Name: Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis Cryptosporidium En Giardia spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Leer een kosteneffectieve methode voor het detecteren van watergebonden Cryptosporidium en Giardia spp. met behulp van tangentiële stroom holle-vezel ultrafiltratie en immunomagnetische scheiding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Ann Grimm en Michael Zimmerman bedanken voor kritische evaluatie van dit manuscript en Doug Hamilton voor zijn technische ondersteuning.

1. Tangentiële Flow holle-vezel Ultrafiltratie Procedure <ol><li> Voorbereiding van de buffers en oplossingen: Elutie Oplossing (1 L): Om 1 liter reagens kwaliteit water toe te voegen 0,1 g natriumpolyfosfaat, 0,1 ml Tween-80 en 0,01 ml Y-30 antischuim. </li><li> Bereid filter (figuur 1) in een biologisch veiligheidskabinet: <ol><li> Plaats Masterflex I / P 73 lab slang door een Masterflex I / P Easy-Load pompkop is aangesloten op een Masterflex I / P precisie borstelloze aandrijving. </li><li> Zet de slang op een 0-60 psi, glycerine gevulde manometer voorzien van een NPT branch T-aansluiting stroomopwaarts van de pomp met een schroef klem en een HDPE T-connector stroomafwaarts van de pomp. </li><li> Monteer de retentaat fles door het aanbrengen van een Nalgene 53-B vulling / ontluchting dop met Masterflex L / S 15 lab slang en een T-connector en zet deze vast aan een 1 L Nalgene zware polypropyleen fles. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 slangen wet een snuifje klem (knijpklem 2) en sluit hem uit het retentaat fles om de HDPE T-connector. </li><li> Sluit de Masterflex L / S 24 lab slang van de manometer aan de Asahi Kasei Rexeed 25S high-flux kunstnier met een schroef klem, en van de kunstnier op de retentaat fles. Gebruik maat DIN adapters ter ¼ &quot;ID buis te passen aan de slang verbinding met de holle vezel ultrafilter. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 lab buis met een snufje klem (knijpklem 1) en sluit hem aan op een 10 ml plastic pipet met de punt en katoen plug verwijderd op te treden als het monster opname lijn en dan de slang hechten aan de HDPE T- connector. </li><li> Bevestig een uiteinde van Masterflex L/S-36 lab buis met een helling klem en de slang aansluiten op de effluent-poort die zich bij de uitgang einde van het filter. Plaats het andere uiteinde in de afvalcontainer. </li></ol></li><li> Voeg 0,01% (w / v) natriumpolyfosfaat de 10 l water monster en meng gedurende 3 minuten. </li><li> Sluit knijpklem 2en verwijder de ontluchting dop van de retentaat fles. Alle andere klemmen moeten open. </li><li> Stel de pomprichting de vloeistof verplaatsen van de T-connector de manometer (rechts naar links volgende figuur 1). Pas de snelheid van de pomp tot 25% van de maximale snelheid en zet de pomp. </li><li> Wanneer de retentaat fles is 2/3 vol, open knijpklem 2 en snel de ontluchting dop te vervangen door het retentaat fles. Controleer of alle van de lijnen en fittingen om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn. </li><li> Verhoog langzaam het toerental van de pomp om de gewenste filtratie snelheid (ongeveer 1,5 L / min), het controleren op lekken. Met behulp van een maatcilinder en een timer of een debietmeter, controleer dan het filtraat van het water verlaten van het effluent lijn (blauw L / S 36 slangen in Figuur 1). Luchtbellen typisch gevormd aan het uitgangseinde van de filter waardoor het moeilijk om een ​​stabiel druk en filtratie bereiken. Dit wordt gecorrigeerd door te knijpen het effluent lijn met de hand voor een moment. Deze actiezal de luchtbel in het algemeen coax aan het filtraat haven en om af te sluiten via de afvoerleiding. Herhaal indien nodig, in gedachten houden dat erwt grootte luchtbellen vaak onvermijdelijk zijn. </li><li> Controleer de filtratie proces. Meet en opnemen van de druk en de filtratiesnelheid nodig. De druk mag nooit hoger zijn dan 20 psi. Het wordt aanbevolen om de filtratiesnelheid niet moet 2,0 L / min overschrijden. Het is belangrijk dat de hoeveelheid water in het retentaat fles worden gewaakt dat het niet leeg. Het is normaal dat het volume te verhogen of te verlagen iets. Als het water volume in het retentaat fles lager is dan 1/3 vol, verwijder dan de ontluchting dop en dicht knijpen 2 klemmen op de retentaat bottellijn. Breng water aan tot ongeveer 2/3 vol, opent u de klem en snel de plaats van de ontluchting dop, zorgen voor een goede afdichting. Als het volume in het retentaat fles valt snel en continu, dan zorgen voor de retentaat fles deksel vast zit en de ontluchting dop stevig op zijn plaats, en dat de Tubing nog in contact met het monster. Als deze problemen niet worden voorkomen, dan is het waarschijnlijk dat de afdichting in het retentaat fles deksel slecht is en moet worden vervangen. </li><li> Wanneer het monster container leeg is, onmiddellijk dicht knijpen klem 1, het toerental van de pomp te verlagen tot 20% van zijn maximum, verwijder de ontluchting dop van de fles retentaat en sluit de oprit klem. </li><li> Pas het volume van het monster in het retentaat fles tot ongeveer 200 ml door het aandraaien of losdraaien van de ramp klem. Nadat het volume is ongeveer 200 ml, draai de oprit klem voor de elutie stappen (1.11-1,12). </li><li> 500 ml elutie-oplossing aan de monsterhouder en spoel de binnenkant van de container. Plaats de pipet van 10 ml is aangesloten op het monster opname lijn in de container die de elutie oplossing bevat. Zorg ervoor dat de helling klem gesloten is. Open snufje klem 1 en dicht knijpen tijdelijk vast te klemmen 2 tot en met het opstellen van de elutie-oplossing. </li><li> Na 500 ml elutie-oplossing wordt opgesteld, Dicht knijpen klem 1 en open knijpklem 2. Laat de elutie-oplossing circuleren 5 minuten met een toerental van 20% van zijn