Name: Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Leer synthetische spinnenzijde produceren door het natuurlijke spinnenproces na te bootsen. Deze methode gebruikt recombinante eiwitten uit bacteriën voor biomaterialen met toepassingen in de medische en technische industrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NSF RUI Subsidies MCB-0950372 en de DMR-1105310 getiteld &quot;moleculaire karakterisering van Black Widow Spider zijde en mechanisch gedrag van Spider Glue Silks,&quot; respectievelijk.

<ol><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+design+of+spider+silks%3A+from+fibroin+sequence+to+mechanical+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).</li>
<li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoelix%2C+R+%22Biology+of+spiders%22">Biology of spiders</a>. , Oxford University Press. New York. (1996).</li>
<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+crystalline+spinning+of+spider+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid crystalline spinning of spider silk.</a> Nature. 410, 541-548 (2001).</li>
<li>Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+proteins+for+applications+in+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).</li>
<li>Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+fibers+self-assembled+from+recombinant+miniature+spider+silk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins.</a> Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).</li>
<li>Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Fibers+Spun+from+Soluble+Recombinant+Silk+Produced+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells.</a> Science. 295, 472-476 (2002).</li>
<li>Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+production+of+recombinant+spider+silk-like+proteins+for+artificial+fiber+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning.</a> Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).</li>
<li>Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnesa%2C+E+%22Biomacromolecules%22">Biomacromolecules</a>. , (2011).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotheses+that+correlate+the+sequence%2C+structure%2C+and+mechanical+properties+of+spider+silk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Macromol%22%5BJournal%5D)">Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).</li>
<li>Xu, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+protein+superfiber%3A+Spider+Dragline+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+mechanical+characterization+of+aciniform+silk%3A+uniformity+of+iterated+sequence+modules+in+a+novel+member+of+the+spider+silk+fibroin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family.</a> Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).</li>
<li>Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+silk+fibers+spun+from+soluble+recombinant+silk+produced+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells.</a> Science. 295, 472-476 (2002).</li>
<li>Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+spider+silk+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).</li>
<li>Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+dragline+silk+proteins+in+transgenic+tobacco+leaves%3A+accumulation+and+field+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production.</a> Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).</li>
<li>Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+spider+silk+proteins+in+tobacco+and+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of spider silk proteins in tobacco and potato.</a> Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).</li>
<li>An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+beta-sheets+formation+in+synthetic+spider+silk+fibers+by+aqueous+post-spin+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching.</a> Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).</li>
<li>Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).</li>
<li>Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+spider+silk+proteins+in+tobacco+and+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of spider silk proteins in tobacco and potato.</a> Nature Biotechnology. 19, (2001).</li>
<li>Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+removal+during+synthetic+and+Nephila+fiber+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning.</a> Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).</li>
<li>Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+Black+Widow+Spider+Silk-producing+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands.</a> J. Vis. Exp. (47), e2382(2011).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyriform+spidroin+1%2C+a+novel+member+of+the+silk+gene+family+that+anchors+dragline+silk+fibers+in+attachment+discs+of+the+black+widow+spider%2C+Latrodectus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus.</a> J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).</li>
<li>La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+minor+ampullate+silk+proteins+are+constituents+of+prey+wrapping+silk+in+the+cob+weaver+Latrodectus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus.</a> Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).</li>
<li>Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHsia%2C+Y+%22Metal%2C+Ceramic+and+Polymeric+Composites+for+Various+Uses%22">Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses</a>. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Synthetische vezels gesponnen van deze methode zijn mechanisch op dezelfde orde van grootte vergeleken met de natuurlijke vezels. Door het verminderen van de hoeveelheid van menselijke fouten door mechanisatie van het in de wachtrij en na de spin-loting processen, de experimentele variatie tussen monsters zijn meer gecontroleerd en sterk verminderd. Onze methodologie biedt het potentieel om de mechanische eigenschappen van andere vezels die worden gesponnen uit recombinante eiwitten gecodeer...

