Name: Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T10:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer het isoleren van adipose-afgeleide stromale cellen uit lipoaspiraat voor botregeneratie in een kritische calvariale defectmodel bij muizen. Deze methode toont het potentieel voor klinische toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Dr George Commons en Dr Dean Vistnes bedanken voor hun steun en medewerking van ons onderzoek. Dit werk wordt ondersteund door National Institute of Dental en Craniofaciale Onderzoek vergoedingen 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 en RC2 DE020771-02, de Oak Foundation en Hagey Laboratorium voor Pediatrische regeneratieve geneeskunde voor de MTL Dr Hyun wordt ondersteund door de Saint Joseph Mercy Hospital GME .

1. Cell Isolatie en Expansie <ol><li> Alle toestemming van de patiënt en de experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door Stanford University Institutional Review Board (Protocol # 2188 en # 9999). </li><li> Zorg voor menselijk onderhuids vetweefsel van electieve lipoaspiratie ingreep onder plaatselijke / algemene verdoving. </li><li> Er zullen twee lagen in de lipoaspirate (Figuur 1A). De supernatant bevat het overgrote deel van de verwerkte celmateriaal. De onderste laag wordt meestal geïnjecteerd zoutoplossing. Adipose-afgeleide stromale cellen kunnen worden geoogst uit beide lagen, maar de opbrengst is veel groter uit de supernatant. </li><li> De stromale vasculaire fractie (SVF) isoleren uitgebreid wassen lipoaspirate met gelijke volumes 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2,5% betadine (x2), gevolgd door gelijk volume 1X PBS (x1) zonder betadine. Laat de was neer te slaan. </li><li> Wees voorzichtig om steriel te houdenchnique gedurende het gehele proces als verontreiniging met verwerkte menselijk weefsel kan gebeuren. </li><li> Zuig de onderste laag en gooi na elke wasbeurt. </li><li> Aliquot 15 ml van vetweefsel in 50 ml BD Falcon conische buizen. </li><li> Digereren van het vetweefsel met een gelijk volume (15 ml) gefiltreerd 0,075% collagenase Type II in Balanced Salt Solution Hank&#39;s (HBSS) bij 37 ° C in een waterbad gedurende 60 minuten onder constant roeren (ca. 180 schudt / min) - ventileren elke buis om de 15 minuten. </li><li> Neutraliseer enzymactiviteit met 15 ml PBS dat 10% (foetaal runderserum) FBS en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C tot een hoge dichtheid SVF pellet te verkrijgen. De pellet wordt een mix van vet-afgeleide stromale cellen en erytrocyten zijn. </li><li> Giet het supernatans zonder verstoring van de pellet. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 ml van de traditionele groeimedia (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicilline-streptomycine oplossing). </li><li> Filter schorsing<html> sie door een 100 um nylon cel zeef om cellulaire vuil te verwijderen. </li><li> Combineer 3 tubes in een schone 50 ml conische. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Giet het supernatans zonder verstoring van de pellet. </li><li> Resuspendeer de pellet in 5 ml van de traditionele groeimedia </li><li> Combineer twee 50 ml conicals per een 10 cm plaat of vijf 50 ml conicals voor een 15 cm plaat. </li><li> Overnacht vast primaire kweken bij 37 ° C/21% O2, 5% CO2. </li><li> Na incubatie gedurende de nacht, uitgebreid wassen van de platen met PBS om de resterende niet-hechtende rode bloedcellen te verwijderen. De resulterende celpopulaties zijn adipose afgeleide stromacellen. </li><li> Handhaaf de cellen op sub-confluente niveaus aan spontane differentiatie voorkomen bij 37 ° C/21% O2, 5% CO2 in groeimedia. De cellen moeten normaal verdeeld drie tot vier dagen in normale groeimedia bij het uitplaten op 50% confluentie. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Steiger Voorbereiding <ol><li> Steigers werden gemaakt door Dr Min Lee aan de Universiteit van Californië, Los Angeles - School voor Tandheelkunde. </li><li> PLGA scaffolds zijn vervaardigd van 85/15 poly (melkzuur-co-glycolzuur) (inherente viscositeit = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) door oplosmiddelgieten en een deeltjesvormig uitloogproces. </li><li> PLGA / chloroform oplossingen werden gemengd met 200-300 urn diameter sucrose tot 92% porositeit (volumefractie), en samengeperst tot dunne vellen in een Teflon vorm te verkrijgen. </li><li> Na vriesdrogen nacht werden scaffolds ondergedompeld in drie veranderingen tweevoudig gedestilleerd (dd) H 2 O de sucrose op te lossen en voorzichtig uit de Teflon plaat met een fijne punt spatel. </li><li> Na deeltjes uitlogen, werden alle scaffolds gedesinfecteerd door onderdompeling in 50%, 60% en 70% ethanol gedurende 30 minuten elk, gevolgd