Name: Het overbruggen van de Bio-elektronische interface met Biofabrication (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: Leer biofabricage van biologisch functionele films met elektrodepositie van pH-responsieve polysacchariden op gepolariseerde elektroden. Deze methode integreert eiwitten en cellen voor lab-on-a-chip toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen de financiering van DTRA voor de ondersteuning van dit manuscript en van ONR, DTRA, en NSF voor gedeeltelijke ondersteuning van de onderliggende onderzoek.

1. Alginaat Elektrodepositie <ol><li> Sluit een voeding aan op de op maat vervaardigde elektroden via patchkabels met alligator clips. Een indium tin oxide (ITO) onder glasplaatje fungeert als anode (werkzame elektrode) en platina folie dient als kathode (tegenelektrode). Plaats de elektroden de ITO oppervlak worden gefunctionaliseerd tegen het tegenelektrode en verticaal gepositioneerd worden gedompeld in een oplossing of horizontaal, zodat de neerslagoplossing wordt opgenomen op het oppervlak. </li><li> Bereid een alginaat neerslagoplossing door menging 1% alginaat en 0,5% CaCO 3 (in gewicht) in gedestilleerd water en de oplossing autoclaaf. Het wordt aanbevolen om voortdurend roeren de oplossing wanneer niet in gebruik. </li><li> Dompel beide elektroden in de neerslagoplossing. De gebruikte alginaat kan fluorescent gelabeld worden met FluoroSpheres (Invitrogen), volgens Cheng et al.. 14, zodat voor fluorescence beeldvorming van de resulterende film. </li><li> Breng een constante stroom dichtheid (3 A / m 2) gedurende 2 minuten; spanning zal binnen het bereik te verschuiven van 2-3 V. </li><li> Maak de elektrode en verwijderen van de niet-gedeponeerde oplossing. Voorzichtig spoelen de film met NaCl (0,145 M) om overbodige alginaat te verwijderen. </li><li> Incubeer de film kort (~ 1 min) CaCl2 (0,1 M) de gel te versterken. Spoel met NaCl (0,145 M) en incuberen in een gewenste oplossing aangevuld met CaCl2 (1 mM). </li><li> Beeld met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 1B). </li></ol> 2. Codeposition van Communiceren celpopulaties in alginaat <ol><li> Een signaal-zender celkweek (W3110 gew E. coli), gekweekt in LB media, en een signaal-ontvanger celkweek (MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + PET-DsRed - kan r), gekweekt in LB media + 50 pg / ml kanamycine en elk van ampicilline, worden gegroeid overnacht eennd opnieuw geënt groei tot een optische dichtheid (bij 600 nm) 1. Pas optische dichtheid van de ontvanger celkweek tot 0,4-0,6 met LB voor gebruik. </li><li> Bereid een afzetting oplossing van 2% en 1% alginaat CaCO 3 en meng met elk celkweek in een 1:1 verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 1% alginaat 0,5% CaCO 3, met cellen verdund tot een dichtheid van ongeveer half het kweken dichtheid. </li><li> Gebruik een glasplaatje patroon twee ITO elektroden bevatten met een polydimethylsiloxaan (PDMS) en (bereid volgens Sylgard instructies en gesneden tot de gewenste grootte) en een platina elektrode. Sluit een ITO-elektrode met een voeding met de platina zoals beschreven in Procedure 1 (Alginaat elektrodepositie). </li><li> Dompel de elektroden in een neerslagoplossing met de ontvanger cellen. Stel de voeding een constante stroom met een dichtheid van 3 A / m 2, waarbij het ​​oppervlak afmeting wordt bepaald door de enkele elektrode waarop deposition optreden. </li><li> Breng de huidige 2 minuten mogelijk te maken codeposition van de cellen in de alginaat matrix. </li><li> Spoel de film zoals beschreven in stap 1.5. </li><li> Schakel de anodische verbinding met de tweede, naastgelegen, ITO-elektrode. </li><li> Herhaal de depositie procedure (stappen 2.4 tot 2.7), maar deze keer de introductie van de oplossing die de afzender cellen. </li><li> Incubeer de twee elektroden chip met codeposited cellen en calcium-alginaat nacht bij 37 ° C in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 