Spider zijde heeft een buitengewone mechanische eigenschappen die uit voert een aantal door de mens gemaakte materialen, waaronder staal met hoge treksterkte, Kevlar en Nylon. 1 Spiders draaien minimaal 6-7 verschillende soorten vezels, dat diverse mechanische eigenschappen weer te geven, elk ontworpen met verschillende hoeveelheden van de treksterkte en uitbreidbaarheid om specifieke biologische taken uit te voeren. 2 Onderzoek wetenschappers in hoog tempo het nastreven van het gebruik van de spin zijde als de volgende generatie biomaterialen omwille van hun uitstekende mechanische eigenschappen, hun biocompatibiliteit, en hun niet-toxisch en groen-materiële aard. 3,4 Vanwege de kannibalistisch en giftige karakter van de spinachtigen, oogsten spin zijde door de landbouw is niet een praktische strategie om aan de eisen die noodzakelijk zijn voor industriële schaal productie te voldoen. Daarom hebben onderzoekers zich tot de productie van recombinante eiwitten zijde in transgene organismen gekoppeld met vitro spinnen van kunstvezels dese gezuiverde eiwitten. 5-8 Expressie van volledige lengte recombinante spinnenzijde eiwitten is technisch moeilijk gezien de intrinsieke eigenschappen van hun gen-sequenties, die hun zeer repetitief karakter en de fysieke lengtes (&gt; 15 kb) omvatten, GC-rijke inhoud en tendentieuze alanine en glycine codongebruik. 9-11 Tot op heden hebben de meeste labo&#39;s gericht op het uiten afgeknotte vormen van de belangrijkste ampullate zijde proteïnen MaSp1 of MASP2 met behulp van partiële cDNA sequenties of synthetische genen. 12-15 Spinning synthetische spin zijde is een uitdagend proces dat vereist beheersing en kennis van verschillende wetenschappelijke disciplines, en de fijne kneepjes van het draaien, niet zijn volledig geopenbaard aan het grote publiek door video vertegenwoordiging. In feite is slechts een handvol van laboratoria over de hele wereld hebben de expertise om de spin zijde cDNA&#39;s uit te drukken, te zuiveren van de zijde proteïnen, spin synthetische vezels en voer de post-spin tekenen, en dan uiteindelijk testen hun biomateriaal eigenschappen. 8,16,17 Verschillende benaderingen voor het spinnen van synthetische vezels zijn omgeven natte en droge spinnen en electrospinning methoden 16,18,19 Alle procedures hebben een doel gemeen -. Ontwikkeling van een protocol dat synthetische spinnenzijde produceert met mechanische eigenschappen die rivaal natuurlijke onderwerpen die voor grootschalige commerciële productie processen. Hier beschrijven we de procedure om kunstmatige spin zijde op laboratorium schaal met behulp van een natspinnen methodiek te genereren. Ten opzichte van andere spinnen methoden, heeft natspinnen geproduceerd de meest consistente resultaten voor vezels analyse. Wij beschrijven deze procedure begint met de expressie van de recombinant eiwitten zijde in bacteriën, gevolgd door zuivering ervan, en een beschrijving van de eiwitpreparaat stappen voor het spinnen met een post-spin draw methode toegepast op &quot;zo gesponnen&quot; vezels draden oplevert met eigenschappen van het materiaal dat de kwaliteit van de natuurlijke spin zijde te benaderen. Onze methodologischey is ontworpen om de voet na te bootsen de natuurlijke spinproces van zijde vezels en het trekt een zware wissel op onze kennis van de architectuur en de functie van de zijde-producerende klieren van bol-en cob-weven spinnen. 20-22 Verder sluiten we af met de nodige stappen van de materiaaleigenschappen van de synthetische vezels met een tensometer stress-rek krommen, waardoor onderzoekers de uiteindelijke sterkte, uiteindelijke spanning en taaiheid van vezels berekenen uitzetten bepalen. Ten slotte, maar van aanzienlijke waarde, kan de spinnen, wikkelen, en tekenen apparaten thuis te zijn gebouwd met behulp van commercieel verkrijgbare onderdelen, in plaats van de aankoop van ingewikkelde en kostbare apparatuur op maat.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> pBAD / TOPO ThioFusion Expression Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K370-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak Cell Lysis Reagent, 10x </td><td> Promega </td><td> V857C </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td> Inclusief instructies voor buffers </td></tr><tr><td> ProteoSilver Silver Stain Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PROTSIL1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Freezone vriesdroger </td><td> Labconco </td><td> 7960041 </td><td> Freezone 12Plus </td></tr><tr><td> Hexafluorisopropanol (HFIP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52512 </td><td></td></tr><tr><td> Injectiespuit </td&gt; <td> Hamilton </td><td> 7657-01 </td><td> 250 pi </td></tr><tr><td> Naald </td><td> Hamilton </td><td> 7780-01 </td><td> 26s Gauge, Blunt einde verwisselbare naald </td></tr><tr><td> Spuitpomp </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 702208 </td><td> 11Plus </td></tr><tr><td> Digitale schuifmaat </td><td> Carrera </td><td> CP5906 </td><td> 0-150 mm bereik </td></tr><tr><td> Roestvrij staal tang </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> 501764 </td><td> Mini Dumont # M5S </td></tr><tr><td> Motor </td><td> Natuur Mill </td><td> 7090529 </td><td> 12VDC, 2 toerental </td></tr><tr><td> Lineaire actuator </td><td> Warner Electric </td><td> 01-D024-0050-A06-LP-IP65 </td><td> 24VDC, 6 inch aanbod </td></tr><tr><td> Het ontleden van microscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> Digitale MicroscOpe camera </td><td> Leica Microsystems </td><td> DFC320 </td><td> Software: Leica Application Suite v2.8.1 </td></tr><tr><td> Vannas schaar </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> 500260 </td><td></td></tr><tr><td> Microtensometer </td><td> Aurora Wetenschappelijk </td><td> 310C </td><td> 5N Dual-Mode-systeem </td></tr></tbody></table>

