Name: Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van S. cerevisiae Zygoten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: Leer hoe je zuivere populaties gistzygoten (S. cerevisiae) verkrijgt via flowcytometrie met dubbele fluorescentiesortering. Deze methode bereikt ~90% zuiverheid en ondersteunt onderzoek naar de haploïde-diploïde transitie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. R. Michael Sramkoski voor hulp bij flowcytometrie, Dr Purnima Jaiswal en Dr Di Wu voor eerdere input en Ilya Aylyarov voor hulp bij de illustraties. Ondersteund door NIH Grant R01GM089872 en de Cytometry &amp; Imaging Microscopy Core Facility van de zaak Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

1. Haploïde Cell Growth <ol><li> Grow S. cerevisiae cellen van de S288C achtergrond (BY4741) onder standaard condities 10. </li><li> Transformeer haploiden om ofwel drukken van de twee opvallende fluorescerende markers 10. De markers keuze oplosbaar GFP expressie in het cytoplasma (pEG220, URA3/YIp, gelineariseerd met BglII 11) en een ribosomaal eiwit, RPL25, gefuseerd met mCherry (pAJ1661, URA3/CEN van A. Johnston). We verwachten dat gelijke tweekleurige zuivering protocollen kunnen het gebruik van andere heldere fluorescente eiwitten die worden gesynthetiseerd door de ouderlijke haploïde cellen. Als alternatief kan de celwand worden gelabeld met fluorescente lectinen. </li><li> Op de dag voorafgaande zygote zuivering inoculeren 5 ml cultures van elk celtype en groeien ze onder schudden overnacht bij 23 ° C te bereiken A600 niet meer dan 1,0. GFP groeien transformanten (ATY4442) in volledig synthetische medium dat 2% glucose (CSM-glucose) and RPL25-mCherry transformanten (ATY4552) in synthetische selectieve medium zonder uracil 10. Handhaven parallelle culturen van elk celtype onder schudden bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. Het uitvoeren van een kruis <ol><li> Stel de optische dichtheid (A600) van elk monster tot 1,0 in vers medium. [1 Optische dichtheid Eenheid ~ 3 x 10 7 cellen / ml] </li><li> Meng gelijke volumes van de twee culturen, vortex kort 3 maal, gevolgd door een langere vortex gedurende 10 sec. </li><li> Bereid CSM-glucose platen. De platen zijn identiek aan die gebruikt voor normale groei en gedroogd zijn 45 min na gieten en stollen van de agar 10. </li><li> Verdeel wel twintig 40 ml druppels van het mengsel 1 cm van de rand van het oppervlak van CSM-glucose platen. Wanneer de druppels worden eerst op het oppervlak de timer gestart meten verstreken tijd. Nadat de vloeistof is geabsorbeerd (ongeveer 30 min), betrekking hebben op de platen en laat ze ongemoeid op room temperatuur. </li></ol> 3. Oogsten Voorbereidingen <ol><li> Harvest monsters na 1,75-2,5 uur bij 23 ° C door herhaald wassen individuele gedroogde druppels van de plaat met 150 ml koud CSM-glucose, waardoor de platen op ijs. Herhaaldelijk was de druppel gebied 10-20 keer met hetzelfde medium tot herstel te maximaliseren. Verzamel in 15 ml Falcon buizen op ijs. </li><li> Probe ultrasone trillingen de monsters 10x bij 60% amplitude met een Fisher FB120 sonicator (120Watt, 120Volt, Freq 20 kHz) op ijs. </li><li> Controleer in een fase microscoop die weinig of geen aggregaten blijven. 15-50% van de cellen wordt verwacht dat gevormd zygoten op dit punt. </li><li> Laat de buis van cellen in verticale stand ongestoord op ijs gedurende 10 min bij verdere voorzorgsmaatregel (om aggregaten te regelen). </li><li> Herstel de bovenste 90% van het volume en filtreer deze over het nylon gaas (BD Falcon Polypropyleen buis met schroefdop (Ref 352235)). In een typisch experiment, 10 7 cellenhersteld van een plaat werden op dit punt verdund in 4 ml van CSM-glucose. </li></ol> 4. Flow Cytometry <ol><li> Sorteer cellen met behulp van de Sony iCyt Reflectie Model Flow Cytometer, (Highly Automated Parallel Sort) HAPS1 met een 100 micron tip. Voor GFP excitatie met de blauwe argon-ion, 250 milliwatt laser bij 488 nm. Voor mCherry excitatie, gebruik maken van de 100 milliwatt laser op 561 nm. Hoewel we geen ervaring met andere machines, verwachten we