10% LB medium en 1 mM CaCl2. </li><li> Na incubatie afbeelding met een fluorescentiemicroscoop (Figuur 2B). </li></ol> 3. Chitosan Elektrodepositie <ol><li> Sluit de voeding aan op de elektroden via krokodillenklemmen. Een gouden gecoate chip zal optreden als de kathode (werkende elektrode) en een platina folie zal dienen als de anode (tegen-elektrode). Plaats de gouden elektrode oppervlak zodat eop het zich tegen de tegenelektrode en beide verticaal gepositioneerd worden gedompeld in een oplossing of horizontaal, zodat de neerslagoplossing wordt opgenomen op het oppervlak. </li><li> Bereid een chitosan-oplossing door het mengen van chitosan vlokken in het water en langzaam toe te voegen 2 M HCl aan de polysacchariden (eind pH 5,6) te ontbinden, en zorg ervoor dat de procedure die door Meyer et al.. 15 te volgen. </li><li> Plaats de elektroden in een chitosan-oplossing (0,8%), volledig onder te dompelen het gewenste gebied van de depositie. De gebruikte chitosan kunnen worden fluorescent gelabeld met 5 - (en-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidylester (Invitrogen), volgens Wu et al. 8 het afbeelden van de galvanische film door fluorescentiemicroscopie.. </li><li> Breng een constante stroomdichtheid (4 A / m 2) gedurende 2 minuten. Spanning verschuift in het bereik van 2-3 V. Bereken de stroomdichtheid als functie van het goud oppervlak van de werkzame elektrode blootgesteld aan deposition oplossing. </li><li> Spoel de elektrode met DI-water om overbodige chitosan te verwijderen. De chip kan worden opgeslagen in water of PBS (10 mM, pH 7,0). </li><li> Beeld met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 3C). </li></ol> 4. Elektrochemische transductie met een gefunctionaliseerd Chitosan Film <ol><li> Codeposit chitosan en glucose oxidase (GOX) van een oplossing (1% chitosan, 680 U / mL GOX, pH 5,6) bij een stroomdichtheid van 4 A / m 2 naar een patroon elektrode volgens stap 3 (Chitosan elektrodepositie). Een chitosan film gevangen zitten in GOX zal worden gegenereerd. </li><li> Sluit de behandelde elektrode drie elektrodensysteem de werkzame elektrode een platina draad als de tegenelektrode en Ag / AgCl referentie-elektrode als zoals beschreven in figuur 4A. </li><li> Dompel de elektroden in een fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) bevattende NaCl (0,1 M). </li><li> Elektrochemisch conjugaat van het eiwit aan de chitosanfilm door een constante spanning (0,9 V) gedurende 60 gebruik chronoamperometry 10. </li><li> De chip in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) en was 10 minuten op een schudapparaat elke gereageerd NaCl en geconjugeerde GOX verwijderen. </li><li> Vervolgens plaatst de drie elektroden als beschreven in stap 4.2 en ondergedompeld in een oplossing van 5 mM glucose. Met cyclische voltametrie, vegen de potentiaal in positieve richting 0,7 V. gebruiken een controlefilm die geen glucoseoxidase als vergelijking voor de hoeveelheid oxidatie gezien in de sweep (Figuur 4B). </li><li> Verwijder de elektroden van de glucose en spoel met fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) dan de elektroden in een 10 ml bekerglas met 8 ml fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0). Bias de GOX-gefunctionaliseerde chip 0,6 V als de werkzame elektrode (Figuur 4C). </li><li> Voeg aliquots van glucose naar de buffer (elke hoeveelheid verhoogt de glucose concentratie4 mm). </li><li> Genereer een standaard curve tussen de steady state stroom en de glucose concentratie voor de GOX-gefunctionaliseerde chitosan film. </li></ol> 5. Eiwit functionalisering Met behulp van Enzymatische Vergadering <ol><li> Gebruik een glasplaatje patroon met een aangrenzende goud en ITO-elektrode binnen een PDMS goed. Bias de gouden elektrode met een kathodische potentieel om chitosan galvanische zoals eerder aangegeven. Spoel kort film in DI-water en daarna PBS met een