synthetische spider silk production op laboratoriumschaal

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Naarmate de samenleving vordert en de middelen schaarser worden, wordt het steeds belangrijker om nieuwe technologieën te ontwikkelen die ingenieur volgende generatie biomaterialen met een hoge prestatie-eigenschappen. De ontwikkeling van deze nieuwe structurele materialen moet snel, kostenefficiënt en te betrekken verwerking van methoden en producten die milieuvriendelijk en duurzaam. Spinnen spinnen een veelheid van verschillende soorten vezels met verschillende mechanische eigenschappen en biedt een rijke bron van de volgende generatie technische materialen voor biomimicry die wedijveren met de beste door de mens veroorzaakte en natuurlijke materialen. Omdat het verzamelen van grote hoeveelheden natuurlijke spindraad is onpraktisch, synthetische productie van zijde heeft het vermogen om wetenschappers te voorzien van toegang tot een onbeperkt aanbod van draden. Daarom, als de draaiende proces kan worden gestroomlijnd en geperfectioneerd, kunstmatige spin vezels hebben het potentieel gebruik voor een breed scala aan toepassingen, variërend van kogelvrije kleding, chirurgische hechtingens, touwen en kabels, banden, snaren voor muziekinstrumenten, en composieten voor lucht-en ruimtevaart technologie. Met het oog op de synthetische zijde productieproces te bevorderen en de vezels die lage variantie weer te geven in hun materiële eigenschappen van draai te draaien geven, ontwikkelden we een natspinnen protocol dat de expressie van recombinante spindraad eiwitten in bacteriën, zuivering en concentratie van de eiwitten integreert , gevolgd door extrusie vezels een mechanische na rotatie behandeling. Dit is de eerste visuele voorstelling dat een stap-voor-stap proces openbaart te spinnen en te analyseren kunstzijde vezels op laboratoriumschaal. Het biedt ook gegevens aan het minimaliseren van de invoering van de variabiliteit onder vezels gesponnen uit dezelfde draaiende dope. Gezamenlijk zullen deze methoden voort te bewegen het proces van kunstzijde de productie, wat leidt tot hogere kwaliteit vezels die de natuurlijke spin zijde overtreffen.