dat Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx of Beckman Coulter MoFlo XDP zou fijn zijn wanneer uitgerust met de juiste lasers. </li><li> Base sorteren parameters op een naar voren ten opzichte van back scatter plot om poort aan levensvatbare cellen. Oprichting van een emissie perceel van 615 + / - 30 nm banddoorlaatfilter (mCherry) versus 525 + / - 25 nm banddoorlaatfilter (GFP) op de gebeurtenissen in vier kwadranten verdelen, &quot;Rood + Groen-&quot;, &quot;Rood + Groen +&quot;, &quot;Red- Green-&quot;en&quot; rood-groen + &quot;(Figuur S2). Gebruik nonfluorescent cellen als standaard fof de bepaling van de &quot;Red-Green-&quot; kwadrant. </li><li> Soort cellen met een mantel druk van 21,5 psi, een druppel frequentie van 43.400 druppels / sec, en een monster druk van 20,5 psi. </li><li> Initial Sorteren (&quot;Recovery Mode&quot;): Verzamel monsters in gekoelde Eppendorf buisjes met 250 ml koud CSM-glucose. Sediment 10 sec op volle snelheid in een microcentrifuge gekoelde (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) en zuig de stroom oplossing (Flow cytometry mantel oplossing (PBS met 1 mM EDTA) BioSure Catalog No 1027). Resuspendeer in 500 ml koud CSM-glucose. </li><li> Tweede Sorteer (&quot;Zuiverheid Mode&quot;): Voer het soort als in het initiële sorteren met behulp van de &quot;zuiverheid modus&quot; optie. Sediment de gezuiverde cellen en de pellets in 500 ml 1,0-ml CSM-glucose mengen. Schud gedurende 15 min in 24-well platen bij 23 ° C metabole teruggevorderd. </li></ol> 5. DeltaVision Microscopie <ol><li> Bereid agarose pads als volgt: Breng een suspensie van 1,5% agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) in CSM-glucose aan de kook vortex kort en breng 0,3 ml van de agarose oplossing op het oppervlak van horizontale standaard glasplaatjes en ze tegelijkertijd bedekken met een tweede slede (zonder uitoefenen van druk). </li><li> Na afkoelen gedurende 10 minuten verwijdert de bovenste slede door hem horizontaal zorg om een ​​glad oppervlak te verlaten en niet te laag Agarose verstoren. (Wanneer de bovenste slede is verwijderd, moet het monster van cellen toegepast binnen 1-2 min. Bij bewaring in een vochtige kamer bij kamertemperatuur zonder de bovenslede, pads kan worden bewaard tot een dag voor gebruik.) </li><li> Sediment monsters en deposito porties van 1 ml van de pellet op agarose pads (zonder het aanraken van het oppervlak). Onmiddellijk wordt het monster bedekt met een vierkant nr. 1 dekglaasje aan. Knip overtollige agarose met een single-edged scheermes. Sluit de voorbereidingen met vaseline vrijgesteld van een spuit. </li><li> Beeld met behulp van Deltavision (Precisio Toegepasten) met een 100x olie immersie objectief zonder binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolutie z-stacks met het softWoRx 5.0.0 programma ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) en verwerken minimaal. Opeenvolgende z-vliegtuigen werden over het algemeen verzameld op 0,2-0,4 micron intervallen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Fluorescentie-intensiteit niveaus in getransformeerde haploïde cellen: Het niveau van fluorescentie in de haploïden is geïllustreerd in figuur S1. Voor het kruis, epifluorescerende onderzoek dat deze in hoofdzaak alle GFP transformanten groen waren en dat alle mCherry transformanten, maar vaak zwakker waren rood. Dat alle cellen voor het kruis inderdaad fluorescent waren we de subpopulatie met de helderste fluorescerende signaal. Opbrengst: After de eerste soort, de rood + groen + monster (figuur S2) omvat typisch 8-20% van de input aantal cellen en een buitensporig aantal haploïde cellen, misschien te wijten aan aanhoudende cel-cel adhesie. Aangezien hoog verrijkt wordt niet bereikt met een soort moet het gedeeltelijk gezuiverde monster probe gesonificeerd tweemaal bij 60% amplitude gevolgd door re-sortering. (Recovery sorteert duren meestal tussen 1-2 uur, terwijl de tweede soort heeft slechts 15 minuten.) Van de cellen blootgesteld aan de tweede soort, de rood + groen + monsters die 23-52% van de input cellen. Fase microscopisch onderzoek: Onderzoek door fasecontrast microscopie