door drie spoelingen van ddH 2 O. </li><li> Alle scaffolds werden gedroogd onder een laminaire stroming kap. </li><li> Na scaffold fabricage, scaffolds werden bekleed met apatiet. <ol class="ualpha"><li> SBF (gesimuleerde lichaamsvloeistof) oplossing werd bereid met ion concentraties waren 5 keer die van menselijk bloedplasma. Alle oplossingen werden steriel gefiltreerd door een 0,22 urn PES membraan (Nalgene). Onmiddellijk voor het bekleden, gedroogd PLGA scaffolds werden onderworpen aan glimontlading, argon-plasma etsen (Harrick Scientific) bevochtiging en coating uniformiteit te verbeteren. </li><li> Geëtste PLGA scaffolds werden vervolgens geïncubeerd in SBF bij 37 ° C in een watermantel incubator gedurende 12 uur, gevolgd door Mg 2 + en HCO 3 - free SBF 2 nog 12 uur bij 37 ° C onder rustig roeren. </li><li> PLGA scaffolds werden voorzichtig gespoeld met steriel ddH 2 O wegwassen overmaat natriumchlorideoplossing, gedroogd in een laminaire stroming kap en ontsmet met 70% ethanol. </li><li> Integriteit van de coating apatiet werd geanalyseerd met een scanning elektronenmicroscoop (SEM). Apatiet gecoate scaffolds werden op SEM stompjes (Ted Pella) en bekleed met koolstof om de geleidbaarheid te verbeteren. De secundaire elektronen-modus werd toegepast tijdens SEM (FEI / Phillips XL-30) observatie. Energie dispersie röntgenspectrum verkregen om elementaire samenstelling van apatiet structuren te bevestigen. </li></ol></li></ol> 3. Cel Zaaien <ol><li> Bij het bereiken van sub-samenvloeiing niveaus, was de cellen met PBS (x2) en trypsinize. </li><li> Tel de cellen te kwantificeren voor het zaaien </li><li> Zaad op voorgesneden 4,0 mm diameter scaffolds met 1,5 x 10 5 cellen. <ol class="ualpha"><li> Plaats individuele steiger in een well van een 96-wells plaat </li><li> Resuspendeer cellen in normale groeimedia met een concentratie van ongeveer 1,5 x 10 5 cellen per 20 pi media </li><li> Pipet 20 ul direct op de steiger en plaats in celkweek incubator gedurende 30 minuten. </li><li> Na 30 min, voeg 200 ul media en laat cellen te incuberenop het schavot nacht vóór de operatie </li><li> Het is niet nodig om de hechting van de cellen op de scaffold als enten van een voldoende aantal cellen zorgt ervoor dat een meerderheid wordt vastgemaakt aan de steiger. Dit is gevalideerd in ons laboratorium in vivo met bioluminescentie en histologische analyse. </li></ol></li></ol> 4. Creatie van Calvarial Gebreken en in vivo implantatie <ol><li> Anesthetize volwassen (60 dagen oude) CD-1 naakt muizen met verdoving cocktail. (Ketamine / xylazine / acepromazine) bij 50% concentratie (1:1 verdunning met 0,9% NaCl) of per aanbevolen dosering per orgaan verdoving protocollen. Deze muizen zijn athymische zodat de hASCs zal niet leiden tot een immuunreactie. <ol class="lalpha"><li> Dosering: Ketamine hydrochloride (80 mg / kg), xylazine (2,5 mg / kg) Acepromazine (2,5 mg / kg) </li><li> Duur van het effect: ongeveer 30 min </li></ol></li><li> Chirurgisch draperen het dier en steriliseer de chirurgischesite met betadine en alcohol (x3) en omvatten de muis ogen zalf alvorens een middellijn sagittale insnijding in de hoofdhuid van het dier naar rechts wandbeen bloot. Verwijder de pericranium van rechts wandbeen met stompe schrapen (Figuur 1B). </li><li> Maak een unilaterale 4-mm volledige dikte defect in het recht niet-hechting verbonden wandbeen met behulp van een steriele diamant-gecoate trephine boor. Uiterste voorzichtigheid is geboden om de onderliggende dura mater (Figuur 1B) verstoren als de muis calvarial dikte is &lt;0,3 mm. </li><li> Voor implantatie spoelen met steriel PBS scaffolds de overdracht van medium afgeleide groeifactoren voorkomen. </li><li> Plaats de steiger in het defect. </li><li> Tot slot hechten van de huid gesloten en toezicht houden op de dieren per vastgestelde postoperatieve protocollen. </li><li> Gebruik gevestigd analgesie zoals voorgeschreven door uw dier zorgprotocollen als post-operatief-bv nodig. buprenorfine 0,1 mg / kg. </li></ol> 5. Kwantificering van osteoid Vorming <ol><li> Na microCT werd uitgevoerd op de muis werd de driedimensionaal beeld gereconstrueerd door middel MicroView software zoals eerder beschreven 1. </li><li> Met behulp van Adobe Photoshop, de beelden waren ontworpen om een ​​standaard hoogte. </li><li> Met behulp van de Magic Wand functie, werden pixels gemeten van de calvarial defect. </li><li> Percentage genezing van het defect werd bepaald door de daaropvolgende CT-scans meten van het calvarial gebrek gebied en het bepalen van het aantal pixels te delen door pixel het oorspronkelijke defect nummer </li><li> Indien derhalve de microCT niet beschikbaar is, wordt een alternatief met Adobe Photoshop en oogsten van de calvaria