Uitgebreide Profilering van Dopamine verordening in de substantia nigra en het ventrale tegmentale gebied

Het algemene doel van deze procedure is om de informatie van de moleculaire readouts geassocieerd met de regulatie van dopamine te maximaliseren vanuit een enkele weefseldissectie van de somatodendritische regio's van de middenhersenstam. Dit wordt bereikt door eerst een nauwkeurige dissectie uit te voeren om de substantia nigra te scheiden van het ventrale segmentale gebied. De tweede stap is het verwerken van de weefsels voor de analyse van dopamine via HPLC en verdere verwerking van het geprecipiteerde endogene eiwit voor analyse.

Vervolgens maakt de verwerking van het neergeslagen eiwit voor het totale eiwitgehalte het mogelijk om te bepalen welke dopamine-regulerende eiwitten of eiwitfosforylaties kunnen worden gemeten in samenhang met de bepaling van de dopamineconcentratie in het weefsel van de monster. Uiteindelijk maken de analyses van dopamine en de regulerende eiwitten in de specifieke somatodendritische regio's van de middenhersenen het mogelijk om conclusies te trekken over de moleculaire mechanismen die geassocieerd zijn met de dopamineregulatie.

Monoaminen beïnvloeden veel gedragsmatige uitkomsten, en onderzoekers op het gebied van verslaving, biologie en locomotorische dysfunctie, zoals met name bij de ziekte van Parkinson, zijn dan ook zeer geïnteresseerd in hoe monoaminen zoals dopamine, die wij in mijn laboratorium bestuderen, gedragsmatige uitkomsten beïnvloeden. De relevantie van het bestuderen van monoaminen wordt echter verder vergroot als we begrijpen hoe ze op moleculair niveau worden gereguleerd. Het voordeel van onze techniek is dat we uit één enkel monster, verkregen uit weefsel van het centraal zenuwstelsel, meerdere meetwaarden kunnen halen; zo kunnen we een volledig beeld krijgen van hoe moleculaire gebeurtenissen de dysregulatie van monoaminen beïnvloeden.

We kunnen deze gegevens vervolgens in de context plaatsen van hoe het gedrag beïnvloed zal worden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de bepaling van eiwit en fosforylering kennis vereist over hoeveel totaal eiwit er nodig is voor een nauwkeurige aflezing, afhankelijk van de door de onderzoeker gekozen antilichamen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel.

De dissectietechnieken en de bepaling van mono-gemiddelden met de regulerende eiwitten vormen een relatief nieuwe benadering voor het analyseren van regulatie in vivo. Om deze procedure te starten, koelt u de rodentenbreinmatrix, een petrischaal met vijf scheermesjes en een scalpel nummer 11 op een bed van nat ijs. Koel daarnaast zoveel mogelijk buisjes als nodig voor de dissectie voor op droog ijs.

Verwijder na het offeren van een rat de hersenen en plaats deze ondersteboven, waarbij het laterale cerebellum in de inkepingen van de ijskoude matrix past. Plaats na een minuut de koude scheermesjes in de koele hersenen, beginnend ongeveer twee millimeter rostraal van het chiasma opticum voor de analyse van het striatum en de nucleus accumbens. Plaats vervolgens de koude scheermesjes in secties van elke één millimeter tot het midden van de pons; verspring de plaatsing van elk scheermesje om de verwijdering uit de matrix te vergemakkelijken.

Kijk bij het verwijderen van de scheermesjes naar het begin van de hippocampus; dit is de beste leidraad om de aanwezigheid van de SN en de VTA te bevestigen op de locatie waar de hippocampus het middenbrein volledig omhult. Neem coupes met het scalpelblad nummer 11 om eerst de SN van de VTA te disseceren. Verwijder de bovenliggende cortex en hippocampus.

Maak vervolgens een verticale snede om het gepigmenteerde gebied van de SN te scheiden van de VTA, waarbij u ervoor zorgt dat het scheermes tijdens de dissectie constant in contact blijft met het natte ijs. Maak daarna een horizontale snede op of nabij de middellijn, net boven het dorsale en meest laterale deel van de SN. Scheid tot slot de SN voorzichtig van de rest van de hersenstam.

Zodra de SN is verwijderd, wordt de VTA voorzichtig gescheiden van de rest van de midbrain. Plaats de gedissecteerde weefsels onmiddellijk in vooraf gekoelde microcentrifugebuisjes. Bewaar de weefsels vervolgens bij -80 °C tot ze klaar zijn voor verwerking.