toonde dat de zuiverheid van het uiteindelijke preparaat zygote ongeveer 90% gemiddeld 21 preparaten (variërend van 86% tot 91%). De verontreinigingen waren groen of rood haploiden of paren van haploïden, die in contact met elkaar. Figuur 3 bevat het percentage van zygoten die moetengeen knop, mediale knoppen (Med), zijknoppen (Lat) of klem knoppen (Term), het aantal gepaarde haploiden van dezelfde kleur (&quot;2Same&quot;) of andere kleur (&quot;2Hap&quot;), evenals individuele haploiden ( HAP). Wanneer cellen werden geoogst na 1.75 uur, werden meer dan 50% unbudded en de andere subcategorieën (met mediale, laterale, of terminal knoppen) zijn gelijk vertegenwoordigd. Na 2,5 uur waren er ongeveer gelijke aantallen zygoten in elk van de vier categorieën (unbudded met mediale, laterale of terminale knoppen). Microscopische waarnemingen (figuur 4): De structuur van zygoten lijkt ongewijzigd tijdens zuivering. Afhankelijk van de duur van het kruis, de bevolking had verschillende verhoudingen van unbudded en gebloeid zygoten, zoals hierboven uitgelegd. Aangezien zowel de groene en rode haploiden toonde een aanzienlijke variatie in fluorescerende intensiteit van het signaal, wat zygoten waren overwegend rood terwijl anderen waren overwegend groen, zoals waargenomen door comparing de eenkleurige beelden naar de gecombineerde beelden in figuur 4. Merk ook op dat de GFP (MW 26kDa) de kern binnenkomt en vindt in de kern zelfs wanneer de kern niet gefuseerd. Vacuolen onderscheiden zich als zwarte niet-fluorescerende sferen. Het eindproduct van zuivering levert een diverse populatie in verschillende stadia van ontwikkeling. Zygoten label A hebben ondergaan fusie. Type B zygoten worden unbudded. Type C hebben een kleine knop. Type D hebben een grotere knop, en Type E zygoten gaat cytokinese ondergaan. Merk ook op dat veel van de eerdere zygoten nog niet fluorescerende mediale deellijn (*) vertonen, en dat de vacuolaire &quot;erfenis structuur&quot; (I) 12 kunnen vaak worden gezien van de zygote tot in de knop. In sommige gevallen heeft het groene signaal verdeeld in de partner in veel sterkere mate dat het rode signaal. Dit geeft de vertraging van overdracht die kenmerkend polysomen (Tartakoff, in voorbereiding). 6 zygoten, wat voldoende is voor vele immunoblots, met chemiluminescente detectie procedures. Met fenol-chloroform isolatieprocedures we ongeveer 1,5 mg van RNA te extraheren uit deze aantal cellen. Aangezien het gezuiverde zygoten werden gekoeld voorafgaand aan verdere analyse raden incubatie bij 23 ° C in kweekmedium. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figuur 1. Chronologie van de zygote vorming. Zygoten als intermediair tussen haploiden en diploïden. Deze grafiek toont de klassieke activering (shmooing) van haploiden hun fusie en de vorming van de eerste bud. Knoppen kan zowel mediaal (M), laterale (L) of terminal (T). <imgalt = &quot;Afbeelding 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. Schema van de zygote zuiveringsprotocol. Na incubatie op het oppervlak van agarplaten in compleet medium met glucose, het celmengsel werd gewonnen door wassen en vervolgens onderworpen aan een eerste soort in &quot;recovery mode&quot; gevolgd door een tweede soort in &quot;zuiverheid mode. &quot; De gele kleur geeft aan dat zowel mCherry en GFP signalen waren zichtbaar in de zygoten. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figuur 3. Rassen van zygoten in het gezuiverde fracties. Paring mengsels werden geoogst na 1,75 of 2,5 uur tot fracties, aangerijkt met relatief vroeg vs relatief meer volwassen zygoten herstellen. Acht onafhankelijke experimenten door de verschillende kleuren, werden uitgevoerd voor elk tijdstip. De grafieken geven de relatieve aantallen van zygoten die have ruimtelijk verschillende patronen van knopvorming. Gezien de korte duur van de incubatie (minder dan 2,5 uur bij kamertemperatuur) waargenomen alle knoppen zijn oorspronkelijke zygote ontluikende events. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figuur 4. DeltaVision onderzoek van verrijkte fracties. Een typische gebied werd onderzocht door Deltavision microscopie. De afbeeldingen tonen ofwel beide rood en groen of een kleur. De rode overeen met de polysomal label (Rpl25p-mCherry) en groen cytosolische GFP. Let op de hoge verrijking van zygoten en de aangewezen subcellulaire features: de vacuole (v), knoppen (b), nucleus (n), vacuolaire &quot;overerving structuur&quot; (i), en de scheidingswand (*) die lijkt te scheiden ouderlijke domeinen in relatief vroege zygoten. Hun variabele algehele kleur geeft de relatieve intensiteit van de haploïden die gefuseerd. In gevallen waarin de twee ouderlijke domeinen behoudeneen duidelijke kleur, evenwicht van de markers (cytoplasmatische GFP, mCherry-gelabeld polysomen) was onvolledig. Time-lapse studies in uitvoering tonen aan dat oplosbare GFP herverdeelt voorafgaand aan polysomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . Aanvullende Legends <img alt="Figuur S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figuur S1. Fluorescentie van haploïde cellen Uiterst links:. Cellen die mCherry-tagged polysomen werden onderzocht om een groen signaal te detecteren. De rechthoekige raam werd ingesteld op de negatieve cellen te voorkomen. Midden-grafiek: Cellen die cytosolische GFP werden geanalyseerd, met de duidelijk heldere belangrijkste populatie van positieven. Uiterst rechts: Cellen die mCherry-tagged polysomen werden geanalyseerd. De rechthoek (identiek aan dat op uiterst links) omvat de helderste cellen en kunnen allenegatieven te vermijden. De aanduiding &quot;R2&quot; geeft het percentage cellen teruggewonnen binnen de aangegeven rechthoek. <img alt="Figuur S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figuur S2. Cel distributie in de eerste en tweede sortering. Deze twee kleuren plots geven het aandeel van groen + rood + cellen in het kwadrant rechtsboven (R5). Dit percentage stijgt tot 52% in het tweede soort. Horizontale as: groen signaal. Verticale as: rood signaal.

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li>
<li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li>
<li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li>
<li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li>
<li>Dujon, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDujon%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Yeast+Saccharomyces%3A+Life+Cycle+and+Inheritance%22">Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance</a>. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).</li>
<li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+yeast+mating+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li>
<li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mating%3A+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li>
<li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+mating+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li>
<li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+D+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%2C+2005+Edition%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2005).</li>
<li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li>
<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De beschikbaarheid van gezuiverde zygoten moet biochemische studies waaronder transcriptomics, proteomics en lipidomics, alsmede onderzoek mechanismen waardoor zygoten ondergaan celcyclus opnieuw binnenkomen, celwand remodelleren budding en overerving kenmerken, enz. Alternatief vergemakkelijken, kunnen worden gegenereerd vanaf zygoten met stammen die karakteristieke mutaties in een of beide ouders. Bovendien, de gezuiverde zygoten, zoals op haploïde of diploïde cellen worden ingevroren in medium met 15% glycerol en lat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / Equipment </td><td> Bron </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codeert cytoplasmatische GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, codering RPL25 gefuseerd met mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polypropyleen buis met schroefdop </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Gekoelde microcentrifuge </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Flowcytometrie schede oplossing </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Reflectie Model Flow Cytometer </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvolutie microscoop </td><td> Toegepaste Precision </td><td></td></tr><tr><td> Upright epifluorescentiemicroscoop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15.510-07 </td></tr><tr><td> CSM glucose formulering Opmerkingen: Voor agarplaten gewoon omvatten 2% agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flowcytometrie gebaseerde zuivering van<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; zygoten