maximum. </li><li> Pas het volume van het monster in het retentaat fles tot ongeveer 100 ml door het aandraaien of losdraaien van de ramp klem op de afvoerleiding. Draai de ramp klem en laat het monster te laten circuleren gedurende 1 minuut. Trek niet lucht in de slang door te zorgen volume van het monster in het retentaat fles hoog genoeg is om de L / S 15 buis die in de retentaat fles dekken. </li><li> Draai de richting van de pomp die het monster dwingt de retentaat fles. Laat de pomp in omgekeerde uitgevoerd gedurende 20 seconden tot een totaal van ~ 225 ml in het retentaat fles. Zet de pomp. </li><li> Verwijder de Masterflex I / P 73 slang van de pomp uit en koppel de drukmeter. Maak de Masterflex L / S 24 buizen het verlaten van de holle-vezel ultrafilter. Houd de buis boven de retentaat fles om alle resterende monster te ver in deretentaat fles. </li><li> Ontkoppel alle slangen uit de fles en plaats de de kap met een niet-ontluchting dop. </li><li> Ga verder naar de IMS / IFA-procedure met de ~ 225 ml retentaat. </li></ol> 2. Immunomagnetische Scheiding Procedure <ol><li> Voorbereiding van de buffers en oplossingen: <ol><li> Laat de buffers in de Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit op kamertemperatuur komen. </li><li> 1X SL-buffer A: Voeg 1 ml 10x SL-buffer A tot en met 9 ml reagens kwaliteit water. </li></ol></li><li> Breng de ~ 225 ml vloeistof uit het retentaat fles een gelabeld 250 ml konische centrifugebuis. Twee keer Spoel de retentaat flesje met 10 ml reagens water, en voeg de spoelingen de conische centrifugebuis. Centrifugeer de suspensie 1500 g gedurende 15 min bij 4 ° C zonder rem. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans van de lucht-water grensvlak aan 5 ml boven de pellet verpakt voor elke 0,5 ml pellet volume (dat wil zeggen aspiratie tot en met 15 ml boven een pellet volume van 1,3 ml, en zuig 5 ml voor een pellet van 0,5 ml). </li><li> Grondig resuspendeer de pellet in de supernatant door vortexen en / of pipet mengen. Breng elke 5 ml van de vloeistof de vlakke zijden Dynal L10 buis 1 ml elk 10X SL-buffer A en 10X SL-buffer B. spoelen conische centrifugebuis tweemaal met 2,5 ml reagenswater en toevoegen sop de L10 buis, waardoor het totale volume van de L10 buis 12 ml, waaronder de buffers. </li><li> Voeg 100 ul elk van de goed gemengde geresuspendeerde anti-Cryptosporidium en anti-Giardia Dynabeads aan de L10 buis. Draai de L10 buis 18 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een rotator mixer. </li><li> Plaats de platte kant van de L10 buis tegen de MPC-6 magneet en zachtjes de hand rots de buis end-to-end, 180 ° gedurende 2 minuten. </li><li> Houd de L10 buis in de MPC-6 magneet met de magneet kant naar boven, weg decanteer de bovenstaande uit de kraal / (oo) cyste complexen bound de magneet. Verwijder de L10 buis van de magneet en voeg 0,5 ml 1X SL-buffer A aan de buis. De suspensie met twee extra spoelingen van 0,5 ml 1X A SL-buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuisje gehouden in MPC-S van de magneet in de verticale stand. </li><li> Schud de buis in de MPC-S magneet 180 ° gedurende 1 minuut. Met de magneet in plaats zuig de supernatant met een Pasteur pipet naar de bodem van de microcentrifugebuisje. </li><li> Voeg 1 ml PBS 1X de voorzijde van de microcentrifugebuisje Verwijder de magneet en schud de buis slechts tot korrels worden geresuspendeerd. Plaats de magneet in de verticale positie en voorzichtig de buis 180 ° schommelen gedurende 1 minuut. Zuig het PBS, spoel zonder de kraal pellet met een Pasteur pipet te verwijderen vuil zoveel mogelijk. </li><li> Verwijder de magneet en voeg 50 ul reagenswater de achterzijde van de microcentrifugebuisje. Vortex de buis op volle snelheid voor 50 seconden,vervolgens incuberen van de buis 80 ° C gedurende 10 minuten gevolgd door 30 seconden vortex. Plaats de magneet in de MPC-S in de schuine positie, het binden van de kralen aan de magneet en het verlaten van de (oo) cysten in de vloeistof. Breng de (oo) cyste suspensie naar een SingleSpot goed glijbaan. </li><li> Herhaal stap 2,10, waarbij de vloeistof dezelfde goed met de eerste dissociatie. Plaats dia op 37 ° C warmer dia gedurende 1 uur aan de suspensie drogen aan de slede zijn. </li></ol> 3. Kleuring en Onderzoek <ol><li> Voorbereiding van de buffers en oplossingen: Werken DAPI oplossing toevoegen van 25 pi van DAPI stock oplossing (2 mg / ml in methanol) 25 ml 1X PBS. Store voorraad en werkende oplossingen tussen 1 ° C en 10 ° C in het donker. </li><li> Breng 50 ul van methanol aan de slede goed en laat drogen bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 50 ul van de werkende DAPI oplossing van het dia goed en incuberen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Gebruik een Kimwiie aan de DAPI kous uit de put. Breng 50 ul van EasyStain. Incubeer bij 35 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Wick de vlek uit de goed met een Kimwipe, en dan voeg langzaam 300 ul van koude EasyStain vaststelling van buffer, te laten stromen over het wel en rand. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Gebruik een Kimwipe om de buffer kous uit de put en 10 ul van EasyStain Mounting Medium toe te passen. </li><li> Breng zorgvuldig een dekglas, het verwijderen van luchtbellen die zich voordoen. Sluit het deksel slip met duidelijke nagellak. </li><li> Scan de volledige dia het gebruik van de FITC-filter, op 200X totale vergroting, voor de eivormige of bolvormige appelgroen fluorescerende voorwerpen die lijken op een oocysten of cyste. Controleer al deze objecten met DAPI filter 1000X totale vergroting en vervolgens met DIC, ook op 1000X totale vergroting. Noteer de afmetingen met behulp van een geijkte oculair micrometer en morfologische kenmerken. </li><li> Document resultaten. </li></ol> Let op: Extra informatieinformatie over de oorspronkelijke procedure is te vinden in de december 2005 versie van de EPA-methode 1623 12. De tangentiële stroming holle vezels beschreven ultrafiltratie procedure wordt gebruikt in plaats van artikel 12.0 van de EPA-methode 1623. De warmte dissociatie wijzigt Sectie 13.3.3 van de EPA-methode 1623. De procedure beschrijft ook een extra PBS spoelen tijdens de IMS-proces, dat kan in de in december 2005 versie van de Methode 1623 worden toegevoegd na punt 13.3.2.16. De volledige lijst van verbruiksartikelen, reagentia en apparatuur die wordt gebruikt voor de EPA-methode 1623 met inbegrip van deze wijzigingen is opgenomen in de lijst met apparaten. 