Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren en visualiseren van in het water aanwezige Cryptosporidium- en Giardia-soorten. Dit wordt bereikt door eerst het watermonster te concentreren met behulp van tangentieel stromingsfiltratie via holle vezel ultrafiltratie. De tweede stap bestaat uit het elueren van de organismen en het opvangen van debris van het filter na een centrifugatiestap.

Immunomagnetische scheiding maakt de selectieve scheiding van de parasieten van het geconcentreerde debris mogelijk. Magnetische kralen worden door hitte-dissociatie van de parasieten losgekoppeld en met behulp van een magneet verwijderd. Cysten en O-cysten worden vervolgens op een objectglas geplaatst, waarna het monster wordt gekleurd voor visualisatie middels immunofluorescentiemicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van hofi-filtratie ten opzichte van bestaande technieken is dat het ultrafilter aanzienlijk goedkoper is en naast Cryptosporidium en Giardia ook meerdere andere micro-organismen opvangt, zoals virussen en bacteriën. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in immuno-separatie worden uitgedaagd door de hoeveelheid en het type debris dat geassocieerd wordt met verschillende monsters uit uiteenlopende klimatologische omstandigheden. Begin met het assembleren van de ultrafiltratie-apparatuur in een veiligheidskast.

Zodra de opstelling is gemonteerd, functioneert deze als volgt: het watermonster komt het systeem binnen via de zwarte T-connector en stroomt door de pompkop, de manometer en in het holle-vezel ultrafilter; het gefilterde water stroomt via de zijkant van het filter naar de afvalbak. Het retentaat dat de organismen bevat, wordt in de retentaatfles geperst en door het systeem gerecirculeerd totdat het watervolume is gereduceerd. Om met de procedure te beginnen, verwijdert u de ontluchtingsdop en opent u alle klemmen, behalve knijpklem twee, die gesloten moet blijven zodat de retentaatfles met water kan vullen; stel de pomprichting zo in dat het watermonster naar het filter stroomt.

Stel vervolgens de pompsnelheid in op 25% en schakel de pomp in zodra de renate-fles voor twee derde gevuld is. Sluit klem twee en sluit de fles snel stevig af met de ontluchtingsdop. Controleer alle leidingen en koppelingen om er zeker van te zijn dat er geen lekken zijn.

Verhoog vervolgens langzaam de pompsnelheid tot ongeveer 1,5 liter per minuut met behulp van een maatcilinder en timer of een debietmeter; controleer of de filtratiesnelheid, oftewel de snelheid waarmee het water uit de effluentleiding stroomt, inderdaad 1,5 liter per minuut is. Bewaak het filtratieproces en zorg ervoor dat de retentfles nooit leegraakt, hoewel het volume licht kan toenemen of afnemen. Als het volume tot onder een derde daalt, verwijder dan de ontluchtingsdop en sluit knijpklem twee.

Laat het volume in de fles opnieuw toenemen tot twee derde. Plaats vervolgens de ontluchtingsdop stevig terug en open klem twee opnieuw. Zodra de monstercontainer leeg is, sluit u knijpklem één onmiddellijk en reduceert u de pompsnelheid naar 20%. Verwijder de ontluchtingsdop van de retentaatfles en sluit de slangknijper die de effluentbuis van de filterkolom met de afvaltank verbindt.

Draai de hellingsklem aan of los om het volume in de retentaatfles op ongeveer 200 milliliters af te stellen. Draai vervolgens de hellingsklem aan voor het eluaat om het monster te elueren. Voeg eerst 500 milliliters elueersoplossing toe aan de monstercontainer, waarbij de binnenkant van de container wordt gespoeld.

Plaats vervolgens de 10 milliliter pipette, die is verbonden met de monsteropnamelijn, in de houder met de elucian-oplossing. Open knijpklem één en sluit knijpklem twee kortstondig om de elucian-oplossing op te zuigen. Zodra alle oplossing is geladen, sluit u knijpklem één, opent u knijpklem twee en laat u de oplossing vijf minuten circuleren met een pompsnelheid van 20% draai de hellingsklem vast of los om het volume monster in de renate-fles aan te passen naar ongeveer 100 milliliter.

Draai vervolgens de klem van de helling volledig aan en laat het monster gedurende één minuut recirculeren. Keer op dit punt de richting van de pomp gedurende 20 seconden om. Dit resulteert in de ophoping van ongeveer 225 milliliters monster in de tate-fles.

Zet vervolgens de pomp uit. Verwijder de slang uit de pompkop en de slang die uit het filter komt, en houd de slang boven de tate-fles om alle resterende monsterinhoud in de fles te dwingen. Ontkoppel daarna alle slangen van de fles en vervang de ontluchtingsdop door een luchtdichte dop.

Overbreng het geconcentreerde monster naar een conische centrifugebuis van 250 milliliter. Spoel de monsterfles twee keer met 10 milliliters reagentwater en overbreng het spoelmiddel naar de centrifugebuis. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij minimaal 1500 ×g.

Gebruik geen rem om de centrifugatie te stoppen. Aspireer na de centrifugatie voorzichtig het supernatant tot vijf milliliter boven het pellet. Wees extra voorzichtig om aan de bovenkant van het vloeistofniveau te blijven en voorkom het aspireren van O-cysten en cysten die zich in het pellet bevinden.

Vortex de buis om het pellet grondig te resuspenderen. Draag het monster vervolgens over naar een platwandige dyal L 10-buis die elk één milliliter van 10 X SL-buffer A en buffer B bevat. Spoel de centrifugebuis tweemaal met 2,5 milliliter reagenswater en voeg de spoeloplossing toe aan de dyal L 10-buis. Breng het uiteindelijke volume naar 12 milliliter door elk 100 microliters aan magnetische bead-geconjugeerde anti-cryptosporidium- en anti-giardia-antilichamen aan de buis toe te voegen.