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygoten zijn essentiële tussenproducten tussen haploïde en diploïde staten in de levenscyclus van veel organismen, met inbegrip van gist (figuur 1) 1. S. cerevisiae zygoten resultaat van de fusie van haploïde cellen van verschillende mating type (MATa, MATalpha) en leiden tot overeenkomstige stabiele diploïde die achtereenvolgens genereren liefst 20 diploïde nakomelingen als gevolg van hun opvallend asymmetrische mitotische delingen 2. Zygote vorming georkestreerd door een complexe reeks gebeurtenissen: Hierbij oplosbare mating factoren binden aan receptoren verwant, triggering receptor-gemedieerde signaaltransductie cascades die onderbreking van de celcyclus en uitmonden vergemakkelijken cel-cel fusie. Zygoten kan worden beschouwd als een model van voorlopercellen of stamcellen functie. Hoewel er veel is geleerd over de vorming van zygoten en hoewel zygoten zijn gebruikt om cel-moleculaire aangelegenheden van algemeen signi onderzoekenicance, bijna alle studies hebben gebruik gemaakt van de paring mengsels waarin zygoten worden vermengd met een meerderheid van de bevolking van de haploïde cellen 3-8. Veel aspecten van de biochemie van zygote vorming en de voortgaande leven van de zygote blijven dan ook niet onderzocht. Rapporten van zuivering van gist zygoten beschreven protocollen gebaseerd op hun sedimentatie eigenschappen 9, maar dit sedimentatie gebaseerde procedure leverde geen bijna 90% zuiverheid in handen. Bovendien heeft het nadeel dat cellen blootgesteld aan hypertone sorbitol. Wij hebben een veelzijdig zuiveringsprocedure. Daartoe paren haploïde cellen die rood of groen fluorescerende eiwitten werden geco-incubeerd met zygote vorming geoogst op verschillende tijdstippen, en de resulterende zygoten werden gezuiverd met een flow cytometrie gebaseerd sorteren protocol. Deze techniek biedt een handige visuele beoordeling van zuiverheid en rijping. De gemiddelde zuiverheidvan de fractie ongeveer 90%. Volgens de timing van de oogst, kan zygoten van verschillende graden van rijpheid worden hersteld. De gezuiverde monsters zorgen voor een geschikt punt van vertrek voor &quot;-sche&quot; studies, voor het herstel van de initiële nakomelingen, en voor systematisch onderzoek van deze stamceltransplantatie.

Om zygoten van zuiveren<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Werden haploïde cellen van tegengestelde mating type gemanipuleerd om rood of groen fluorescerende eiwitten, co-geïncubeerd tot zygote vorming mogelijk te maken en gefractioneerd met een flowcytometrie-based protocol drukken. De zeer verrijkte fractie maakt daaropvolgende &quot;-sche&quot; studies, het herstel van de initiële nakomelingen, en systematisch onderzoek van de zygote morfogenese.

Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoten

Zygoten zijn essentiële tussenstadia tussen haploïde en diploïde toestanden in de levenscyclus van veel organismen, waaronder gist (Figuur 1) 1. S. cerevisiae ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een gezuiverde populatie gistzygoten te genereren. Dit wordt bereikt door eerst cytoplasmatisch GFP- of M-cherry-getagde polyzonen tot expressie te brengen in haploïde cellen van tegengestelde paringstypes; deze cellen worden gegroeid tot de logaritmische fase, vervolgens gecombineerd en samen geïncubeerd om de vorming van zygoten mogelijk te maken.Het paringsmengsel wordt vervolgens geoogst en via flowcytometrie in herstelmodus gesorteerd om rood-groen dubbelpositieve cellen te isoleren. Deze subpopulatie