4. Representatieve resultaten Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten hersteld door de processen van filtratie en separatie immunomagnetische worden gedetecteerd door microscopische analyse. Bij 200X totale vergroting elk organisme vertonen typisch kleuringspatroon, grootte en vorm als weergegeven in figuur 2 </strong&gt; moet verder worden waargenomen met behulp van olie-immersie bij 1000X totale vergroting. Dit zal voor het meten en de identificatie van een van beide typische bepalende kenmerken of atypische kenmerken die zou uitsluiten positieve identificatie. Cryptosporidium is een eivormige tot bolvormig voorwerp 4 tot 6 micrometer in diameter die briljante appelgroen FITC fluorescentie vertoont met helder gemarkeerde randen (figuur 3A ). Met DAPI UV, zal een oocysten vertonen een van de volgende typisch kenmerk categorieën: lichtblauw interne kleuring met een groene rand en geen afzonderlijke kernen (DAPI negatief), intens blauw interne vlekken, of maximaal vier verschillende, hemelsblauwe kernen (DAPI positieve - Figuur 3B). Atypische kenmerken zijn afwijkingen in kleur, structuur of DAPI fluorescentie (bijvoorbeeld te veel lood kernen, rode fluorescerende interne structuren). Als het fluorescerende voorwerp heeft voldaan aan de criteria voor typische FITC en DAPI kleuring, wordt het onderzocht met behulp van differentieel interferentie concontrast (DIC). Het voorwerp wordt onderzocht atypische externe of interne morfologische kenmerken zoals celwand versiering of een of twee grote kernen vullen cel. Als atypische structuren wordt waargenomen, wordt het object opgenomen in de totale telling IFA and gecategoriseerd als een lege amorfe structuur of met een tot vier sporozoieten onderhavige (Figuur 3C). Evenzo worden Giardia-achtige objecten onderzocht op FITC en DAPI kleuring en DIC kenmerken, zoals axonemes, mediaan lichamen en kernen Giardia cysten zijn rond tot eivormig briljante appelgroen objecten, 8 - 18. Micrometer lang en 5 - 15 micrometer breed met helder gemarkeerde randen (figuur 3D). Met DAPI UV, zal de Giardia cyste vertonen DAPI-negatieve kleuring of DAPI-positieve kenmerken (figuur 3E). De fluorescerende voorwerp wordt behandeld door DIC voor typische en atypische kenmerken op dezelfde wijze als beschreven voor Cryptosporidium.Als atypische kenmerken wordt waargenomen, wordt het object opgenomen in de totale telling IFA and gecategoriseerd als lege bevattende amorfe structuur, of met een of meer soorten interne structuren aanwezig (Figuur 3F). Elk organisme dat wordt waargenomen dat atypische kenmerken hebben, moeten niet worden beschouwd als een (oo) cyste. Microscopische analyse van milieu-monsters kan een uitdaging als er organismen die kunnen auto-fluoresceren of cross-reageren met de FITC-geconjugeerd anti-Cryptosporidium en / of anti-Giardia antilichamen 1. Het wordt aanbevolen dat een analist bekend te zijn met het water levende micro-organismen en herziening tientallen dia&#39;s om ervaring op het identificeren van Cryptosporidium en Giardia te krijgen. Ten minste drie (oo) cysten op de positieve kleuring controle dia moet voorafgaand aan elke sessie op de microscoop worden gekarakteriseerd. Kwaliteitscontrole monsters kunnen worden verrijkt met (oo) cysten om het percentage te bepalen recOvery elke protozoïsche met de berekening: (Oo) cyste Procent Recovery = ((QC Sample Count - Graaf van Unspiked Sample) / Spike) x 100. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Figuur 1. Grafische voorstelling van de tangentiële stroming holle-fiber ultrafiltratie systeem. De slang heeft een kleurcode om te helpen is de montage van het systeem. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger fluorescentie beeld van Cryptosporidium en Giardia (oo) cysten. Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten werden gekleurd met FITC gelabeld anti-Cryptosporidium / Giardia antilichamen. Pijlen, Giardia cysten, pijlpunten, Cryptosporidium oöcysten. Een totaal van vier Cryptosporidium oöcysten en zes Giardia cysten werden gevonden in het vlak van focus. Monsters waarneembareed onder 200X vergroting. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Figuur 3 Vertegenwoordiger microscopische beelden van Cryptosporidium oöcysten en Giaridia cysten worden gebruikt voor de karakterisering Cryptosporidium oöcysten (A - C).. Brilliant appelgroen FITC fluorescentie van bolvormige objecten 4 tot 6 micrometer in diameter met helder gemarkeerde randen (A) met maximaal vier verschillende, hemelsblauwe DAPI kernen (B) en een tot vier sporozoieten (S) per oocysten (C). Giardia cysten (D - F). Brilliant appel-groene fluorescentie FITC ronde tot ovaal voorwerpen 8-18 micrometer lang 5-15 pm brede met helder gemarkeerde randen (D) bestaat uit vier hemelsblauwe DAPI kernen (E) en een of meer waarneembaar inwendige structuur, als kernen (N), gemiddelde lichaam (M) en of axonemes (A) (F). Witte pijlen, briljante appel groene fluorescentie vlekken Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten wAlls, witte pijlpunten, DAPI positieve kernen. Monsters waargenomen onder 1000X vergroting.