op vastgestelde tijdstippen voor histologie. </li><li> Met behulp van histologische kleuringen zoals aniline blauw en Pentachrome dat osteoïd vorming aan te duiden, moet meerdere secties langs de spanwijdte van het defect te zijn gebrandschilderde </li><li> Met behulp van Adobe Photoshop, gewas uit alle gebieden die nietin de calvarial defect </li><li> Gebruik de toverstaf functie en bepalen aantal pixels van de novo botvorming op het gebied van het gebrek en te vergelijken met controles of andere variabelen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Vetweefsel heeft het potentieel om een ​​vitale rol dienen bij het genereren van progenitorcellen voor klinische toepassing. Vetweefsel heeft een uniek voordeel in dat er een voorziening beschikbaar die kunnen worden geoogst in een relatief eenvoudige procedure die minimale morbiditeit en mortaliteit omvat. Zodra het weefsel geoogst en verzameld, wordt ons protocol beschreven in figuur 2. Vet-afgeleide stromale cellen worden geïsoleerd door een reeks wasstappen, collagenase vertering en centrifugatie. Zodra de cellen uitgeplaat in cultuur kunnen zij worden uitgebreid, geplaatst in verschillende protocollen differentiatie in vitro of in vivo direct geplaatst. De creation van de 4 mm kritische grootte calvarial defect zorgt voor een gemakkelijk toegankelijk en reproduceerbaar in vivo model om de osteogene differentiatie vermogen van onze vet-afgeleide stromale cellen te testen. Door het gebruik van microCT, kunnen we de vorming van botweefsel in vivo te volgen en de voortgang van de interventies (Figuur 3) te volgen. De kritische-size calvarial defect zal niet genezen binnen de levensduur van het dier en we zien ongeveer 90% van het defect octrooi blijft rond de 8 weken. De steiger zelf (zie bespreking) heeft osteogene inductieve eigenschappen en heeft laten zien de mogelijkheid om een ​​aantal benige regeneratie te induceren. De typische resultaten van scaffold plaatsen zonder cellen toont aan dat ongeveer een derde van het defect zal de novo botvorming na 8 weken. Bij de uitbreiding van vetweefsel-afgeleide stromacellen, volledig tweederde of meer defect zal ossale regeneratie ongeveer 8 weken hoewel er variabiliteit tussen elk dier en chirurgie. De vorming van botweefsel kan worden gekwantificeerd door histologie en standaard tonen toegenomen osteoid vorming in monsters met ASCs door Aniline Blue en Pentachrome kleuring (Figuur 3C). Bovendien tonen wij dat de geïmplanteerde menselijke cellen bijdragen tot de uiteindelijke vorming de novo beenweefsel door het gebruik van GFP-gelabelde hASCs dat kleuring vertonen in vivo na 2 weken bij het ​​gebied van de novo botvorming in de calvarial defect (figuur 3D) . Bovendien gebruiken we immunohistochemie met humaan specifieke antilichamen tegen humaan celoverleving en bijdrage geven in het gebied van het defect (figuur 3E). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Figuur 1 A -. Lipoaspirate De twee lagen. De bovenste laag bevat de adipocyten en de meerderheid van de processes celmateriaal terwijl de onderste laag bevat het zout tijdens de lipoaspiratie procedure. B - de oprichting van de calvarial defect door middel van een incisie over de pericranium naar rechts pariëtale bot, vervolgens het opzetten van een 4 mm kritische afmetingen calvarial defect te isoleren zonder verstoring van de onderliggende dura mater. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Figuur 2. Overzicht van de oogst en toepassing van lipoaspirate uit de isolatie van vetweefsel-afgeleide stromacellen hun expansie, differentiatie en het gebruik in vitro en in vivo. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> Figuur 3. A-microCT die in vivo herstel van de kritieke omvang calvarial defect met de toepassing van ASCs door een hydroxyapatitie steiger (onderste rij). Controles omvatten geen steiger en defect (bovenste rij) en defect met de plaatsing van de steiger zonder cellen (middelste rij) B - Kwantificering van ossale genezing van de microCT met sterk toegenomen genezing in de ASC-groep. C - Histologie die verhoogde osteoid vorming van de ASC groep (onderste rij) door Aniline Blue kleuring en Pentachrome. Voor Aniline blauw, de osteoïd vlekken donker blauw en voor Pentachrome, de osteoïd vlekken geel. D - hASCS gelabeld met GFP werden gezaaid op een steiger en in een calvarial defect en opgeofferd na 2 weken. Kleuring werd uitgevoerd met een GFP gemerkt antilichaam aan de menselijke cellen die bijdragen aan de regeneratie in plaats van het defect vertonen. E -. Human kernantigeen immunohistochemie geeft prevalentie van menselijke cellen in de plaats van het defect van 2 weken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om groter bedrag bekijken</a> .

