Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

Het algemene doel van deze procedure is om de he ccytes uit wilde rupsen te extraheren, visualiseren en tellen. Dit wordt bereikt door eerst de rups te verdoven door hem op ijs te plaatsen, hem te injecteren met een bufferoplossing die een anticoagulans bevat en de rups terug te brengen naar het ijs om de he ccytes toe te laten de circulatie te hervatten voordat ze worden geëxtraheerd. De tweede stap is om een ondiepe insnijding te maken aan de achterkant van de rups met behulp van een schone scalpel.

Vervolgens wordt de rups voorzichtig geperst met behulp van zachte pincetten. Daarna wordt de bufferoplossing-hemolymfemix aangezogen met behulp van een micropipet en verzameld in een microcentrifugebuisje. De laatste stap is om de hemolymfe-oplossing voorzichtig te mengen met een gelijk volume bufferoplossing en 10 microliter van de oplossing over te brengen naar een hemo cytometer om het aantal he ccytes te visualiseren en tellen.

Uiteindelijk kan deze methode voor hemo cyt-extractie worden gebruikt als een snelle en effectieve methode om he ccytes van verschillende rupsensoorten te tellen en behouden als een hulpmiddel om fysiologische aspecten van de cellulaire immuunrespons van insecten te onderzoeken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om hemo sotten uit rupsen te extraheren met zeer beperkte prox. Andere rupsenmodellen worden gepunct door een van de pros te snijden, waarbij he ccytes uit de vloeistof die eruit komt worden geëxtraheerd.

Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om hemotype uit andere insectensoorten te extraheren. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen op het gebied van eco-immunologie te beantwoorden, zoals hoe de cellulaire immuunrespons van insecten varieert met de kwaliteit van het dieet, de ontwikkelingsfase of blootstelling aan verschillende pathogenen. Om deze procedure te starten, verdooft u de laatste instar larven door ze 20 minuten op ijs te koelen voorafgaand aan het extraheren van he ccyten.

Daarna past u het stompe uiteinde van een schone capillaire naald van 16 gauge in de slang die is verbonden met een glazen spuit van 20 milliliter. Laat de buis met de oplossing open op de laboratoriumtafel liggen. Vul de capillair langzaam met ongeveer 10 tot 15 microliter buffer.

Leg vervolgens de naald op een bal klei die naast de dissectiemicroscoop is geplaatst. Plaats de rups in een petrischaal. Het insect moet op zijn zij worden gepositioneerd zodat de bolvormige cellen duidelijk zichtbaar zijn.

Terwijl u onder een dissectiemicroscoop kijkt, houdt u de rups op zijn plaats met een paar pincetten en plaatst u de naald dicht bij een van de bolvormige cellen waar de insectcuticula over het algemeen zachter is. Druk vervolgens voorzichtig de capillaire naald tegen het lichaam van het insect. Zodra de naald de cuticula heeft doorboord, injecteert u het totale volume van de oplossing in de rups.

Het lichaam van de rups zal opzwellen na de injectie, maar het mag niet barsten of lekken. Breng de rups terug naar de ijspetrischaal. Positioneer het insect op de rug om te voorkomen dat de buffer uit de wond lekt.

Herhaal de injecties voor elke rups die wordt gebruikt voor hemo limp-extractie. Laat vervolgens alle insecten 30 minuten op ijs koelen. Plaats nu de rups in een petrischaal onder de dissectiemicroscoop.

Maak voorzichtig een ondiepe insnijding van ongeveer twee tot drie millimeter lang in de achterste regio van de rups met behulp van een steriele scalpel zonder de darmen of andere interne organen te beschadigen. Knijp vervolgens de rups voorzichtig met behulp van een paar flexibele plastic pincetten terwijl u ongeveer 10 tot 20 microliter van de hemo limp-mix verzamelt met een 10 microliter-pipettip. Wees opnieuw voorzichtig om de interne weefsels niet te verwonden.

Verwijder daarna de restanten van de rups. Verzamel de hemo limp van elke rups in aparte gelabelde gesiliconiseerde microcentrifugebuisjes van 0,5 milliliter. Voeg vervolgens ongeveer 10 tot 20 microliter van de incubatieoplossing toe aan elk hemo limp-monster dat is verzameld van een individuele rups.

Bewaar de hemolymfeprøver altijd op ijs in deze stap. Meng de hemolymfeprøve en de incubatieoplossing onmiddellijk voor het tellen. He ccyten.

Deze behandeling zorgt voor een goede scheiding van he ccyten en voorkomt klontering. Gebruik een schone pipettip om 10 microliter van het hemo lymph-monster gemengd met de incubatieoplossing over te brengen naar een hemo cytometer. Tel vervolgens met behulp van een samengestelde microscoop en noteer het aantal he ccyten in ten minste 15 van de grote vierkantjes van het centrale raster van de hemo cytometer.

Tel deze waarden bij elkaar op om een totaal aantal he ccyten in de 15 vierkantjes te verkrijgen. Spoel vervolgens de hemo cytometer en het dekglas grondig met behulp van een wasfles met gedistilleerd en gedeïoniseerd water. Veeg het vervolgens droog met Kim-doekjes.

Herhaal de procedures voor de rest van de hemo limp-monsters en bereken het gemiddelde aantal he ccyten per milliliter hemo limp-volume voor elke rups. De lichtveldmicroscoopafbeelding toont de geëxtraheerde he ccyten uit nucle hin ai-rupsen bij een 20 x vergroting. Na het volgen van deze procedure kunnen de verzamelde hemo ccyten worden gebruikt om de cellulaire immuunrespons te bestuderen en om assays zoals fagocytose en cap, selectieve encapsulatie en pH-oxidase-activiteit op te zetten.

Bovendien kunnen R-N-A-D-N-A en eiwit ongebruikt worden verzameld voor verdere assays om deze cellulaire immuunrespons bij insecten te bestuderen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u rupsen moet injecteren voor het extracteren van hemolymf en hoe u hemolymf met levende he ccyten kunt verzamelen.