<ol><li>DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+and+Giardia+recoveries+in+natural+waters+by+using+Environmental+Protection+Agency+Method+1623%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952(2002).</li>
<li>Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistate+evaluation+of+an+ultrafiltration-based+procedure+for+simultaneous+recovery+of+enteric+microbes+in+100-liter+tap+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).</li>
<li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).</li>
<li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hollow-fiber+ultrafiltration+to+the+USEPA+VIRADEL+technique+and+USEPA+method+1623%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Qual%22%5BJournal%5D)">Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623.</a> J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).</li>
<li>Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ultrafiltration+cartridges+for+a+water+sampling+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus.</a> J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).</li>
<li>Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+ultrafiltration+to+concentrate+and+detect+Bacillus+anthracis%2C+Bacillus+atrophaeus+subspecies+globigii%2C+and+Cryptosporidium+parvum+in+100-liter+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).</li>
<li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).</li>
<li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from.</a> 176, 38-45 (2011).</li>
<li>Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+to+EPA+Method+1623+to+address+a+unique+seasonal+matrix+effect+encountered+in+some+U.S.+source+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters.</a> J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).</li>
<li>Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+detection+of+Cryptosporidium+oocysts+in+surface+water+samples+by+method+1622+using+ultrafiltration+and+capsule+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).</li>
<li>Sobsey, M. D., Glass, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+water+quality+on+enteric+virus+concentration+by+microporous+filter+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).</li>
<li>USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Office+of+Water%22">Office of Water</a>. 815-R-05-002, EPA. (2005).</li>
<li>Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alternative+IMS+dissociation+procedure+for+use+with+Method+1622%3A+detection+of+Cryptosporidium+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).</li>
<li>Zuckerman, U., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+continuous+flow+centrifugation+and+method+1623+for+monitoring+of+waterborne+protozoa+from+large+volumes+of+various+water+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices.</a> J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).</li>
</ol>