bevat zowel prezygotische als zygotische entiteiten. Om het monster verder te zuiveren, wordt de rood-groen dubbelpositieve populatie onderworpen aan een tweede ronde van flow-sortering.Gebruik van de zuiverheidsmodus. Deze procedure resulteert in een gemiddelde zuiverheid van 90% zygoten op basis van visuele inspectie en kwantificering van de cellen via fluorescentiemicroscopie. De voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals sedimentatiegebaseerde zuivering, zijn als volgt.Ten eerste biedt deze techniek een handige visuele beoordeling van de zuiverheid en rijping van de zygota. Ten tweede is de gemiddelde zuiverheid van de zygotische fractie in onze praktijk ongeveer 90%, wat aanzienlijk hoger is dan bij bestaande methoden. Onze zuiveringsmethode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de overgang van haploïd naar diploïd in eukaryote cellen op moleculair niveau, aangezien er aanzienlijke conservatie bestaat tussen lagere en hogere eukaryoten.Daarom zou het bestuderen van gistzygoten het algemene begrip van de biologie van zygoten moeten bevorderen. Men kan betogen dat zygoten ook beschouwd kunnen worden als een model voor de functie van progenitorcellen of stamcellen Grow s cera, VCA, Matt A en Matt alpha BY 47 41. Kweek cellen door bevroren giststammen uit te strijken op een vaste agar-groeimedium en de platen te incuberen bij kamertemperatuur of 30 °C tot er op de dag vóór de zygote-zuivering kolonies aanwezig zijn. Label twee conische buizen van 50 mL voor het kweken van getransformeerde tabloïds als oplosbaar GFP en RPL 25 M.Cherry. Inoculeer één cultuur met getransformeerde tabloïds die oplosbaar GFP in het cytoplasma tot expressie brengen, en één met getransformeerde tabloïds die een enkel ribosomaal eiwit tot expressie brengen.RPL 25 gefuseerd met m cherry. Kweek de culturen overnacht onder schudcondities bij 23 °C tot een A 600 die niet hoger is dan 1,0. Om vervolgens een kruising uit te voeren, wordt eerst de optische dichtheid van elk monster bijgesteld naar 1,0 in vers medium, wat ongeveer overeenkomt met drie keer 10⁷ cellen per milliliter.Meng vervolgens gelijke volumes van de twee culturen in vers medium in een conische buis van 50 milliliter. Vortex kort drie keer en vortex daarna gedurende 10 seconden. Plaats vervolgens een pipetpunt één centimeter boven het oppervlak van de kamer.Temperatuur-CSM glucoseplaat. Start een timer voor 30 minuten en verdeel onmiddellijk druppels van 40 µL van de gemengde culturen langs de rand van de plaat over de gehele omtrek. Laat de platen ongeveer 30 minuten met het open lek op het aanrecht drogen.Zodra de vloeistof is geabsorbeerd, worden de platen afgedekt en ongestoord bij kamertemperatuur gelaten voor 1,75 tot 2,5 uur. Het proces van gepolariseerde groei creëert de kenmerkende schmo-achtige morfologie. Tijdens de schmo-fase blijven de twee haid-cellen naar elkaar toe groeien totdat er cel-celcontact wordt bereikt.Vervolgende cel-cel-fusie resulteert in de vorming van de zygote. De ontstane zygote gaat vervolgens opnieuw het mitotische celcyclus in, wat leidt tot de eerste diploïde knop. Plaats na de incubatie de platen op ijs en oogst de monsters door de individuele gedroogde druppelgebieden 10 tot 20 keer te wassen met 150 µL koude CSM-glucose.Verzamel de wasoplossing in conische buisjes van 15 milliliter op ijs. Sonicate vervolgens elk van de buisjes 10 keer met een probe-sonicator bij 60% amplitude, terwijl de monsters op ijs worden bewaard. Verifieer na sonificatie met een fasecontrastmicroscoop of er nog weinig tot geen aggregaten aanwezig zijn; er wordt verwacht dat 15 tot 50% van de cellen zygoten heeft gevormd. Laat de buis met cellen vervolgens als voorzorgmaatregel 10 minuten ongestoord in verticale positie op ijs staan, zodat eventuele resterende aggregaten kunnen bezinken.Herstel de bovenste 90% van het volume en filtreer dit door een nylonmazige polypropyleenbuis met een zeefkap. In een typisch experiment worden 10⁷ cellen teruggewonnen uit één plaat en vier milliliter CSM. De sortering van glucose-cellen wordt uitgevoerd met een Sony eyesight reflection model