Ondanks de uitstekende mechanische en biochemische eigenschappen van spin zijde, kan dit materiaal worden geoogst in grote hoeveelheden op conventionele wijze. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om kunstmatige spinnenzijde vezels, die is een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen van spinnenzijde productie en het gebruik ervan als next-generation biomaterialen te laten draaien.

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

Naarmate de samenleving vordert en hulpbronnen schaarser worden, wordt het steeds belangrijker om nieuwe technologieën te ontwikkelen voor het ontwerpen van de volgende generatie ...

Het algemene doel van deze procedure is om synthetische spinnenzijde te produceren door het natuurlijke proces van zijdespinnen na te bootsen, om zo het spinnen van zijde in het laboratorium te repliceren. Grote hoeveelheden recombinant zijdeproteïne worden geproduceerd in bacteriën, gevolgd door zuivering via chromatografie en concentratie door lyofilisatie. Het proteïne wordt gesolubiliseerd en de spinvloeistof wordt via een spuit met een naald met een kleine diameter in een dehydrerend alcoholbad geperst.Ten slotte worden de synthetische, in ongesponnen toestand verkregen vezels onderworpen aan een nagesponnen rekproces om de moleculaire oriëntatie van de eiwitketens te verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektrospinning of drogspinning is de lagere kostprijs, het gemak van manipulatie en het potentieel om het proces uit te breiden naar een productieformaat op grote schaal. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van een nieuwe klasse biomaterialen.Deze materialen kunnen voor een breed scala aan verschillende toepassingen worden gebruikt, zoals hechtingen, kogelwerende vesten en snaren voor muziekinstrumenten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de materiaaleigenschappen van spinnenzijde, kan ze ook worden toegepast bij het bestuderen van andere typen biopolymeren die zijn gesponnen uit recombinante eiwitten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze techniek moeite hebben, omdat er expertise vereist is in vele disciplines, waaronder bioengineering, biofysica, cellulaire en moleculaire biologie en biochemie.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we het natuurlijke spinproces van de spin wilden nabootsen in een poging om synthetische vezels te produceren. Om het plasmide te genereren dat zal worden gebruikt voor de productie van spinnenzijde, wordt het gewenste cDNA voor spinnenzijde geamplificeerd met specifieke primer-sets en geligeerd in een prokaryote expressievector, zoals pET-22b(+). Deze vector beschikt over een N-terminale thioredoxine-tag om de solubilisatie van het zijdeproteïne te vergemakkelijken en een C-terminale 6xHis-tag voor proteïnezuivering.Zodra de ligatie is voltooid, worden de ligatieproducten getransformeerd in competente e coli-cellen en wordt een plasmide-bevattende kolonie gekweekt. De expressie van het spinnenzijde-eiwit wordt vervolgens geïnduceerd door de toevoeging van aose, waarna de cellen worden gepellet en bewaard bij minus 80 graden Celsius tot gebruik. Om de bacteriële cellen te lyseren, wordt 20 milliliters van één x lysisbuffer toegevoegd aan de celpellet; resuspendeer de cellen volledig om verdere cellyse te bevorderen. Voeg lysozym toe tot een concentratie van één milligram per milliliter om chromosomaal DNA te ligeren, wat de viscositeit van de oplossing vermindert bij 100 micrograms van DNA.Plaats de sample vervolgens op een orbitale schudkerker en schud voorzichtig gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Sonicate de oplossing gedurende één minuut op stand 19 om de oplossing te klaren; centrifugeer vervolgens bij 16 000 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Controleer na het centrifugeren of het supernatant