De Amerikaanse Environmental Protection Agency via haar Bureau voor Onderzoek en Ontwikkeling in samenwerking met het Bureau van het grondwater en drinkwater&#39;s Technical Support Center financierde het onderzoek hier beschreven. Al het werk werd ondersteund op het terrein van het Amerikaanse EPA, Cincinnati, Ohio. Hoewel de informatie beschreven in dit artikel is geheel of gedeeltelijk gefinancierd door de United States Environmental Protection Agency onder contract (Contract EP-C-06-031) aan Shaw Environmental and Infrastructure, Inc, is het niet noodzakelijk overeen met de standpunten van de Agentschap en geen officiële goedkeuring dient te worden afgeleid. Het is onderworpen aan een bureau onderzoek en goedgekeurd voor publicatie.

Tangentiële stroming holle-vezel ultrafiltratie is een alternatieve en effectieve techniek voor de initiële concentratie van Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten uit het water. Holle-fiber ultrafiltratie is goedkoper dan de traditionele filters. Aangezien het heeft de mogelijkheid om Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten te concentreren uit een verscheidenheid van verschillende matrices water is het een handig alternatief voor de huidige filtratie technieken die worden gebruikt voor de EPA-methode 1623. Zoals de meeste filtratiewerkwijzen holle-fiber ultrafiltratie is gevoelig voor aangroei met zeer troebel monsters. Hoge waterdruk zou voortvloeien uit de vervuiling van de filters, daarom is het aanbevolen om de druk te controleren tijdens het filtreren run. Naast Cryptosporidium en Giardia is holle-fiber ultrafiltratie aangetoond kunnen concentreren bacteriën en virussen 1-3,5,8. Holle-vezel ultrafiltratie outlined deze methode kan worden gebruikt om verschillende organismen te concentreren in een enkel monster. Het is opmerkelijk dat het verkrijgen van een uiteindelijk volume tussen de 200 en 250 ml is de kritische laatste stap in de concentratie procedure, zodat extra centrifugeren stappen, die kunnen leiden tot (oo) cyste verlies, worden vermeden (stap 2.2). Echter, zodat het volume in de fles te laag vallen nadelige gevolgen hebben voor de recovery omdat er niet genoeg vloeistofvolume tot de cysten of cysten dringen het retentaat fles. Daarom verdient het aanbeveling een eindvolume van 200 tot 250 ml handhaven. Warmte dissociatie plaats van de zuurdissociatie stap methode 1623. Deze alternatieve stap is gebleken Cryptosporidium oocysten terugwinning te verbeteren en de werkwijze variatie te verminderen wanneer geïsoleerd uit een rivier of reagenswater 9. Een naast vergelijking van zuur en warmte dissociatie methoden aangetoond dat het gebruik warmte dissociatiete van de organismen uit de immunomagnetische korrels geproduceerd hogere gemiddelde herstel voor zowel Cryptosporidium en Giardia. Daarnaast is de precisie van Cryptosporidium en Giardia herstel beter was in monsters verwerkt met warmte dissociatie in vergelijking met zuur dissociatie 9. De integratie van HFUF als de concentratie stap biedt meer flexibiliteit door de mogelijkheid om meerdere organismen te concentreren. Bovendien is een goedkoper alternatief voor de huidige Werkwijze 1623 filtermogelijkheden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipment / Reagens </td><td> Verkoper </td><td> Catalog # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R natte holle-vezel ultrafilters </td><td> Kies Medische </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P-73 (Masterflex R-3603), of gelijkwaardig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex platina behandelde), of gelijkwaardig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex platina behandelde), of gelijkwaardig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex platina behandelde), of gelijkwaardig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Precision Drive Brushless </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P Easy Load pompkop </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Black HDPE T-stuk, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> Amerikaanse Plastics </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-connector L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene zware pp 1 L fles </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene vulling / ontluchting dop voor 1/4 &quot;slang, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manometer </td><td> Cole Parmer </td><td> A-680-46-10 </td></tr><tr><td> Rechte koppeling, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.469-18 </td></tr><tr><td> NPT tak tee, natuurlijke pp </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30610-75 </td></tr><tr><td> Pinch klemmen 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.833-00 </td></tr><tr><td> Custom fit DIN-adapters </td><td> Gegoten Producten Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Ring stand </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 670B </td></tr><tr><td> Ring stand klemmen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck ramp klem, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Natriumpolyfosfaat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Natriumthiosulfaat pentahydraat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Antifoam Y-30 emulsie </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L Inklapbare high-density polyethyleen cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Centrifugeer flessenrek </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml conische centrifugebuizen </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Wegwerp trechter </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Was de fles </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Swinging emmer rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Centrifugeer emmer adapters voor 250 ml conische buizen </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 ul grote boring pipettips </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield Filter </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit </td><td> IkDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml conische centrifugebuizen </td><td> Valk </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 vlakke zijden buizen </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 magneet </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml pipetten </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml lage hechting microcentrifugebuizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 ul pipet &amp; overeenkomstige barrière tips </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 pi pipet en overeenkomstige barrière uiteinden </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 inch Pasteurpipetten </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S magneet </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Draaikolk </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads rotator mixer </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Warmte blok </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Armor Beads </td><td> Lab Armor </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Digitale thermometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Fosfaat-buffer zoutoplossing 1X pH 7,4 (1X PBS) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Single Spot dia&#39;s </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Cover glas </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain directe kit </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 pl pipet &amp; overeenkomstige barrière tips </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-fenyl indool dihydrochloride (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Wis nagellak </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Couveuse </td><td> Boekel Wetenschappelijk </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> schuif warmer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Immersion olie, type A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i microscoop met DIC mogelijkheden </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Plan APO 100X olie doel </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Plan Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC-filter </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI filter </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-cite fluorescentie verlichting </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Lens papier </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard wegwerpzak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard naaldencontainer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3% waterstofperoxide </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Bleekmiddel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

een aangepaste epa-methode 1623, dat tangentiële flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis<em&gt; cryptosporidium</em&gt; en<em&gt; giardia spp.</em

