Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

Het algemene doel van deze procedure is het oogsten van multipotente stromale cellen uit vetweefsel voor osteogene differentiatie, gebruikmakend van een in vivo calvariaal defectmodel in een muis. Dit wordt bereikt door eerst progenitorcellen te isoleren uit de stroma-vasculaire fractie van vetweefsel, die verkregen kan worden na een liposuctieprocedure. De volgende stap is het voorbereiden van een driedimensionaal raamwerk en vervolgens het zaaien van de cellen op dit scaffold.

De laatste stap is het creëren van een kritiek groot calvaria-defect in een ratmodel, waarin het steigerwerk en de cellen worden geplaatst. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat multipotente stromale cellen geïsoleerd uit vetweefsel potentie hebben voor skeletregeneratie in vivo. De toepassingen van deze techniek hebben een breed spectrum aan mogelijke klinische toepassingen vanwege het tekort aan beschikbaar weefsel voor skeletregeneratie.

Hoewel autologe bottransplantaten de gouden standaard vormen, worden deze opties beperkt door een gebrek aan donorplaatsen en morbiditeit op de donorplaats. Allotransplantaten en vreemde materialen kunnen worden gebruikt, maar zijn beperkt door de kosten, een slechte integratie en het risico op infecties.

Het mogelijke gebruik van adipose of vetweefsel voor de isolatie van progenitorcellen voor skeletale weefselengineering is veelbelovend. De procedure zal worden gedemonstreerd door mijzelf en Michael Chung uit het long anchor laboratorium. Verkrijg eerst menselijk subcutaan adipose weefsel via electieve lipoaspiratieprocedures.

En let op de twee lagen in het lipo-aspiraat. De supernatant bevat het overgrote deel van het cellulaire materiaal uit het proces. De onderste laag bestaat voornamelijk uit geïnjecteerde zoutoplossing.

Stromale cellen afgeleid van vetweefsel kunnen uit beide lagen worden geoogst, maar de opbrengst is veel groter uit het supernatant. Om de stromovasculaire fractie of SVF te isoleren, wordt het lipo-asperaat uitgebreid gewassen met gelijke volumes van 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS die 2,5% Betadine bevat; aspireer vervolgens een gelijk volume 1x PBS zonder Betadine. Laat het wassel bezinken.

Zorg ervoor dat gedurende het hele proces een steriele techniek wordt gehanteerd om contaminatie met bewerkt menselijk weefsel te voorkomen. Aspireer vervolgens de onderste laag en gooi deze na elke wasbeurt weg, en breng 15 milliliters vetweefsel over in 50 milliliter Falcon conische buizen. Verteer daarna het vetweefsel in 15 milliliter gefilterde 0,075% gefilterde.

Voeg type twee collagenase toe in Hank's gebalanceerde zoutoplossing of HBSS bij 37 °C in een waterbad gedurende 60 minuten onder constante agitatie; zorg ervoor dat de buisjes elke 15 minuten worden geventileerd. Neutraliseer vervolgens de enzymactiviteit met 15 ml PBS bevatten 10% foetaal runderserum of FBS en centrifugeer. Om een SVF-pellet met hoge dichtheid te verkrijgen, zal het pellet een mengsel zijn van uit vetweefsel afgeleide stamcellen en erytrocyten.

Verwijder eerst de bovenliggende vetlaag en verwijder vervolgens de bovenliggende vloeistoflaag zonder het pellet te verstoren. Resuspendeer het pellet in 10 milliliters traditioneel groeimedium. Voeg daarna de drie buisjes samen in één schone conische buis van 50 milliliter via een filter van 100 micron en centrifugeer.

Verwijder het supernatant zonder het pellet te verstoren en resuspendeer vervolgens het pellet. Combineer in vijf milliliter traditioneel groeimedium twee conische buizen van 50 milliliter per plaat van 10 centimeter, of vijf conische buizen van vijf milliliter voor één plaat van 15 centimeter. Stel de primaire culturen gedurende de nacht op bij 37 °C met 21% zuurstof en 5% kooldioxide.

Was na een overnacht-incubatie de platen met PBS om resterende niet-adherente rode bloedcellen te verwijderen. De resulterende celpopulaties zijn uit vetweefsel afgeleide stromale cellen. Houd de cellen op subconfluente niveaus om spontane differentiatie te voorkomen.

Bij 37 °C, 21% oxygen en 5% carbon dioxide. In groeimedium moeten de cellen over het algemeen elke drie tot vier dagen worden gesplitst in regulier groeimedium. Wanneer ze worden uitgeplaat bij 50% confluentie, dient het scaffold te worden voorbereid zoals uitgelegd in het bijbehorende manuscript.

Wanneer de cellen subconfluente niveaus bereiken, was de cellen tweemaal met PBS en trypsiniseer deze. Tel de cellen om ze te kwantificeren. Voor het zaaien wordt voorbereid om de cellen op vooraf uitgesneden scaffolds met een diameter van 4 mm te zaaien met 1,5 × 10⁵ cellen.