pipet. </li><li> Voeg een oplossing van 3 pM blauwe fluorescent gelabelde &quot;AI-2 Synthase&quot; 16 (met een DyLight labeling kit) + 100 U / mL Tyrosinase in PBS. </li><li> Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur spoel de film met PBS. </li><li> Breng een anodische potentieel om de ITO-elektrode een alginaat depositie oplossing die de ontvanger cellen (zoals opgesteld in de stappen 2.1 tot 2.2) codeposit. Volg de stappen 2.3-2.6 van orde 2 (Codeposition van celpopulaties in alginaat). </li><li> Voor het genereren vanhet uitgezonden signaal (AI-2) het enzymatisch na spoelen films toevoegen van een oplossing van 500 pM S-adenosyl homocysteine ​​(SAB) in PBS, aangevuld met 10% LB medium en 1 mM CaCl2. Bedek de elektroden om verdamping van de oplossing te voorkomen en overnacht incuberen bij 37 ° C. Dit zal voor een ontvanger celrespons door het opwekken van een rood fluorescent eiwit (DsRed). </li><li> Aangrenzende elektroden kunnen worden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie door aanpassing van de filters met de blauwe fluorescentie van AI-2 synthase en rode fluorescentie die door de ontvanger codeposited cellen (Figuur 5B) te bepalen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Opgelegd elektrische signalen kunt gelokaliseerde micro-omgevingen (bijvoorbeeld velden en hellingen) in de buurt een elektrode oppervlak en deze prikkels kunnen de zelf-assemblage van Polysacchariden zoals alginaat en chitosan te storten als een hydrogel film op het elektrode-oppervlak te activeren. Omdat tzijn sol-gel overgang optreedt in het elektrodemateriaal de resulterende film electroaddressed met de geometrie overeenkomen met de elektrode patroon (fig. 1B, 3C). Biocompatibele films zoals alginaten en chitosan voorzien oppervlakken kan worden gefunctionaliseerd met biologische componenten. Met behulp van alginaat, hebben unieke celpopulaties is codeposited op verschillende adressen. Het bewijs van hun electroaddressment worden waargenomen tijdens de interactie tussen de zender en ontvanger celpopulatie. De molecule autoinducer-2 (AI-2) diffundeert uit de afzender cellen en wordt door de ontvanger cellen, resulterend in expressie van de DsRed rode fluorescent eiwit (Figuur 2A). In figuur 2B, wordt rode fluorescentie alleen waargenomen bij de elektrode waar de ontvangers worden aangepakt. De amine groepen aanwezig chitosan voorzien van de pH reactiesnelheid nodig galvanisch en een oppervlak voor functionalisering. Wijbenut deze unieke eigenschappen door elektrochemisch conjugeren van het biosensing enzym glucose-oxidase (GOX) om elektrolytisch chitosan films. Dit enzym verschaft de mogelijkheid voor de detectie van glucose door een enzymatische reactie (Figuur 4A) waterstof peroxide die dan elektrochemisch kan worden geoxideerd het produceren van een uitgangsstroom. Op deze wijze kan een chemisch signaal worden getransduceerd elektrisch. Figuur 4B toont dat films waarin GOX was geconjugeerd elektrochemisch een hard anodische signaal in de aanwezigheid van glucose in tegenstelling tot de films die geen GOX. Deze resultaten geven GOX kunnen worden gemonteerd op een gedeponeerd chitosan film en katalytische activiteit behouden. Bovendien Figuur 4C toont een stap toename anodische stroom in antwoord op toenemende concentraties glucose. De standaard curve ook in Figuur 4C toont de stap toe overgegaan in een bijna lineaire fashion afhankelijk van de hoeveelheid glucose toegevoegd. Deze resultaten tonen dat het enzym ook de gevoeligheid te verhogen glucose concentraties op conjugatie tot chitosan film blijft. De ondergrens van detectie is hier niet onderzocht zoals eerder is gekenmerkt dit systeem in het werk van Meyer et. al. We hebben ook aangetoond dat de covalente immobilisatie van een enzym van belang, ontworpen om een ​​aangepaste penta-tyrosine tag, om chitosan in een enzymatisch-gecontroleerde manier bevatten. Concreet wordt dit proces gemedieerd