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium en Giardia soorten zijn twee van de meest voorkomende protozoa die ervoor zorgen dat water diarree ziekte-uitbraken de hele wereld. Om beter te kunnen karakteriseren de prevalentie van deze ziekteverwekkers, EPA Method 1623 werd ontwikkeld en gebruikt om het niveau van deze organismen in de VS drinkwater monitor levert 12. De methode bestaat uit drie delen, de eerste is de monsterconcentratie waarbij ten minste 10 L ruw oppervlak water gefiltreerd. De organismen en opgesloten vuil worden vervolgens geëlueerd van de filter en gecentrifugeerd verder concentreren monster. Het tweede deel van de methode maakt gebruik van een immunomagnetische scheiding procedure waarbij de geconcentreerde watermonster wordt toegepast op immunomagnetische kralen die specifiek binden aan het Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten waarbij specifieke verwijdering van de parasieten van de geconcentreerde puin. Deze (oo) cysten worden dan losgemaakt van de magnetische korrels door een zuur dissociatie proceduredure voorschrijft. Het laatste deel van de methode is de immunofluorescentiekleuring en telling waar (oo) cysten worden toegepast op een dia, gekleurd, en geïnventariseerd door microscopie. Methode 1623 heeft vier genoemde monster concentratie systemen om Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten in water vast te leggen: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), of Continu Flow Centrifugeren (Haemonetics, Braintree, MA). Echter, Cryptosporidium en Giardia (oo) cyste inningen sterk varieerde afhankelijk van de bron water matrix en filters worden gebruikt 1,14. Een nieuwe tangentiële stroming holle-vezel ultrafiltratie (HFUF) systeem is onlangs aangetoond dat het efficiënter en meer robuust herstel Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten uit diverse water matrices en bovendien, is het minder duur dan andere capsule filter opties en kan tegelijkertijd concentreren meerdere ziekteverwekkers 1-3,5-8,10,11. Daarnaast eerdere studies van Hill en zijn collega&#39;s toonden aan dat de HFUF aanzienlijk Cryptosporidium oöcysten herstel verbeterd wanneer ze direct in vergelijking met de Envirochek HV filters 4. Extra aanpassingen aan de huidige methoden zijn ook gemeld aan de methode te verbeteren. Vervangen zuurdissociatie procedure warmte dissociatie bleek effectiever te scheiden Cryptosporidium van de magnetische korrels in sommige matrices 9,13. Dit protocol beschrijft een gewijzigde methode 1623 dat het nieuwe HFUF filtratie-systeem maakt gebruik van de hitte dissociatie stap. Het gebruik van HFUF met deze gewijzigde methode is een goedkoper alternatief voor de huidige EPA Method 1623 filtermogelijkheden en biedt meer flexibiliteit, doordat de concentratie van meerdere organismen.

Dit protocol beschrijft het gebruik van een tangentiële stroming holle-fiber ultrafiltratie monsterconcentratie en een warmte dissociatie als andere stappen voor het detecteren van water<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; En<em&gt; Giardia</em&gt; Soorten met EPA Method 1623.

Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; En<em&gt; Giardia spp.</em