niet-viskeus en helder is; als de oplossing viskeus en troebel is, voeg dan meer DNase toe, sonicate opnieuw en centrifugeer het supernatant opnieuw.Zodra de supernatant helder is, brengt u deze over in een schone BioRad poly prep-kolom van 25 milliliter voor nikkel NTA-affiniteitschromatografie. Om het fusie-eiwit te zuiveren, voegt u één milliliter nikkel NTA-slurry met 0,5 milliliter beads toe aan de kolom, sluit u de dop en de stopkraan stevig af en plaatst u de kolom vervolgens gedurende één uur op een rocker om te equilibreren en om binding van de six X his-tag aan de nikkel NTA-beads mogelijk te maken. Plaats de kolom rechtop in een statief en laat de nikkel NTA-beads ongeveer twee minuten bezinken.Wanneer de kraaltjes volledig zijn bezonken, is er een lichtblauwe laag aan de bodem zichtbaar. Verwijder de dop en laat de oplossing door de stopkraan stromen. Verzamel de oplossing in een kegelvormige buis van 15 milliliter.Voeg voor verdere analyse 20 milliliter van een éénvoudige wasbuffer toe en laat de bieten bezinken. Open de stopkraan en verzamel het doorstroomvolume in vier aliquoten van vijf milliliter. Bewaar de aliquoten voor verdere analyse bij vier graden Celsius of min 80 graden Celsius voor respectievelijk kort- of langetermijnbewaring.Let op dat aanvullende wasvolumes kunnen worden gebruikt om contaminerend eiwit te verminderen, hoewel dit de totale eiwitopbrengst kan verlagen. Voeg vervolgens 20 milliliter van een eenvoudige elutiebuffer toe, laat de hars bezinken, open de stopkraan en laat de oplossing doorstromen. Verzamel deze oplossing van 20 milliliter in vier aliquots van vijf milliliter voor verdere analyse.Bewaar bij vier graden Celsius of minus 80 graden Celsius voor respectievelijk kort- of langetermijnbewaring. Let op dat indien nodig aanvullende elutievolumes kunnen worden verzameld van de nikkel-NTA-hars. Scheid vervolgens de eiwitten op basis van hun molecuulmassa's.Visualiseer de eiwitten met behulp van SDS-PAGE-analyse met zilver of kumasi brilliant blue R 250; alleen zuivere fracties mogen worden gebruikt voor de volgende stappen. Bevestig de identiteit van het gezuiverde eiwit via Western blot-analyse. Om zouten te verwijderen en het eiwit te concentreren, dient dialyse te worden uitgevoerd en het monster te worden gelyofiliseerd volgens de instructies in het bijbehorende document; bewaar de gevriesdroogde monsters bij -80 °C. Het doel van de volgende stappen is om, werkend onder een veiligheidskap, de dope en de spuit voor te bereiden voor het spinproces.Voeg voorzichtig de juiste hoeveelheid hexafluorisopropanol of HFIP toe aan elke buis met gedroogd proteïnepoeder om een concentratie van 200 milligram per milliliter tot 500 milligram per milliliter, of 20% tot 50% gewicht per volume, te verkrijgen. Sluit de buis zo snel mogelijk af na toevoeging van HFIP, seal de buizen met Parafilm en plaats ze op een rocker om het proteïne op te lossen; gebruik een vortex om de solubilisatie te bespoedigen. Dit kan tot twee dagen duren.Zodra de sample is gesolubiliseerd, wordt deze gecentrifugeerd bij 16,000 Gs gedurende twee tot drie minuten. Wanneer het eiwit in oplossing is, wordt dit aangeduid als spinning dope. De oplossing zal zeer viskeus zijn.Zorg ervoor dat er geen aggregaten aanwezig zijn, aangezien deze de spuit kunnen verstoppen. Laad in de volgende stap voorzichtig ten minste 25 µL van de spin-dope in een Hamilton Gast tight spuit, uitgerust met een naald met een diameter van 127 µm, waarbij de spuit met de naald omhoog wordt gehouden om de zuiger in te drukken. Het is zeer belangrijk om eventuele luchtbellen te verwijderen, omdat deze inconsistenties in de vezel zullen veroorzaken.Bevestig vervolgens de spuit aan een Harvard apparatus, 11 plus spuitenpomp. Plaats een bekerglas van 400 milliliter gevuld met 95% isopropanol op een verrijdbare standaard, zodanig