<ol><li>Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose-derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Keefe, M. S., Keefe, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+effectiveness+of+different+techniques+for+intraoperative+antibiotics+into+alloplastic+implants+for+use+in+facial+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Facial+Plastic+Surg%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the effectiveness of different techniques for intraoperative antibiotics into alloplastic implants for use in facial reconstruction.</a> Arch Facial Plastic Surg. 11, 246-251 (2009).</li>
<li>Mitchell, J. B., McIntosh, K., Zvonic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+Temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>Dominici, M., Blanc, K. L. e, Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stroma+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stroma cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Cowan, C. M., Shi, Y. Y., Aalami, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size calvarial defects.</a> Nat Biotechnol. 22, 560-567 (2004).</li>
<li>Levi, B., Nelson, E. R., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dura+mater+stimulates+human+adipose-derived+stromal+cells+to+undergo+bone+formation+in+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects.</a> Stem Cells. 29, 1241-1255 (2011).</li>
<li>Phipps, M. C., Clem, W. C., Catledge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+responses+to+bone-mimetic+electrospun+matrices+composed+of+polycaprolactone%2C+collagen+I+and+nanoparticulate+hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells responses to bone-mimetic electrospun matrices composed of polycaprolactone, collagen I and nanoparticulate hydroxyapatite.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Yuan, H., Zang, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoinduction+by+calcium+phosphate+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Osteoinduction by calcium phosphate biomaterials.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 9, 723-726 (1998).</li>
<li>Wei, G., Jun, Q., Giannobile, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enchancement+of+osteogenesis+by+nano-fibrous+scaffolds+incorporating+rhBMP-7+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The enchancement of osteogenesis by nano-fibrous scaffolds incorporating rhBMP-7 nanospheres.</a> Biomaterials. 28, 2087-2096 (2007).</li>
<li>Li, C., Verpari, C., Jin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+silk-BMP-2+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Fan, W., Nothdurft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+adenovirus+combined+silk+fibroin+scaffolds+for+bone+morphogenetic+protein-7+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo evaluation of adenovirus combined silk fibroin scaffolds for bone morphogenetic protein-7 gene delivery.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 789-797 (2011).</li>
<li>Levi, B., Hyun, J. S., Nelson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-integrating+knockdown+and+customized+scaffold+design+enhances+human-adipose-derived+stem+cells+in+skeletal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair.</a> Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Aangezien de isolatie van vet-afgeleide stromacellen 2 van lipoaspirate zijn deze cellen gedifferentieerd zijn in een grote verscheidenheid van cellulaire lijnen. Vetweefsel is van mesodermale oorsprong en daarom multipotente vetweefsel-afgeleide stromale cellen zullen waarschijnlijk het meest effectief met toepassing naar een mesodermale afstamming. De mogelijkheid om skeletweefsel genereren is vooral van belang gezien het tekort aan donor sites voor een autotransplantaat en de inherente beperkingen van synt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens: </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lipoaspirate Harvest </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Balanced Salt Hank&#39;s oplossing </td><td> Cellgro </td><td> 21-023-CV </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Mobiele Zeef 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-top 500 ml 0,22 pm filter </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Calvarial Defect </td></tr><tr><td> Z500 Brushless MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Circular Mes 4,0 mm </td><td> Xemax Chirurgische </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