Roteer de buis vervolgens na de rotatie gedurende één uur bij 18 RPM bij kamertemperatuur op een rotermixer. Plaats de platte zijde van de buis tegen de MP six-magneet en schud de buis voorzichtig twee minuten heen en weer zonder de buis van de magneet te verwijderen. Houd de platte zijde naar boven en schenk het supernatant af.

Zorg ervoor dat de beads die op de platte zijde van de buis bij de magneet zijn vastgehouden, niet worden verstoord. Verwijder de monsterbuis van de magneet en spoel de platte zijde van de buis drie keer met 500 µL buffer A, waarbij het debris aan de ronde zijde van de buis wordt vermeden. Overbreng elk spoelvolume naar een 1,5 mL microcentrifugebuis die in een MPCS-magneet is geplaatst.

Houd de magneet in verticale positie. Sluit de buis en schud deze voorzichtig één minuut lang heen en weer. Aspireer vervolgens, terwijl de magneet op zijn plaats blijft, het supernatant af met een Pasteurpipet die aan de onderkant van de buis is geplaatst en voeg voorzichtig 1 mL PBS toe aan de buis.

Zorg ervoor dat de kraalpellet niet wordt verstoord. Bevestig deze aan de wand van de buis naast de magneet. Verwijder de magnetische strip en schud de buis voorzichtig heen en weer tot de kralen opnieuw zijn gesuspendeerd.

Plaats de magnetische strip opnieuw in de verticale positie. Schud de buis een minuut lang voorzichtig heen en weer en aspireer het supernatant, waarbij zoveel mogelijk debris wordt verwijderd zonder de beads te verstoren. Verwijder na deze wasstap de magneet en voeg 50 µL reagenswater direct toe aan het bead-palet.

Vortex de buis op maximale snelheid gedurende 50 seconden om de kraaltjes opnieuw te suspenderen. Incubeer het monster vervolgens gedurende 10 minuten bij 80 °C, zodat de Giardia-cysten en Cryptosporidium oocysten kunnen dissociëren van de kraaltjes. Vortex het monster na de incubatie gedurende 30 seconden. Plaats daarna de magnetische strip in de MPCS in de schuine positie om de kraaltjes te scheiden van de in suspensie anwezige cysten en oocysten.

Breng het supernatant dat cysten en O-cysten bevat over naar een well-preparaatglas. Herhaal de stappen van watertoevoeging, vortexen en hitte-dissociatie voor een tweede maal door het supernatant aan hetzelfde preparaatglas toe te voegen. Plaats het preparaatglas vervolgens op een objectglasverwarmer van 37 °C om de suspensie te laten drogen.

Begin met het aanbrengen van 50 µL methanol op het glaasje om het monster te fixeren en laat dit op kamertemperatuur drogen. Voeg vervolgens 50 µL DPI-oplossing toe en incubeer het glaasje gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Om de kernen te kleuren, gebruikt u een Kim wipe om de vloeistof uit het putje te trekken, waarbij u er zorg voor draagt dat u het putje zelf niet aanraakt.

Voeg vervolgens 50 µL easy stain toe om de celwand van de Giardia-cysten en Cryptosporidium o-cysten te kleuren. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 35 °C. Verwijder de kleurstof met een Kim wipe zoals eerder beschreven.

Voeg vervolgens langzaam 300 µL koude easy stain fixing buffer toe door de pipetpunt voorzichtig buiten de put te plaatsen en de vloeistof in de put te laten vloeien. Incubeer het objectglas gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder daarna de buffer met een Kimwipe en breng 10 µL monteermedium aan. Plaats voorzichtig een dekglas op het monster, verwijder eventuele luchtbellen en verzegel het dekglas met transparante nagellak. Onderzoek het objectglas met een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 200 x tot 1000 x en een fse then DPI-filter bij een vergroting van 200 x; cysten en O-cysten verschijnen als heldergroene fluorescerende ovoïde structuren met helder geaccentueerde randen.

Cryptosporidium O-cysten zijn rond en variëren in grootte van vier tot zes micron. Giardia-cysten zijn groter, met een breedte van vijf tot 15 micron en een lengte van acht tot 18 micron, en kunnen bij een 1000 x vergroting rond of eivormig zijn. Met behulp van het DPI-filter kan de interne structuur van de cysten en CYS beter worden waargenomen.

Meestal zijn er tot vier sporozoïten zichtbaar in de Cryptosporidium O cys en Giardia Cys.DIC, die verschijnen als hemelsblauwe DPI-gekleurde kernen. Microscopie kan ook helpen bij de juiste identificatie van parasieten, aangezien aanvullende morfologische kenmerken kunnen worden waargenomen. Cryptosporidium sporozoïten kunnen zichtbaar zijn via DIC; Giardia cysten vertonen vaak één of meer herkenbare interne structuren, zoals zichtbare kernen, halvemaanvormige organellen genaamd median bodies en interne flagellaire structuren genaamd axonen.

Het is belangrijk om op te merken dat de holovezel-ultrafiltratieprocedure in staat is om meerdere micro-organismen op te vangen. Daarnaast kunnen andere detectie-assays, zoals qPCR en genotypering, worden toegepast op de geconcentreerde monsters, waardoor deze methode flexibeler en beter aanpasbaar is aan uw toepassingen. Bedankt voor het kijken en laat het ons weten als u vragen heeft.