dat de punt van de spuit net het oppervlak van de alcohol doorbreekt. Stel de spuitenpomp in op 15 µL per minuut en druk op start.De extrusie van de vezel. Dit zou ongeveer één tot twee minuten moeten duren, afhankelijk van het beginvolume van de spin-dope. Zodra alle oplossing tot vezel is gesponnen, laat u de vezel 20 minuten in het isopropanol rusten om volledig te equilibreren.Vervolgens wordt het monster verzameld met behulp van een spoelapparaat. Het hier gebruikte spoelapparaat is gemaakt door metalen kammen op een digitale schuifmaat te lijmen. Zoals in deze afbeelding te zien is, brengt u dubbelzijdige tape aan op beide zijden van de kam op het spoelapparaat.Bevestig vervolgens het spoelapparaat aan een motor. Stel de motor zo in dat de draden met 2 RPM worden opgespoeld. Pak daarna met een pincet voorzichtig één uiteinde van de vezel vast en trek deze langzaam uit het isopropanol.Bevestig het aan de rand van een van de kamarmen op de spoel. Gebruik hiervoor de dubbelzijdige tape. De volgende stappen moeten zonder onderbreking worden uitgevoerd om te voorkomen dat de vezels uitdrogen. Zet de motor aan en gebruik een glazen staaf om de vezel voorzichtig naar het spoelmechanisme te leiden.Voorkom dat de vezels dubbelklappen of op elkaar stapelen. De dubbelzijdige tape moet voorkomen dat de gehele vezel wegglijdt en maakt het mogelijk om de binnenste segmenten van de vezels binnen de schuifmaatarmen selectief uit te rekken.Zodra de gehele vezel is opgewonden, wordt de spoel van de motor losgekoppeld en wordt er lijm aangebracht op het uiteinde van elke zijdevezel op de dubbelzijdige tape. Hiermee wordt de spinnenzijde op de apparatuur vastgezet. Bevestig de spoel aan de lineaire actuator om de rek na het spinnen uit te voeren.Bepaal de initiële lengte van de vezels met behulp van de C. Dit is de interne lengte van de vezel. Hierbij is de lengte die is vastgeplakt en rond de spoel is gewikkeld niet inbegrepen. Laat de spoel zakken in een bad van 75% isopropanol.Laat de vezels 10 minuten equilibreren. Stel de snelheid van de lineaire actuator in op 1,5 millimeters per seconde. Bereken op basis van de beginlengte de eindlengte voor de gewenste post bin draw ratio.De mate van rek kan worden gecontroleerd op basis van de snelheid of de lengte, afhankelijk van de opstelling. Bijvoorbeeld: bij een beginlengte van 15 millimeters en een gewenste rekfactor na het bin-proces van drie x, moet de eindlengte 45 millimeters zijn. Dit kan ook worden berekend door de lineaire actuator gedurende 20 seconden aan te sturen met een snelheid van 1,5 millimeters per seconde.Ten tweede, zodra de trekking uit de post-bin is voltooid, tilt u de spoel langzaam uit het isopropanol. Laat de isopropanol-druppels gedurende één minuut verdampen voordat u de monsters verzamelt. Knip vervolgens één uiteinde van de vezel door terwijl u het andere uiteinde met een pincet vasthoudt.Snijd dat uiteinde af en monteer de vezel op kartonnen of folie frames voor testdoeleinden. Indien verdere post-bin trekverhoudingen gewenst zijn, laat de spoel dan terugzakken in het 75% isopropanolbad. Laat de vezels 10 minuten equilibreren en ga daarna door naar de volgende post-bin.Rektraject. Noteer de luchtvochtigheid en temperatuur, aangezien deze de vezels kunnen beïnvloeden. Mechanische eigenschappen.Laat de verzamelde monsters equilibreren naar de standaard laboratoriumomgeving. Een vochtigheid van 40% en 25 graden Celsius zijn ideaal gedurende ten minste één uur voorafgaand aan de mechanische tests. Breng, terwijl de vezel op het kartonframe is gemonteerd, superlijm aan op de randen van het karton of folie om de vezel op het frame te fixeren.Noteer de grootte van de opening van het frame. Dit is de beginlengte van de geteste vezel. Hier wordt een frame met een opening van één inch getoond; gebruik een lichtmicroscoop met een vergroting