster.

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Een dierlijk model is nodig om het ontcijferen van de rol van circulerende tumorcellen (CTCs) bij de bevordering van longkanker kolonisatie tijdens kanker uitzaaiingen. Hier, we vastgesteld en met succes uitgevoerd een in vivo assay op specifiek proef de eis van polymere fibronectine (polyFN) vergadering over CTCs voor longkanker kolonisatie.

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.

Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Deze studie presenteert een orthotopisch model voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC) op basis van intrapulmonale inoculatie van meercellige sferoïden van fluorescerende A549-iRFP-cellen. Het model recapituleert klinische NSCLC-stadia en reageert op cisplatine, volgens dynamische in vivo monitoring van fluorescentie met lange golflengten.

Constructie van een orthotopisch xenotransplantaatmodel van niet-kleincellige longkanker dat ziekteprogressie nabootst en geneesmiddelactiviteiten voorspelt

Een grote uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor longkanker is het modelleren van de micro-omgeving van de tumor naarmate de regionale ziekte evolueert naar gemetastaseerde ziekte. Hier beschrijven we een eenvoudige methode om een orthotopisch syngeen model van longkanker op te stellen dat het mogelijk maakt om in vivo de ziekte in de loop van de tijd te volgen.

Een minimaal invasieve methode voor het genereren van een syngeen orthotopisch muismodel van longkanker

Leer een verbeterde methode voor het detecteren van longmetastasen bij muizen op enkelvoudige celniveau met behulp van in-situ perfusie en X-Gal kleuring. Deze techniek vermindert bloedachtergrond aanzienlijk.

Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde In-situ Perfusie van het longweefsel en X-gal kleuring van LacZ-Label tumorcellen (Video) | JoVE Journal

Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde

Meer video's verkennen