Homogeniseer in deze procedure het weefsel voorzichtig direct na verwijdering van het droogijs met een ijskoude 0,1 molaire perchloorzuur-EDTA-oplossing. Bewaar de monster daarna opnieuw op droogijs. Centrifugeer de monsters vervolgens bij 12.000 RPM om een sediment te verkrijgen.

Het eiwitprecipitaat dat gebruikt zal worden voor western blot-bepalingen; zuig vervolgens de supernatanten op in het HPLC-vloeitje. Plaats de nog bevroren geprecipiteerde eiwitpellets, verkregen uit de HPLC-bufferbehandeling, op nat ijs om te ontdooien en zorg ervoor dat alle buffer is verwijderd en gearchiveerd. Voeg voor bilaterale verwerking van de SN 300 µL 1% SDS met vijf mM tris en één mM EDTA toe aan het precipitaat en soniceer; voor bilaterale verwerking van de VTA zijn 200 µL 1% SDS voldoende.

Plaats de monsters vervolgens ongeveer vijf minuten in kokend water om de eiwitdenaturatie te voltooien. Laat ze daarna afkoelen tot kamertemperatuur en zorg er in deze stap voor dat de doppen goed vastzitten. Voer vervolgens de BCA-assay uit met een eiwitstandaardcurve variërend van 2 tot 40 µg eiwit.

Om de eiwitconcentratie in de monsters van vijf microliter te bepalen, gebruikt u de mediaanwaarde uit een triplikaatanalyse om de eiwithoeveelheid aan de hand van de standaardcurve vast te stellen. Deel dit resultaat door het monstervolume om de eiwitconcentratie te berekenen. Bereid daarna de monsters, indien nodig, voor met de monsterbuffer die DIO three etol bevat voor reducerende SDS-elektroforese op een 10% acrylamidegel, zoals aangegeven door de kleur van de monsterbuffer.

Verander de kleur naar geel en voeg één molar tris-basis pH 8,2 in stappen van 10 µL toe aan het monster totdat de blauwe kleur zichtbaar is. Om de juiste pH te waarborgen, wordt de passende hoeveelheid totaal eiwit via SDS-PAGE op een 10% acrylamidegel geanalyseerd; breng de eiwitten vervolgens over naar nitrocellulose met een poriegrootte van 0,45 micron. Stel de Hoffer-tank in op ten minste 27 volt en laat de transfer gedurende de nacht plaatsvinden.

Laat de blot de volgende dag gedurende ten minste 30 minuten drogen. Kleur de blot vervolgens ongeveer vijf minuten met een poncho S-oplossing. Ontkleur de blot daarna grondig met een 0,2% zoutzuuroplossing totdat de individuele eiwitbanden duidelijk zichtbaar zijn en de achtergrondkleuring is verdwenen.

Maak vervolgens met ImageJ een afbeelding van de ponceau S-kleuring om de relatieve eiwitbelading in elke baan verder te kwantificeren en de resultaten van tyrosinehydroxylase, dopaminetransporteur of vesiculaire monoaminetransporteur twee te normaliseren; hier is de western blot van Ser31 gefosforyleerd tyrosinehydroxylase in de monsters van de substantia nigra van de rat. De gekalibreerde Ser31 gefosforyleerd tyrosinehydroxylase-standaardcurve loopt van 0,3 nanograms tot 2,0 nanograms en bevindt zich binnen het lineaire detectiebereik. Hier is de western blot van Ser40 gefosforyleerd tyrosinehydroxylase in de monsters van de ventrale tegmentale area van de rat.

De gekalibreerde SN 40 gefosforyleerde tyrosinehydroxylase-standaardcurve varieert van 0,2 nanogram tot 1,5 nanogram en bevindt zich binnen het lineaire detectiebereik. Het handhaven van de juiste temperatuur is belangrijk, evenals het labelen van de buizen. Het is daarnaast essentieel om de hoeveelheid eiwit te normaliseren om de variantie van uw resultaten te verkleinen.

Wanneer dit protocol nauwgezet wordt gevolgd, kan het onderzoekers op het gebied van locomotieve functie en verslavingsgedrag uitgebreide moleculaire read-outs verschaffen die de monoamine-regulatie en de hersenen beïnvloeden, met name dopamine, waar wij in geïnteresseerd zijn. Als gevolg hiervan kunnen deze read-outs een zeer gedetailleerde en grondige analyse geven van wat dit betekent voor gedragsuitkomsten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de read-outs van monoamine-regulatie in de substantia nigra en de ventrale tegmentale area uit een enkele weefseldissectie kunt maximaliseren.