flowcytometer met een HAPS one met een 100 micron tip.Begin met het selecteren van de excitatielasers in de win list 3D-software voor GFP-excitatie. Gebruik de blauwe Argonne ion 500 milliwatt laser bij 488 nanometer voor M cherry-excitatie. Gebruik de 100 milliwatt laser bij 561 nanometer in de HAPS-besturingssoftware.Zorg ervoor dat de herstelmodus (recovery mode) is geselecteerd en dat de sheath-druk voor sortering is ingesteld op 21,5 pounds per square inch met een druppel Frequentie van 43.400 druppels per seconde en een monsterdruk van 20,5 pounds per square inch. Baseer de sorteringsparameters op een plot van forward scatter versus back scatter om de levensvatbare cellen te selecteren (gaten). Let op dat de hier gebruikte Sony eyesight-machine de side scatter-plot uniek aanduidt als back scatter, maar deze back scatter is functioneel gelijk aan side scatter. Stel een emissieplot op van M cherry versus GFP om de events in vier kwadranten te verdelen.Rood positief, groen negatief, rood negatief, groen positief, rood negatief, groen negatief en rood positief, groen positief. Gebruik niet-fluorescerende cellen als standaard voor de bepaling van het rood-negatieve, groen-negatieve kwadrant. Voor de initiële sortering.Selecteer de herstelmodus en verzamel de monsters in gekoelde microcentrifugebuisjes met 250 milliliters koud CSM-glucose. Na de verzameling worden de cellen 10 seconden op maximale snelheid gecentrifugeerd in een gekoelde microcentrifuge; aspireer na het centrifugeren de flow-oplossing en resuspendeer de cellen in 500 microliters koud CSM-glucose.Aangezien een hoge verrijking niet met een enkele sortering wordt bereikt, wordt het gedeeltelijk gezuiverde monster kort twee keer geprobeerd gesoneerd bij 60% amplitude. Sorteer de cellen opnieuw, dit keer met de purity mode optie gate op levensvatbare cellen, en stel een emissieplot op van M cherry versus GFP sediment, de gezuiverde cellen, en resuspendeer de pellets in 0,5 tot 1,0 milliliter CSM glucose. Breng na het centrifugeren 0,5 milliliter over naar elk van de wells van 24-well platen en schud de cellen vervolgens gedurende 15 minuten.In 24-wells platen bij 23 graden Celsius om metabool herstel mogelijk te maken. Om agros-pads voor te bereiden, brengt men een suspensie van 1,5% agros in CSM-glucose aan de kook in een conische buis van 15 milliliter. Vortex de oplossing kort en breng vervolgens monsters van 0,3 milliliter van de agro-oplossing aan op het oppervlak van ten minste twee tot drie standaard glasplaatjes; dek de plaatjes onmiddellijk af met een tweede glasplaatje.Oefen geen druk uit. Laat de objectglaasjes 10 minuten afkoelen. Als de aros-pads niet onmiddellijk worden gebruikt, plaats ze dan in een bevochtigingskamer bij kamertemperatuur zonder het bovenste objectglas te verwijderen.Deze kunnen tot een dag worden bewaard. Verwijder vervolgens voorzichtig het bovenste dekglas door het horizontaal weg te schuiven. Zorg voor een glad oppervlak en verstoor de aros-laag niet; breng binnen één tot twee minuten snel aliquots van 1 µL gesedimenteerde cellen aan op de aros-pads zonder het oppervlak aan te raken.Dek het monster onmiddellijk af met een vierkant dekglas en trim het overtollige agar weg met een eenzijdig scheermesje. Gebruik een spuit om vaseline langs de randen van het dekglas aan te brengen. Leg beelden vast met DeltaVision met een 100 x olie-immersieobjectief zonder binning. Een ideaal gezichtsveld is een veld dat een enkele laag cellen toont met voldoende ruimte ertussen om individuele cellen te onderscheiden; beeldvorming vindt plaats met intervallen van 0,2 tot 0,4 micron zodra de beeldvorming is voltooid.Voer de deconvolutie van de Z-stacks uit met het programma SoftWorks 5.0 0.0 en verwerk deze minimaal met een standaard deconvolutie van 20 cycli. Pas de intensiteit van de rode versus groene fluorescentie aan om elk achtergrondsignaal in de gedeconvolueerde beelden te minimaliseren. Om de expressie van fluorescerende eiwitten in de getransformeerde cellen te beoordelen, werden de cellen vóór en na het uitvoeren van een kruising geanalyseerd middels flowcytometrie. In wezen