door het enzym tyrosinase. Zoals weergegeven door de regeling in fig. 5A (bovenste), een enzym, AI-2 Synthase omvat een penta-tyrosine tag. Tyrosinase werkt in op de tyrosine-tag, het oxideren van de residuen &#39;fenolgroepen naar O-chinonen, die covalent vervolgens binden aan chitosan&#39;s aminen. Bewijs van chitosan film functionalisering met de AI-2 Synthase door tyrosinase assemblage wordt waargenomen in figuur 5B </strong&gt;, waar de AI-2 Synthase is fluorescent gelabeld is blauw. Omdat AI-2 Synthase genereert AI-2 van het substraat S-adenosyl homocysteine ​​(SAB) op dezelfde wijze als de zender cellen de nabijheid codeposited ontvanger cellen in de aanwezigheid van SAB veroorzaakt ook de ontvanger cellen fluorescent reageren door expressie DsRed (Figuur 5A (onderste)). Rode fluorescentie van de ontvanger cellen (figuur 5B) toont opnieuw interactie tussen adressen door de diffusie van AI-2 van een naar de ander en verder aan dat enzymen geïmmobiliseerd op chitosan behouden activiteit als covalent gebonden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig1.jpg" /> Figuur 1. Alginaat elektrodepositie. (A) Mechanisme van alginaat elektrodepositie: als een elektrode wordt anodisch bevooroordeeld, elektrolyse van water ontstaat aan het oppervlak, het genereren van een gelokaliseerde lage pH. Calciumcarbonaatdeeltjes reageren met het overschotprotonen vrij calcium kationen de deeltjes op te lossen. In aanwezigheid van alginaat polymeerketens, raken de ionen chelaatvormer een &quot;Eggbox&quot; netwerk, waarbij een verknoopt hydrogel bij de elektrode. Als de afstand van de elektrode toe, alginaat een grotere neiging tot in oplossing blijven door de verminderde aanwezigheid van calciumionen. (B) een L-vormige patroon ITO elektrode werd ingezet om galvanische alginaat. Een PDMS goed is bevestigd aan de elektrode een groen fluorescent gelabelde alginaat (1%) en CaCO 3 (0,5%) neerslagoplossing bevatten. Na electrodepositing gedurende 2 minuten. bij een stroomdichtheid van 3A / m 2 is het alginaat electroaddressed hydrogel afgebeeld door fluorescentiemicroscopie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig2.jpg" /> Figuur 2. Codeposition van celpopulaties. (A) Regeling met interactie tussen twee E. coli-stammen: Een populatie produceert autoinducer-2 (AI-2), Een signaalmolecule wordt en aangeduid als &quot;Al-2 zender&quot;. De overige bevolking, aangeduid als &quot;AI-2-ontvanger&quot;, is een verslaggever van AI-2; na ontvangst van AI-2 door diffusie vanuit de afzender, het drukt de rode fluorescerende eiwit DsRed. (B) rode fluorescentie beeld van de elektrode paar met de AI-2 afzender bevolking codeposited met alginaat op de linker elektrode en AI-2-ontvanger bevolking codeposited met alginaat rechts elektrode. Vergrote weergave toont de DsRed uitdrukking van alleen de AI-2 ontvangers. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig3.jpg" /> Figuur 3. Chitosan elektrodepositie. (A) met de regeling pH-afhankelijke electrodepositie van chitosan. Water elektrolyse bij een kathodisch voorgespannen elektrode veroorzaakt gelokaliseerde hoge pH (aangegeven door een gelokaliseerde kleurverandering van een pH-indicator kleurstof bij de kathode in microfoto) waarin de sol-gel overgang van chitosan stimuleert in dit gebied. (B) De aminen te presenteren over chitosan te geven it pH-responsieve eigenschappen. Boven een pH van 6,3 (pKa van chitosan) de amines gedeprotoneerd, waardoor een overgang van de geprotoneerde oplosbare vorm op onoplosbare gelvorm. (C) een patroon goud elektrode werd ingezet om galvanische chitosan. De elektrode kathodisch aangesloten op de voeding, werd ondergedompeld in een groen fluorescent gelabelde chitosan (0,8%) neerslagoplossing. Na electrodepositing gedurende 2 minuten. bij een stroomdichtheid van 4 A / m 2 is de electroaddressed chitosan film afgebeeld door fluorescentiemicroscopie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig4.jpg" /> Figuur 