Plaats een individueel scaffold in één well van een 96-well plaat en resuspendeer vervolgens de cellen in regulier groeimedium met een concentratie van ongeveer 1,5 × 10⁵ cellen per 20 µL medium. Bezaai het scaffold door 20 µL van de oplossing direct in het scaffold te pipetteren en plaats dit gedurende 30 minuten in de celkweekincubator.

Voeg na 30 minuten 200 µL medium toe en laat de cellen een nacht incuberen op het scaffold. Voorafgaand aan de operatie is het niet nodig om de adhesie van cellen op het scaffold te controleren zoals bij het zaaien. Een voldoende aantal cellen zal waarborgen dat de meerderheid zich aan het scaffold hecht.

Nadat een volwassen CD1 nude muis van 60 dagen oud is geanestheseerd, wordt de operatielaocatie drie keer gesteriliseerd met Betadine en alcohol, waarna er glijmiddel op de ogen van de muis wordt aangebracht. Maak vervolgens een midline sagittale incisie in de hoofdhuid van de muis om het rechter pariëtaalbeen bloot te leggen. Verwijder het periost van het rechter pariëtaalbeen door middel van stomp schrapen.

Maak vervolgens een unilateraal defect van vier millimeter over de volledige dikte in het rechter pariëtaal bot, buiten de sutuurgebieden. Gebruik een diamantgecoate tandenboor en wees uiterst voorzichtig om de onderliggende dura mater niet te beschadigen, aangezien de dikte van het schedeldak van de muis vóór implantatie minder dan 0,3 millimeter bedraagt. Spoel de scaffolds met steriele PBS om overdracht van groeifactoren uit het medium te voorkomen.

Plaats het steunstructuur in het defect. Hecht tot slot de huid en monitor het dier volgens de vastgestelde postoperatieve protocollen. Voer een micro CT uit op de muis en verkrijg een 3D-gereconstrueerd beeld met behulp van microview-software.

Gebruik Adobe Photoshop om de afbeeldingen op een standaardhoogte te schalen. Normaal gesproken meten we elke twee weken de calvariale regeneratie. De muizen worden tijdens de scan voor de langetermijnfollow-up geanestheseerd en uiteindelijk geëuthanaseerd.

Gebruik voor histologische analyse de 'magic wand'-functie om de pixels van het calvariale defect te meten. Bepaal het percentage genezing van het defect aan de hand van opeenvolgende CT-scans. Meet het oppervlak van het calvariale defect, bepaal het aantal pixels en deel dit door het aantal pixels van het oorspronkelijke defect; kleur vervolgens meerdere coupes over de gehele breedte van het defect met histologische kleurstoffen zoals anilineblauw en pen aro om botvorming aan te duiden.

Gebruik Adobe Photoshop om alle gebieden buiten het calvariale defect weg te snijden en gebruik de tohertool (magic wand) om het aantal pixels van de novo botvorming in het gebied van het defect te bepalen, en vergelijk dit met controles of andere variabelen. Hier is een overzicht van het oogsten en toepassen van lipo-aspiraat, van de isolatie van adipose-afgeleide stromale cellen tot hun expansie, differentiatie en gebruik in vitro en in vivo. Hier is een micro-CT die de in vivo genezing van het calvariale defect van kritieke omvang laat zien met de toepassing van ASC's via een hydroxyapatiet-steunstructuur, te zien in de onderste rij.

Controles, die in de bovenste rij te zien zijn, omvatten geen scaffold en defect. De middelste rij toont het defect met plaatsing van de scaffold zonder cellen. LS, hier weergegeven, is de kwantificering van de botgenezing op basis van micro-ct, wat een significant verhoogde genezing laat zien in de A SC-groep.

Dit is een histologische afbeelding die een toename van de botvorming in de A SC-groep via andal laat zien. In blauw en pen AROM-kleuring voor al. In blauw kleurt het osteoïd donkerblauw voor pen arom.

De hier getoonde geelgekleurde osteoïde bestaat uit menselijke ASC's gelabeld met GFP, die op een scaffold werden gezaaid en na twee weken zijn opgeofferd. De kleuring is uitgevoerd met een GFP-gelabeld antilichaam om de menselijke cellen aan te tonen die bijdragen aan de regeneratie in het defecte gebied. Hier is de immunochemie van het menselijk nucleair antigeen te zien, wat de prevalentie van menselijke cellen in het defecte gebied na twee weken aantoont.

Zodra de techniek onder de knie is, kan de verwerking van het vetweefsel binnen vier uur worden voltooid en de chirurgische procedure ongeveer 10 minuten per muis in beslag nemen. Het is belangrijk om te onthouden dat het pariëtale bot rond is terwijl de boor plat is, dus er moet zorgvuldig worden gewerkt om de volledige omtrek van het defect van 4 mm te doorboren. Ga langzaam te werk om beschadiging van de dura mater in de hersenen te voorkomen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de progenitorcellen uit het vetweefsel isoleert. Zaai deze cellen uit op een steiger en plaats deze in de muis.