Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

Het algemene doel van deze procedure is om hemocyten uit wilde rupsen te extraheren, te visualiseren en te tellen. Dit wordt bereikt door de rups eerst te anesthetiseren door deze op ijs te plaatsen, een bufferoplossing met een antistollingsmiddel te injecteren en de rups vervolgens terug op het ijs te plaatsen zodat de hemocyten opnieuw in de circulatie kunnen treden vóór de extractie. De tweede stap is het maken van een ondiepe incisie aan het posterieure uiteinde van de rups met een schoon scalpel.

Vervolgens wordt de rups voorzichtig samengedrukt met een zachte pincet. Daarna wordt het mengsel van bufferoplossing en hemolymfe opgezogen met een micropipet en verzameld in een microcentrifugebuisje. De laatste stap is om de hemolymfe-oplossing voorzichtig te mengen met een gelijk volume bufferoplossing en 10 µL van de oplossing over te brengen naar een hemocytometer om de hemocyten te visualiseren en te tellen.

Uiteindelijk kan deze methode voor hemocytenextractie worden gebruikt als een snelle en effectieve manier om hemocyten van verschillende rupssoorten te tellen en behouden als hulpmiddel om fysiologische aspecten van de cellulaire immuunrespons van de insecten te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om hemolymfe te extraheren uit rupsen met zeer gereduceerde prolegs. Andere rupsmodellen worden bloedgezogen door een van de prolegs door te snijden, waarna de hemocyten uit de uitstromende vloeistof worden geëxtraheerd.

Daarnaast kan deze techniek worden gebruikt om hemolymfocyten uit andere insectensoorten te extraheren. Deze methode kan worden ingezet om kernvragen binnen het vakgebied van de eco-immunologie te beantwoorden, zoals de vraag hoe de cellulaire immuunrespons van insecten varieert afhankelijk van de kwaliteit van het dieet, het ontwikkelingsstadium of de blootstelling aan verschillende pathogenen. Om deze procedure te starten, worden de larven in het voorlaatste stadium geanestheseerd door ze 20 minuten op ijs te koelen voorafgaand aan de extractie van de hemocyten.

Plaats daarna het stompe uiteinde van een schone capillaire naald van 16 gauge in de slang die is verbonden met een glazen spuit van 20 milliliter. Laat de buis met de opvangoplossing openstaan op de laboratoriumbank. Vul de capillair langzaam met ongeveer 10 tot 15 µL buffer.

Plaats de naald vervolgens in een bolletje klei dat naast de dissectiemicroscoop is geplaatst. Plaats de rups in een Petrischaal. Het insect moet op zijn zij worden gepositioneerd, zodat de sferulen duidelijk zichtbaar zijn.

Houd de rups met een pincet op zijn plaats terwijl u deze onder een dissectiemicroscoop bekijkt en plaats de naald dicht bij een van de sferulen, waar de insectencuticula doorgaans zachter is. Druk vervolgens de capillaire naald voorzichtig tegen het lichaam van het insect. Zodra de naald de cuticula is binnengedrongen, injecteert u het totale volume van de oplossing in de rups.

Het lichaam van de rups zal na de injectie opzwellen, maar het mag niet openbarsten of lekken. Plaats de rups terug in de gekoelde Petrischaal. Positioneer het insect op de rug om te voorkomen dat de buffer uit de wond lekt.

Herhaal de injecties voor elke rups die wordt gebruikt voor de extractie van hemolymfe. Laat alle insecten vervolgens 30 minuten op ijs afkoelen. Plaats de rups nu in een Petrischaal onder de dissectiemicroscoop.

Maak voorzichtig een ondiepe incisie van ongeveer twee tot drie millimeter in de posterieure regio van de rups met een steriel scalpel, zonder de darmen of andere inwendige organen te beschadigen. Knijp vervolgens zachtjes in de rups met een flexibele plastic pincet, terwijl u ongeveer 10 tot 20 µL van de hemolymfe opvangt met een pipetpunt van 10 µL. Wees opnieuw voorzichtig om het inwendige weefsel niet te beschadigen.

Vervolgens worden de resten van de rupsen weggegooid. Verzamel de hemolymfe van elke rups in afzonderlijke, gelabelde gesiliconiseerde microcentrifugebuisjes van 0,5 milliliter. Voeg daarna ongeveer 10 tot 20 µL van de incubatieoplossing toe aan elk verzameld hemolymfemonster van een individuele rups.

Houd de hemolymfmonsters in deze stap te allen tijde op ijs. Meng het hemolymfmonster en de incubatieloplossing direct voorafgaand aan het tellen van de hemocyten.

Deze behandeling maakt een correcte scheiding van de hemocyten mogelijk en voorkomt klontering. Gebruik een schone pipetpunt om 10 µL van het hemolymfemonster, gemengd met de incubatieloplossing, over te brengen naar een hemocytometer. Tel vervolgens met behulp van een samengestelde microscoop het aantal hemocyten in ten minste 15 van de grote vierkanten van het centrale raster van de hemocytometer en noteer dit.

Tel deze waarden bij elkaar op om het totaal aantal hemocyten in de 15 vakken te verkrijgen. Spoel vervolgens de hemocytometer en het dekglas grondig af met een spuitfles met gedestilleerd en gedeïoniseerd water. Maak het daarna droog met Kimwipes.

Herhaal de procedures voor de resterende hemo lymf-monsters en bereken het gemiddelde aantal hemocyten per milliliter hemo lymf-volume voor elke rups. De brightfield microscopie-afbeelding toont de geëxtraheerde hemocyten van nucle hin ai rupsen bij een 20 x vergroting. Na deze procedure kunnen de verzamelde hemocyten worden gebruikt om de cellulaire immuunrespons te bestuderen en assays op te zetten zoals fagocytose en cap, selecte inkapseling en pH oxidase-activiteit.

Daarnaast kunnen RNA, DNA en eiwitten ongebruikt worden ingezameld voor verdere assays om deze cellulaire immuunrespons bij insecten te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe rupsen geïnjecteerd moeten worden voor het extraheren van hemolymfe en hoe hemolymfe die levende hemocyten bevat moet worden ingezameld.