reparatie van een kritische grootte calvarial defect model met behulp van adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit lipoaspirate

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Craniofaciale skelet herstel en regeneratie biedt de belofte van de novo weefselvorming door een cel benadering gebruik stamcellen. Vet-afgeleide stromale cellen (ASC&#39;s) hebben bewezen een rijke bron van multipotente stamcellen kunnen ondergaan osteogene, chondrogene, adipogene en myogene differentiatie. Vele studies hebben onderzocht de osteogene potentieel van deze cellen in vivo met gebruik van steigers verschillende biomaterialen voor cellulaire levering. Het is aangetoond dat door gebruik van een osteoconductief, hydroxyapatiet beklede poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA-HA) scaffold gezaaid met ASC, een kritische grootte calvarial defect, een defect dat wordt gedefinieerd door de onmogelijkheid om ondergaan spontane genezing gedurende de levensduur van het dier, kan effectief worden tonen robuuste ossale regeneratie. Dit in vivo model toont basis van translationele werkwijzen om het botweefsel regenereren - de cellulairecomponent en biologische matrix. Deze werkwijze dient als model voor de uiteindelijke klinische toepassing van een progenitor cel naar de reparatie van een specifiek weefsel defect.

Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

Craniofaciale skeletale reparatie en regeneratie biedt de belofte van de novo weefselvorming via een celgebaseerde benadering met behulp van stamcellen.