van 100 x of hoger om diameter-metingen langs de longitudinale vezelas uit te voeren.Er moeten ten minste drie metingen worden genoteerd. Hoe hoger de gebruikte vergroting en hoe meer metingen er worden verricht, hoe groter de nauwkeurigheid. Bevestig het kader van karton aan een tenter mechanisch belastingsframe.Snijd vervolgens het frame aan beide zijden door, zodat de spanning alleen door de vezel loopt. Scheur de proefstukhouder en verzamel de gegevens. Een standaard rekgevoeligheid van 2% per seconde wordt aanbevolen.De procedure voor het verzamelen van mechanische gegevens kan variëren afhankelijk van het merk tenter dat voor de studies wordt gebruikt. Met de verzamelde gegevens van de gemiddelde diameter kan een stress-strain-curve worden uitgezet in Microsoft Excel. De gebroken vezel kan nu worden gemonteerd op een scanningelektronenmicroscoop, Stu, voor morfologische analyse en metingen van de diameter van het breekpunt.Het vezegment dat zich buiten het breekpunt bevindt, kan worden gebruikt om de aanvankelijk met de lichtmicroscoop gemeten diameter te schatten en te controleren. Het spinnenzijde-eiwit MASP1 werd tot expressie gebracht en gezuiverd uit bacteriën om de zuiverheid van het eiwit te bepalen; voorafgaand aan het spinnen van de vezel werden de eiwitten onderworpen aan fractionering op basis van grootte. Met behulp van SDS-PAGE-analyse, gevolgd door visualisatie met zilverkleuring zoals hier getoond, blijkt uit de zes oplossingen dat het grootste deel van het monster in de eerste vier fracties vrijkomt.Het spinnenzijde-eiwit TUSP one werd eveneens geproduceerd volgens het hier gepresenteerde protocol en tot vezels gesponnen om de mechanische eigenschappen van synthetische buisvormige zijde te bepalen. De zijdevezels werden gesponnen, waarna toenemende post-spinning rekverhoudingen werden toegepast. De kleuren in deze afbeelding tonen vezels die zijn onderworpen aan verschillende post-spinning rekverhoudingen variërend van 2,5 x tot 6 x. De vezels vertonen een geringe variatie binnen hun respectievelijke rekverhoudingsgroep.Naarmate de trekverhoudingen toenemen, neemt de sterkte van de vezel toe terwijl de rekbaarheid afneemt. De vezels vertoonden echter gelijkwaardige niveaus van taaiheid. Om de ultrastructuur van de vezels te beoordelen, zijn scanning elektronenmicroscopie-beelden gemaakt van vezels gesponnen uit recombinante tsp one-eiwitten, zoals hier te zien is. Het gladde externe oppervlak is zichtbaar bij een vergroting van 500 x en bij 5.000 x.De dichte binnenkern kan worden waargenomen bij een natuurlijke breuk van de vezel. Dit suggereert dat de recombinante eiwitten zich goed assembleren en pakken tijdens het extrusieproces. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 10 dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle zouten uit het gezuiverde recombinante eiwit te verwijderen vóór de vriesdroogstap en om er ook voor te zorgen dat de juiste concentratie van de spinkwal wordt gebruikt om verstopping van de naald tijdens het extrusieproces te voorkomen. Andere fibroïnes, zoals mes, P one TUSB one en P ysb one, kunnen worden gesponnen tot individuele vezels of als composieten om een breed scala aan biomaterialen te produceren. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de bio-engineering en materiaalkunde om het gebruik van synthetische spinnenzijde te verkennen voor toepassingen met implicaties in het militair-medische veld, de kunsten, de atletiek en de auto-industrie.Na het bekijken van deze video zou u een beter inzicht hebben in hoe u synthetische zijdevezels of composietmaterialen kunt spinnen met behulp van eiwitten die uit bacteriën zijn gezuiverd. Vergeet niet dat het werken met AFib uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken onder een zuurkast, altijd moeten worden toegepast tijdens het uitvoeren van deze procedure.