*Cryptosporidium*- en *Giardia*-soorten zijn twee van de meest voorkomende protozoa die wereldwijd uitbraken van door water overgedragen diarreeziekten veroorzaken. Om ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren en visualiseren van in het water aanwezige Cryptosporidium- en Giardia-soorten. Dit wordt bereikt door eerst het watermonster te concentreren met behulp van tangentieel stromingsfiltratie via holle vezel ultrafiltratie. De tweede stap bestaat uit het elueren van de organismen en het opvangen van debris van het filter na een centrifugatiestap.Immunomagnetische scheiding maakt de selectieve scheiding van de parasieten van het geconcentreerde debris mogelijk. Magnetische kralen worden door hitte-dissociatie van de parasieten losgekoppeld en met behulp van een magneet verwijderd. Cysten en O-cysten worden vervolgens op een objectglas geplaatst, waarna het monster wordt gekleurd voor visualisatie middels immunofluorescentiemicroscopie.Het belangrijkste voordeel van hofi-filtratie ten opzichte van bestaande technieken is dat het ultrafilter aanzienlijk goedkoper is en naast Cryptosporidium en Giardia ook meerdere andere micro-organismen opvangt, zoals virussen en bacteriën. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in immuno-separatie worden uitgedaagd door de hoeveelheid en het type debris dat geassocieerd wordt met verschillende monsters uit uiteenlopende klimatologische omstandigheden. Begin met het assembleren van de ultrafiltratie-apparatuur in een veiligheidskast.Zodra de opstelling is gemonteerd, functioneert deze als volgt: het watermonster komt het systeem binnen via de zwarte T-connector en stroomt door de pompkop, de manometer en in het holle-vezel ultrafilter; het gefilterde water stroomt via de zijkant van het filter naar de afvalbak. Het retentaat dat de organismen bevat, wordt in de retentaatfles geperst en door het systeem gerecirculeerd totdat het watervolume is gereduceerd. Om met de procedure te beginnen, verwijdert u de ontluchtingsdop en opent u alle klemmen, behalve knijpklem twee, die gesloten moet blijven zodat de retentaatfles met water kan vullen; stel de pomprichting zo in dat het watermonster naar het filter stroomt.Stel vervolgens de pompsnelheid in op 25% en schakel de pomp in zodra de renate-fles voor twee derde gevuld is. Sluit klem twee en sluit de fles snel stevig af met de ontluchtingsdop. Controleer alle leidingen en koppelingen om er zeker van te zijn dat er geen lekken zijn.Verhoog vervolgens langzaam de pompsnelheid tot ongeveer 1,5 liter per minuut met behulp van een maatcilinder en timer of een debietmeter; controleer of de filtratiesnelheid, oftewel de snelheid waarmee het water uit de effluentleiding stroomt, inderdaad 1,5 liter per minuut is. Bewaak het filtratieproces en zorg ervoor dat de retentfles nooit leegraakt, hoewel het volume licht kan toenemen of afnemen. Als het volume tot onder een derde daalt, verwijder dan de ontluchtingsdop en sluit knijpklem twee.Laat het volume in de fles opnieuw toenemen tot twee derde. Plaats vervolgens de ontluchtingsdop stevig terug en open klem twee opnieuw. Zodra de monstercontainer leeg is, sluit u knijpklem één onmiddellijk en reduceert u de pompsnelheid naar 20%. Verwijder de ontluchtingsdop van de retentaatfles en sluit de slangknijper die de effluentbuis van de filterkolom met de afvaltank verbindt.Draai de hellingsklem aan of los om het volume in de retentaatfles op ongeveer 200 milliliters af te stellen. Draai vervolgens de hellingsklem aan voor het eluaat om het monster te elueren. Voeg eerst 500 milliliters elueersoplossing toe aan de monstercontainer, waarbij de binnenkant van de container wordt gespoeld.Plaats vervolgens de 10 milliliter pipette, die is verbonden met de monsteropnamelijn, in de houder met de elucian-oplossing. Open knijpklem één en sluit knijpklem twee kortstondig om de elucian-oplossing op te zuigen. Zodra alle oplossing is geladen, sluit u knijpklem één, opent u knijpklem twee en laat u de oplossing vijf minuten circuleren met een pompsnelheid van 20% draai de hellingsklem vast of los om het volume monster in de renate-fles aan te passen naar ongeveer 100 milliliter.Draai vervolgens de klem van de helling volledig aan en laat het monster gedurende één minuut recirculeren. Keer op dit punt de richting van de pomp gedurende 20 seconden om. Dit resulteert in de ophoping van ongeveer 225 milliliters monster in de tate-fles.Zet vervolgens de pomp uit. Verwijder de slang uit de pompkop en de slang die uit het filter komt, en houd de slang boven de tate-fles om alle resterende monsterinhoud in de fles te dwingen. Ontkoppel daarna alle slangen van de fles en vervang de ontluchtingsdop door een luchtdichte dop.Overbreng het geconcentreerde monster naar een conische centrifugebuis van 250 milliliter. Spoel de monsterfles twee keer met 10 milliliters reagentwater en overbreng het spoelmiddel naar de centrifugebuis. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij minimaal 1500 ×g.Gebruik geen rem om de centrifugatie te stoppen. Aspireer na de centrifugatie voorzichtig het supernatant tot vijf milliliter boven het pellet. Wees extra voorzichtig om aan de bovenkant van het vloeistofniveau te blijven en voorkom het aspireren van O-cysten en cysten die zich in het pellet bevinden.Vortex de buis om het pellet grondig te resuspenderen. Draag het monster vervolgens over naar een platwandige dyal L 10-buis die elk één milliliter van 10 X SL-buffer A en buffer B bevat. Spoel de centrifugebuis tweemaal met 2,5 milliliter reagenswater en voeg de spoeloplossing toe aan de dyal L 10-buis. Breng het uiteindelijke volume naar 12 milliliter door elk 100 microliters aan magnetische bead-geconjugeerde anti-cryptosporidium- en anti-giardia-antilichamen aan de buis toe te voegen.Roteer de buis vervolgens na de rotatie gedurende één uur bij 18 RPM bij kamertemperatuur op een rotermixer. Plaats de platte zijde van de buis tegen de MP six-magneet en schud de buis voorzichtig twee minuten heen en weer zonder de buis van de magneet te verwijderen. Houd de platte zijde naar boven en schenk het supernatant af.Zorg ervoor dat de beads die op de platte zijde van de buis bij de magneet zijn vastgehouden, niet worden verstoord. Verwijder de monsterbuis van de magneet en spoel de platte zijde van de buis drie keer met 500 µL buffer A, waarbij het debris aan de ronde zijde van de buis wordt vermeden. Overbreng elk spoelvolume naar een 1,5 mL microcentrifugebuis die in een MPCS-magneet is geplaatst.Houd de magneet in verticale positie. Sluit de buis en schud deze voorzichtig één minuut lang heen en weer. Aspireer vervolgens, terwijl de magneet op zijn plaats blijft, het supernatant af met een Pasteurpipet die aan de onderkant van de buis is geplaatst en voeg voorzichtig 1 mL PBS toe aan de buis.Zorg ervoor dat de kraalpellet niet wordt verstoord. Bevestig deze aan de wand van de buis naast de magneet. Verwijder de magnetische strip en schud de buis voorzichtig heen en weer tot de kralen opnieuw zijn gesuspendeerd.Plaats de magnetische strip opnieuw in de verticale positie. Schud de buis een minuut lang voorzichtig heen en weer en aspireer het supernatant, waarbij zoveel mogelijk debris wordt verwijderd zonder de beads te verstoren. Verwijder na deze wasstap de magneet en voeg 50 µL reagenswater direct toe aan het bead-palet.Vortex de buis op maximale snelheid gedurende 50 seconden om de kraaltjes opnieuw te suspenderen. Incubeer het monster vervolgens gedurende 10 minuten bij 80 °C, zodat de Giardia-cysten en Cryptosporidium oocysten kunnen dissociëren van de kraaltjes. Vortex het monster na de incubatie gedurende 30 seconden. Plaats daarna de magnetische strip in de MPCS in de schuine positie om de kraaltjes te scheiden van de in suspensie anwezige cysten en oocysten.Breng het supernatant dat cysten en O-cysten bevat over naar een well-preparaatglas. Herhaal de stappen van watertoevoeging, vortexen en hitte-dissociatie voor een tweede maal door het supernatant aan hetzelfde preparaatglas toe te voegen. Plaats het preparaatglas vervolgens op een objectglasverwarmer van 37 °C om de suspensie te laten drogen.Begin met het aanbrengen van 50 µL methanol op het glaasje om het monster te fixeren en laat dit op kamertemperatuur drogen. Voeg vervolgens 50 µL DPI-oplossing toe en incubeer het glaasje gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Om de kernen te kleuren, gebruikt u een Kim wipe om de vloeistof uit het putje te trekken, waarbij u er zorg voor draagt dat u het putje zelf niet aanraakt.Voeg vervolgens 50 µL easy stain toe om de celwand van de Giardia-cysten en Cryptosporidium o-cysten te kleuren. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 35 °C. Verwijder de kleurstof met een Kim wipe zoals eerder beschreven.Voeg vervolgens langzaam 300 µL koude easy stain fixing buffer toe door de pipetpunt voorzichtig buiten de put te plaatsen en de vloeistof in de put te laten vloeien. Incubeer het objectglas gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder daarna de buffer met een Kimwipe en breng 10 µL monteermedium aan. Plaats voorzichtig een dekglas op het monster, verwijder eventuele luchtbellen en verzegel het dekglas met transparante nagellak. Onderzoek het objectglas met een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 200 x tot 1000 x en een fse then DPI-filter bij een vergroting van 200 x; cysten en O-cysten verschijnen als heldergroene fluorescerende ovoïde structuren met helder geaccentueerde randen.Cryptosporidium O-cysten zijn rond en variëren in grootte van vier tot zes micron. Giardia-cysten zijn groter, met een breedte van vijf tot 15 micron en een lengte van acht tot 18 micron, en kunnen bij een 1000 x vergroting rond of eivormig zijn. Met behulp van het DPI-filter kan de interne structuur van de cysten en CYS beter worden waargenomen.Meestal zijn er tot vier sporozoïten zichtbaar in de Cryptosporidium O cys en Giardia Cys.DIC, die verschijnen als hemelsblauwe DPI-gekleurde kernen. Microscopie kan ook helpen bij de juiste identificatie van parasieten, aangezien aanvullende morfologische kenmerken kunnen worden waargenomen. Cryptosporidium sporozoïten kunnen zichtbaar zijn via DIC; Giardia cysten vertonen vaak één of meer herkenbare interne structuren, zoals zichtbare kernen, halvemaanvormige organellen genaamd median bodies en interne flagellaire structuren genaamd axonen.Het is belangrijk om op te merken dat de holovezel-ultrafiltratieprocedure in staat is om meerdere micro-organismen op te vangen. Daarnaast kunnen andere detectie-assays, zoals qPCR en genotypering, worden toegepast op de geconcentreerde monsters, waardoor deze methode flexibeler en beter aanpasbaar is aan uw toepassingen. Bedankt voor het kijken en laat het ons weten als u vragen heeft.