Het algemene doel van deze procedure is het oogsten van multipotente stromale cellen uit vetweefsel voor osteogene differentiatie, gebruikmakend van een in vivo calvariaal defectmodel in een muis. Dit wordt bereikt door eerst progenitorcellen te isoleren uit de stroma-vasculaire fractie van vetweefsel, die verkregen kan worden na een liposuctieprocedure. De volgende stap is het voorbereiden van een driedimensionaal raamwerk en vervolgens het zaaien van de cellen op dit scaffold.De laatste stap is het creëren van een kritiek groot calvaria-defect in een ratmodel, waarin het steigerwerk en de cellen worden geplaatst. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat multipotente stromale cellen geïsoleerd uit vetweefsel potentie hebben voor skeletregeneratie in vivo. De toepassingen van deze techniek hebben een breed spectrum aan mogelijke klinische toepassingen vanwege het tekort aan beschikbaar weefsel voor skeletregeneratie.Hoewel autologe bottransplantaten de gouden standaard vormen, worden deze opties beperkt door een gebrek aan donorplaatsen en morbiditeit op de donorplaats. Allotransplantaten en vreemde materialen kunnen worden gebruikt, maar zijn beperkt door de kosten, een slechte integratie en het risico op infecties.Het mogelijke gebruik van adipose of vetweefsel voor de isolatie van progenitorcellen voor skeletale weefselengineering is veelbelovend. De procedure zal worden gedemonstreerd door mijzelf en Michael Chung uit het long anchor laboratorium. Verkrijg eerst menselijk subcutaan adipose weefsel via electieve lipoaspiratieprocedures.En let op de twee lagen in het lipo-aspiraat. De supernatant bevat het overgrote deel van het cellulaire materiaal uit het proces. De onderste laag bestaat voornamelijk uit geïnjecteerde zoutoplossing.Stromale cellen afgeleid van vetweefsel kunnen uit beide lagen worden geoogst, maar de opbrengst is veel groter uit het supernatant. Om de stromovasculaire fractie of SVF te isoleren, wordt het lipo-asperaat uitgebreid gewassen met gelijke volumes van 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS die 2,5% Betadine bevat; aspireer vervolgens een gelijk volume 1x PBS zonder Betadine. Laat het wassel bezinken.Zorg ervoor dat gedurende het hele proces een steriele techniek wordt gehanteerd om contaminatie met bewerkt menselijk weefsel te voorkomen. Aspireer vervolgens de onderste laag en gooi deze na elke wasbeurt weg, en breng 15 milliliters vetweefsel over in 50 milliliter Falcon conische buizen. Verteer daarna het vetweefsel in 15 milliliter gefilterde 0,075% gefilterde.Voeg type twee collagenase toe in Hank's gebalanceerde zoutoplossing of HBSS bij 37 °C in een waterbad gedurende 60 minuten onder constante agitatie; zorg ervoor dat de buisjes elke 15 minuten worden geventileerd. Neutraliseer vervolgens de enzymactiviteit met 15 ml PBS bevatten 10% foetaal runderserum of FBS en centrifugeer. Om een SVF-pellet met hoge dichtheid te verkrijgen, zal het pellet een mengsel zijn van uit vetweefsel afgeleide stamcellen en erytrocyten.Verwijder eerst de bovenliggende vetlaag en verwijder vervolgens de bovenliggende vloeistoflaag zonder het pellet te verstoren. Resuspendeer het pellet in 10 milliliters traditioneel groeimedium. Voeg daarna de drie buisjes samen in één schone conische buis van 50 milliliter via een filter van 100 micron en centrifugeer.Verwijder het supernatant zonder het pellet te verstoren en resuspendeer vervolgens het pellet. Combineer in vijf milliliter traditioneel groeimedium twee conische buizen van 50 milliliter per plaat van 10 centimeter, of vijf conische buizen van vijf milliliter voor één plaat van 15 centimeter. Stel de primaire culturen gedurende de nacht op bij 37 °C met 21% zuurstof en 5% kooldioxide.Was na een overnacht-incubatie de platen met PBS om resterende niet-adherente rode bloedcellen te verwijderen. De resulterende celpopulaties zijn uit vetweefsel afgeleide stromale cellen. Houd de cellen op subconfluente niveaus om spontane differentiatie te voorkomen.Bij 37 °C, 21% oxygen en 5% carbon dioxide. In groeimedium moeten de cellen over het algemeen elke drie tot vier dagen worden gesplitst in regulier groeimedium. Wanneer ze worden uitgeplaat bij 50% confluentie, dient het scaffold te worden voorbereid zoals uitgelegd in het bijbehorende manuscript.Wanneer de cellen subconfluente niveaus bereiken, was de cellen tweemaal met PBS en trypsiniseer deze. Tel de cellen om ze te kwantificeren. Voor het zaaien wordt voorbereid om de cellen op vooraf uitgesneden scaffolds met een diameter van 4 mm te zaaien met 1,5 × 10⁵ cellen.Plaats een individueel scaffold in één well van een 96-well plaat en