synthetic-spider-silk-production-on-a-laboratory-scale

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een efficiënte strategie om de zijde-producerende klieren te verwijderen uit de buik van de vrouwelijke zwarte weduwe spinnen. Deze procedure maakt het mogelijk een snelle isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren in een sterk gezuiverd, mode, een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen spinnenzijde productie en assemblage vezels.

Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren

Spinnenzijde vezels geven buitengewone mechanische eigenschappen.

Air Filter apparaten Inclusief geweven Netten van Electrospun Recombinant Spider Silk Eiwitten

Een protocol voor de microfluidic spinnen en karakterisering van de microstructuur van geregenereerde zijde fibroin monofilament wordt gepresenteerd.

Microfluidic droog-spinnen en karakterisering van geregenereerde zijde Fibroin vezels

Hier presenteren we een protocol voor de productie van water oplosbare recombinant Spider Silk Protein Solutions en de materiële vormen die kunnen worden gevormd uit deze oplossingen.

Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk

Weefselkweekinserts met plastic membranen zijn de gouden standaard in celkweeklaboratoria als permeabele dragers om cellagen en modellen van barrièreweefsels te vestigen. Hierin presenteren we een eenvoudige methode om het plastic membraan te vervangen door een biologisch relevanter membraan gemaakt van een recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde-eiwit.

Nanofibrillaire basale membraan nabootsen gemaakt van recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde in op maat gemaakte weefselkweekinzetstukken

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van...

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Mengen is een efficiënte benadering van biomaterialen met een breed scala van eigenschappen en gecombineerde functies te genereren. Door het voorspellen van de moleculaire interacties tussen de verschillende natuurlijke zijde proteïnen, kunnen nieuwe zijde-zijde eiwit legering platforms met instelbare mechanische veerkracht, elektrische reactie, optische transparantie, chemische verwerkbaarheid, biologische afbreekbaarheid, of thermische stabiliteit worden ontworpen.

Het ontwerpen van Silk-zijde Protein Alloy materialen voor biomedische toepassingen

We bieden gedetailleerde instructies voor de bereiding van monovalente gerichte quantum dots (mQD's) van fosforothioaat-DNA van gedefinieerde lengte. DNA-wikkeling vindt plaats met een hoge opbrengst en daarom hoeven de producten niet gezuiverd te worden. We demonstreren het gebruik van de SNAP-tag om mQD's te richten op celoppervlaktereceptoren voor live-celbeeldvormingstoepassingen.

Productie en Targeting van Monovalent Quantum Dots

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Leer synthetische spinnenzijde produceren door het natuurlijke spinnenproces na te bootsen. Deze methode gebruikt recombinante eiwitten uit bacteriën voor biomaterialen met toepassingen in de medische en technische industrie.

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

Meer video's verkennen