4. Electrochemical transductie met een gefunctionaliseerd chitosan film. (A) Schematische met de set-up van een drie elektrodesysteem. Gefunctionaliseerde chitosan film dient als de werkzame elektrode een platina draad als de tegenelektrode en Ag / AgCl referentie-elektrode als. Elektrochemische transductie van glucose verloopt via ee enzymatische elektrochemische reacties weergegeven werden geproduceerd waterstofperoxide kan worden geoxideerd en gemeten op de werkzame elektrode. (B) Cyclische voltammagram (CV) in elektrode met een chitosan film met elektrochemisch geconjugeerde glucose oxidase (GOX) toont een sterk anodische signaal in 5 mM glucose-oplossing. Een film die geen GOX diende als controle en vertoonde geen signaal in dezelfde oplossing. (C) Een standaard curve tussen anodische de huidige en de glucoseconcentratie wordt een bijna lineair verband (elk aliquot verhoogde de glucoseconcentratie van 4 mm en verhoogde ook de huidige amplitude in de inzet grafiek in een stapsgewijze manier). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig5.jpg" /> Figuur 5. Protein functionalisering met behulp van enzymatische montage. (A, boven) regeling met tyrosine-tag &quot;AI-2 Synthase&quot; wordt covalent gebonden aan een chitosan film van tyrosinase montage. De tyrosine residuen worden oxidevan rond O-chinonen door tyrosinase actie kan reageren met aminegroepen de chitosan film, een covalente binding. (A, lager) De AI-2 Synthase genereert AI-2 van een substraat (SAB), de ontvanger cellen verslag van de gegenereerde AI-2 door DsRed fluorescentie expressie. (B) Fluorescentie beelden die een chitosan film op goud, gefunctionaliseerd met blauw-gelabeld AI-2 synthase. Naast elkaar zijn AI-2 cellen ontvanger codeposited met alginaat op ITO. Na toevoeging van de enzymatische substraat de put incubatie drukken de AI-2 cellen ontvanger DsRed.

<ol><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding%2C+semi-permeable+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li>
<li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li>
<li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li>
<li>Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li>
<li>Wu, L. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li>
<li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol%5BTitle%5D)+AND+%22bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li>
<li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li>
<li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-coated+wires%3A+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li>
<li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+with+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li>
<li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiba+Benjamin%2C+D+%22Renewable+and+Sustainable+Polymers%22">Renewable and Sustainable Polymers</a>. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).</li>
<li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li>
<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li>
<li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%22dual+mode%22+actuation+in+chitosan%2Fpolyaniline%2Fcarbon+nanotube+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li>
<li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li>
<li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li>
<li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li>
<li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li>
<li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li>
<li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li>
<li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+A%22%5BJournal%5D)">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li>
<li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li>
</ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door de Verenigde Staten Defense Threat Reduction Agency.