waren alle M cherry-transformanten rood en alle GFP-transformanten groen.Let op dat hoewel het M-cherry-signaal minder intens was dan het GFP-signaal, het met zowel cytometrie als fluorescentiemicroscopie werd gedetecteerd. De cellen werden gesorteerd en de helderste cellen, die in het R2-kwadrant verschijnen, werden geselecteerd en gedurende 2,5 uur samen met de GFP-transformant gekweekt, zoals hier te zien is. Het rood- en groen-positieve monster vertegenwoordigde 8,89% van de totale populatie na de kruising.Dit werd verrijkt tot 52,4% na de eerste herstelsortering, en vervolgens verder verrijkt met de tweede zuiverheidssortering waarbij 21 vergelijkbare preparaten van rood-positieve groene-positieve cellen werden onderzocht via fasecontrastmicroscopie. Om het aantal zygoten te beoordelen, was de gemiddelde zuiverheid 90%. De contaminanten waren ofwel groene of rode haploïden, of paren haploïden die in contact stonden om de kinetiek van de initiële zygote-knopvorming te bepalen, evenals de incidentie en distributie van mediale, laterale en terminale locaties van zygote-knoppen. Haploïden werden gedurende 1,75 uur of 2,5 uur gekruist, gesorteerd via flowcytometrie en vervolgens onderzocht met epifluorescentiemicroscopie.Wanneer de cellen na 1,75 uur werden geoogst, was meer dan 50% onbeknoppend en mediaal. Laterale of terminale knoppen waren na 2,5 uur gelijkmatig vertegenwoordigd. Er waren echter ongeveer gelijke aantallen zygoten in elk van de vier categorieën: onbeknoppend met mediale, laterale of terminale knoppen.De structuur van de zygoten lijkt ongewijzigd te blijven tijdens de zuivering. Let op dat het GFP de kern binnendringt en in de kern kan worden aangetroffen, zelfs wanneer de kernen nog niet zijn gefuseerd. ES vallen op als zwarte, niet-fluorescerende sferen.Het eindproduct van de zuivering levert een diverse populatie op in verschillende ontwikkelingsstadia. Zygoten gelabeld als A hebben geen fusie ondergaan. Type B zygoten zijn onbeboterd.Type C heeft een kleine knop, type D heeft een grotere knop, en zygote type E staat op het punt om cytokinese te ondergaan; let er ook op dat veel van de eerdere zygoten nog steeds een niet-fluorescerende mediale delingslijn vertonen en dat de valaire overervingsstructuur vaak tot vanuit de zygote in de knop kan worden gezien. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zowel de herstelsortering als de daaropvolgende zuiverheidssortering op te nemen. We hebben vastgesteld dat de tweede sortering essentieel is voor het verhogen van de zygotische zuiverheid van het eindproduct.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u gezuiverde zygoten via flowcytometrie kunt genereren, de zuiverheid via microscopische methoden kunt beoordelen en hoe u zygoten kunt mounten en fotograferen met behulp van fluorescente deconvolutie-microscopie.

flow-cytometry-based-purification-of-s-cerevisiae-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

We beschrijven een sorteerstrategie voor muis spermatiden met behulp van flowcytometrie. Spermatiden worden ingedeeld in vier zeer zuivere populaties, waaronder ronde (spermiogenetische stappen 1-9), vroege verlengende (spermiogenetische stappen 10-12), late verlengende (spermiogenetische stappen 13-14) en langwerpige spermatiden (spermiogenetische stappen 15-16). DNA-kleuring, grootte en korreligheid worden gebruikt als selectieparameters.

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Deze test is een eenvoudige methode om hematopoëtische cellen te kwantificeren bij de ontwikkeling van embryonale zebravissen. Bloedcellen van gedissocieerde zebravissen worden onderworpen aan flow cytometrie analyse. Dit maakt het mogelijk om bloeddefecten bij gemuteerde dieren en na genetische modificatie te detecteren.

Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Leer hoe je zuivere populaties gistzygoten (S. cerevisiae) verkrijgt via flowcytometrie met dubbele fluorescentiesortering. Deze methode bereikt ~90% zuiverheid en ondersteunt onderzoek naar de haploïde-diploïde transitie.

Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van

Meer video's verkennen