resuspendeer vervolgens de cellen in regulier groeimedium met een concentratie van ongeveer 1,5 × 10⁵ cellen per 20 µL medium. Bezaai het scaffold door 20 µL van de oplossing direct in het scaffold te pipetteren en plaats dit gedurende 30 minuten in de celkweekincubator.Voeg na 30 minuten 200 µL medium toe en laat de cellen een nacht incuberen op het scaffold. Voorafgaand aan de operatie is het niet nodig om de adhesie van cellen op het scaffold te controleren zoals bij het zaaien. Een voldoende aantal cellen zal waarborgen dat de meerderheid zich aan het scaffold hecht.Nadat een volwassen CD1 nude muis van 60 dagen oud is geanestheseerd, wordt de operatielaocatie drie keer gesteriliseerd met Betadine en alcohol, waarna er glijmiddel op de ogen van de muis wordt aangebracht. Maak vervolgens een midline sagittale incisie in de hoofdhuid van de muis om het rechter pariëtaalbeen bloot te leggen. Verwijder het periost van het rechter pariëtaalbeen door middel van stomp schrapen.Maak vervolgens een unilateraal defect van vier millimeter over de volledige dikte in het rechter pariëtaal bot, buiten de sutuurgebieden. Gebruik een diamantgecoate tandenboor en wees uiterst voorzichtig om de onderliggende dura mater niet te beschadigen, aangezien de dikte van het schedeldak van de muis vóór implantatie minder dan 0,3 millimeter bedraagt. Spoel de scaffolds met steriele PBS om overdracht van groeifactoren uit het medium te voorkomen.Plaats het steunstructuur in het defect. Hecht tot slot de huid en monitor het dier volgens de vastgestelde postoperatieve protocollen. Voer een micro CT uit op de muis en verkrijg een 3D-gereconstrueerd beeld met behulp van microview-software.Gebruik Adobe Photoshop om de afbeeldingen op een standaardhoogte te schalen. Normaal gesproken meten we elke twee weken de calvariale regeneratie. De muizen worden tijdens de scan voor de langetermijnfollow-up geanestheseerd en uiteindelijk geëuthanaseerd.Gebruik voor histologische analyse de 'magic wand'-functie om de pixels van het calvariale defect te meten. Bepaal het percentage genezing van het defect aan de hand van opeenvolgende CT-scans. Meet het oppervlak van het calvariale defect, bepaal het aantal pixels en deel dit door het aantal pixels van het oorspronkelijke defect; kleur vervolgens meerdere coupes over de gehele breedte van het defect met histologische kleurstoffen zoals anilineblauw en pen aro om botvorming aan te duiden.Gebruik Adobe Photoshop om alle gebieden buiten het calvariale defect weg te snijden en gebruik de tohertool (magic wand) om het aantal pixels van de novo botvorming in het gebied van het defect te bepalen, en vergelijk dit met controles of andere variabelen. Hier is een overzicht van het oogsten en toepassen van lipo-aspiraat, van de isolatie van adipose-afgeleide stromale cellen tot hun expansie, differentiatie en gebruik in vitro en in vivo. Hier is een micro-CT die de in vivo genezing van het calvariale defect van kritieke omvang laat zien met de toepassing van ASC's via een hydroxyapatiet-steunstructuur, te zien in de onderste rij.Controles, die in de bovenste rij te zien zijn, omvatten geen scaffold en defect. De middelste rij toont het defect met plaatsing van de scaffold zonder cellen. LS, hier weergegeven, is de kwantificering van de botgenezing op basis van micro-ct, wat een significant verhoogde genezing laat zien in de A SC-groep.Dit is een histologische afbeelding die een toename van de botvorming in de A SC-groep via andal laat zien. In blauw en pen AROM-kleuring voor al. In blauw kleurt het osteoïd donkerblauw voor pen arom.De hier getoonde geelgekleurde osteoïde bestaat uit menselijke ASC's gelabeld met GFP, die op een scaffold werden gezaaid en na twee weken zijn opgeofferd. De kleuring is uitgevoerd met een GFP-gelabeld antilichaam om de menselijke cellen aan te tonen die bijdragen aan de regeneratie in het defecte gebied. Hier is de immunochemie van het menselijk nucleair antigeen te zien, wat de prevalentie van menselijke cellen in het defecte gebied na twee weken aantoont.Zodra de techniek onder de knie is, kan de verwerking van het vetweefsel binnen vier uur worden voltooid en de chirurgische procedure ongeveer 10 minuten per muis in beslag nemen. Het is belangrijk om te onthouden dat het pariëtale bot rond is terwijl de boor plat is, dus er moet zorgvuldig worden gewerkt om de volledige omtrek van het defect van 4 mm te doorboren. Ga langzaam te werk om beschadiging van de dura mater in de hersenen te voorkomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de progenitorcellen uit het vetweefsel isoleert. Zaai deze cellen uit op een steiger en plaats deze in de muis.