Onze procedures aan te tonen de elektrodepositie en functionalisering van biopolymeer films, een proces dat we begrip biofabrication. Door functionalisering met cellen en biomoleculen maken we biologische oppervlakken kunnen interactie met elkaar en de elektrode adres ze geassembleerd op. De eerste stap, elektrodepositie, geschiedt door de geactiveerde zelfassemblage van biopolymeren, alginaat en chitosan in studies, in reactie op een elektrisch signaal. Zoals eerder een pH-gradiënt worden gegenereerd die worden bestuurd door de stroomdichtheid en depositietijd, waardoor extra controle op de film afmetingen en eigenschappen 6,17. Wij hebben gevonden dat een aantal stroomdichtheid depositietijd combinaties kunnen worden gebruikt voor de elektroden in tabel 1. Hoewel het gebruik van andere elektroden haalbaar zou aanpassing van de procedure noodzakelijk. Vergeleken met andere technieken van filmvorming het proces electrodeposiTIE is eenvoudig, snel en reagentless. Er is geen noodzaak voor een uitgebreide repertoire van dure apparatuur en bewerkelijk preparaten. Bovendien kan het proces tegen geringe afwijkingen experimentele en kan gemakkelijk worden begonnen als een probleem voordoet. Chitosan kan reageren op een hoge kathodische pH gradient door belangrijke functionele eigenschappen verleent haar door een hoog gehalte aan primaire aminen. Bij hoge pH (groter dan de pKa van ~ 6.3) de amines gedeprotoneerd en chitosan onoplosbaar, waardoor filmvorming. Na afzetting wordt de films blijven aan de elektrode. De mogelijkheid bestaat om te delamineren indien gewenst. De films stabiel blijft zolang de pH van de oplossing niet beneden de pKa. Zure oplossingen protoneren de aminen en de daarop volgende elektrostatische afstoting zwellen van de gel tot het oplost 18. Dat wil zeggen dat de montage / demontage proces is omkeerbaar op de vraag en allows voor het verwijderen van gedeponeerde films en hergebruik van elektroden. Gunstig is de pH waarbij de sol-gel overgang plaats dicht bij die in de meeste biologische componenten optimaal functioneren. Dit maakt de werkwijze geschikt voor het bewaren van functionaliteit gedurende samenstel 6. Alginaat filmvorming wordt vergemakkelijkt door de anodische elektrolyse van water en de aanwezigheid van calciumcarbonaat 7. De plaatselijke lage pH op de anode solubiliseert de calciumcarbonaat ertoe leiden dat de calcium kationen. Deze ionen zijn chelaatvormer alginaat, die een verknoopt netwerk van het elektrodemateriaal. Alginaat films name omkeerbaar door competitie voor calciumionen andere chelaterende verbindingen zoals citraat of EDTA, die gebruikt kunnen worden om de films te lossen, zodat hergebruik van de onderliggende elektroden. Zo, alginaat films zijn relatief kwetsbaar wanneer het wordt blootgesteld aan fysiologische omstandigheden, omdat calcium-ionen zijn gemakkelijk scavenged uit de gel matrix, verzwakking van de structuur en de bevordering van film delaminatie of redissolution. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij een incubatiestap de film in 1 M CaCl2 de gel te versterken. Bovendien te bevelen de film incubatie-oplossing (celmedium, enz.) worden aangevuld met CaCl2 in een concentratie van 500 uM-3 mM. De tweede belangrijke ingreep is de functionalisering van de gedeponeerde film met relevante biologische componenten. Dit kan op twee manieren, waarvan de eerste elektrochemische conjugatie een strategie dat een snelle, reagentless montage van eiwitten met bijzondere ruimtelijke controle 10. Echter functionalisering op deze wijze beperkt door de diffusie van Cl - ionen door de film op de elektrode en de verspreiding van HOCl de gegenereerde reactief tussenproduct terug in oplossing. Het vermogen van elektrochemisch actieve moleculen te passerendoor de film kan zijn voor de transductie van chemische en biologische signalen in gemakkelijk te lezen elektrische signalen 15. We hebben laten zien tyrosinase-gemedieerde koppeling als tweede strategie voor het enzym functionalisering naar chitosan, aangetoond door covalent het bevestigen van AI-2 synthase. Deze strategie staat de functionalisering te regelen proces en selectieve - afhankelijk van een specifiek reagens, tyrosinase, die inwerkt op discriminately eiwitten met een tyrosine tag 9. We tonen het nut en de biocompatibiliteit van multi-adres systemen door te repliceren natuurlijke paden op een chip. Eerst hebben we twee celpopulaties (dat wil zeggen &quot;afzenders&quot; en &quot;ontvangers&quot;) georganiseerd