a-modified-epa-method-1623-that-uses-tangential-flow-hollow-fiber

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Glaswol filters zijn gebruikt om virussen te water te concentreren door een aantal onderzoeksgroepen over de hele wereld. Hier laten we een eenvoudige aanpak voor het construeren van glaswol filters en demonstreren van de filters zijn ook effectief te concentreren op waterbasis virale, bacteriële en protozoa ziekteverwekkers.

Glaswol Filters voor Concentreren op waterbasis Virussen en Landbouw zoönotische pathogenen

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Een protocol voor de extractie en pre-concentratie van oestradiol uit watermonsters door gebruik te maken van een geautomatiseerd en geminiaturiseerd systeem wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige methode voor Automated Solid Phase Extraction van watermonsters voor immunologische Analyse van Kleine verontreinigende stoffen

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

We beschrijven hier de laatste ontwikkelingen in virale isolatie voor de karakterisering van nieuwe genotypen van Faustovirus, een nieuw asfarvirus-gerelateerd lijn van gigantische virussen. Dit protocol kan worden toegepast op de isolatie van virussen met hoge doorvoer, met name gigantische virussen die amoeben infecteren.

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

We ontwikkelden een aangepaste QuEChERS-HPLC-methode om de interne niveaus van 16 PAK's in zebravisembryo's te beoordelen.

Een gemodificeerde QuEChERS-HPLC-methode voor de detectie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen in zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan fijnstof

Leer een kosteneffectieve methode voor het detecteren van watergebonden Cryptosporidium en Giardia spp. met behulp van tangentiële stroom holle-vezel ultrafiltratie en immunomagnetische scheiding.

Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis Cryptosporidium En Giardia spp. (Video) | JoVE Journal

Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis

Meer video's verkennen