repair-critical-sized-calvarial-defect-model-using-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC's). PSC's kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te...

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Adipeus-afgeleide cellen van de stam (ASC's) gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd en geoogst van het vet van de normale ratten. ASC bladen kunnen worden gemaakt met behulp van cellaag engineering en in Zucker vette diabetesratten exposeren full-dikte huid gebreken met blootgestelde bot en vervolgens bedekt met een dubbelgelaagde van kunstmatige huid kunnen worden getransplanteerd.

Creatie en transplantatie van een blad van de stamcel adipeus afkomstige (ASC) in een diabetische wondgenezing Model

Adipositas-afgeleide stromale cellen kunnen nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuw weefsel uit de eigen cellen van een patiënt. We presenteren een protocol voor de isolatie van een subpopulatie van humane adipositas-afgeleide stromale cellen (ASC's) met een verhoogd osteogeen potentieel, gevolgd door toepassing van de cellen in een in vivo calvariaal genezingsassay.

Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Het aantal nieuwe biomaterialen ontworpen voor het herstellen van grote bot laesies groeit voortdurend met als doel het verbeteren bot genezing en het overwinnen van de complicaties geassocieerd met bot transplantatie. Hier presenteren we een multidisciplinaire strategie voor preklinische biocompatibiliteit testen van biomaterialen voor bot reparatie.

Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie

Hier presenteren we een protocol voor de productie van een adipeus weefsel afkomstige stromale vasculaire breuk en de toepassing ervan te verbeteren functies van de knie door het regenereren van kraakbeen-achtig weefsel in menselijke patiënten met artrose.

Protocol voor klinische adipeus weefsel afkomstige stromale vasculaire breuk oplevert potentiële regeneratie van het kraakbeen

Hier presenteren we een protocol om te verkrijgen stromale vasculaire breuk van adipeus weefsel door middel van een reeks van mechanische processen, waaronder membraanemulsificatie en meerdere centrifugations.

Mechanische micronisatie voor Lipoaspirates voor regeneratieve therapie

We beschrijven de gedetailleerde chirurgische ingrepen van calvariale hechting-benige composietdefecten bij ratten, naast het onderzoek naar de korte- en langetermijnprognoses van het model. We streven ernaar een gestandaardiseerd model te construeren voor het ontwikkelen van hechtregeneratieve therapieën.

De vaststelling van calvariale hechting-benige composietdefecten bij ratten: een gestandaardiseerd model voor onderzoek naar hechtingsregeneratieve therapie

Leer het isoleren van adipose-afgeleide stromale cellen uit lipoaspiraat voor botregeneratie in een kritische calvariale defectmodel bij muizen. Deze methode toont het potentieel voor klinische toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate (Video) | JoVE Journal

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

Meer video's verkennen