op verschillende adressen, en liet zien dat ze in wisselwerking over aangrenzende elektroden op AI-2 te leveren en een fluorescentie respons te genereren. Dit concept is eveneens aangetoond door Cheng et al.. in een microfluïdische chip 14. We hebben ook nagebootst van de interactie, maar in plaats daarvan gebruikteen enzym om AI-2 te synthetiseren voor levering. Op deze wijze werd een synthetisch intracellulaire weg, AI-2 synthese gerepliceerd door biofabrication en fungeerde veel aangezien het in oplossing. In beide gevallen samenstel van meerdere adressen worden de uitdaging vermijden niet-specifieke binding tussen de adressen omdat elk neerslagoplossing wordt ingevoerd om de gehele elektrode, terwijl elektrodepositie alleen bedoeld op een adres. Gentle maar grondig wassen kan verwijderen van de meerderheid van de resterende oplossing van niet-biased elektroden, het gebruik van de stroming in microfluïdische kanalen kan verder minimaliseren van niet-specificiteit. Vooral voor de aangrenzende biofabrication van chitosan en alginaat-adressen, raden wij aan de neerlegging van de chitosan film eerst na deze met biofunctionalization stappen, en na deze, electrodepositing alginaat. Hoewel we hier niet gedaan, hebben we gevonden dat blokkering van de chitosan film inert eiwitten (zoals milk, BSA, etc.) vermindert aanzienlijk niet-specifieke binding van ongewenste moleculen aan het oppervlak geamineerd chitosan&#39;s. We hebben nut bij het vaststellen van patronen elektroden, vaak gevonden in BioMEMS apparaten, zoals de &quot;blauwdrukken&quot; voor een complex geheel van cellen en biomoleculen. Het gebruik van elektrolytisch chitosan in BioMEMS apparaten kunnen veel verder gaan dan de voorbeelden die hier genoemd 19. Chitosan kan worden afgezet op verschillende microschaal geometrieën - zoals in microkanalen en op niet-vlakke oppervlakken 20,15. De films zijn ook worden gemodificeerd met andere polymeren en een verscheidenheid van eiwitten, DNA, nanodeeltjes en redox-actieve moleculen nieuwe eigenschappen 21,22,23. In BioMEMS apparaten zijn chitosan films zijn gebruikt voor drug delivery, redox en kleine molecule detectie, biokatalyse, en cel studies 20,23,24,25. Evenzo is alginaat schaal gebruikt als cel-opsluiting matrix en is onderzocht voor omkeerbare vloeibare insluiting vancelpopulaties en in-film immunoanalysis 26,27,28. Samengestelde films voor weefseltechniek aanvragen vervaardigd met behulp alginaat elektrodepositie, met componenten zoals bij hydroxyapatiet voor orthopedische implantaten 29. In onze demonstraties van biofabrication, hebben we laten zien zowel de interacties tussen biologische componenten en over de bio-elektronische interface te zijn van overeenkomstige toepassing, dit brengt in het vooruitzicht te bereiken van de integratie van alle rassen van de interacties voor geavanceerde prestaties in on-chip signaaloverdracht. Daarom biofabrication kan de fabricage van apparaten te vergemakkelijken met een verminderde &quot;minimale functie maten&quot; als een direct vervolg op de snelle ontwikkelingen in microfabricage, zoals vaak ingegeven door consumentenelektronica. Dat wil zeggen, de volgende keer zou de volgende generatie apparaten in feite zijn labiele biologische componenten die de natuur prachtige montage en erkenning mogelijkheden op nog kleinere lengte sca biedenles dan de mens gemaakte systemen. We zien op korte termijn toepassingen in analytische instrumentatie-, milieu-sensoren, en zelfs biocompatibel implanteerbare apparaten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de component </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Voeding </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> Drie elektrode potentiostaat </td><td> CH Instrumenten </td><td> Potentionstat / galvanostaat 600D </td></tr><tr><td> RE-5B Ag / AgCl referentie-elektrode met flexibele Connector </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Gouden coating silicium wafer, 500um Si, 12Nm Cr, 120Nm Au, SiO 2 voor isolatie </td><td> op maat gemaakt </td><td></td></tr><tr><td> Indium tin oxide coating glasplaatje, rechthoekig, 8-12 ohm weerstand te bieden </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Platina plaat / folie (0,002 in) </td><td> Surepure Chemetals </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Slim Line 2 &quot;Alligator Clips </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 siliconenelastomeer kit </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 Van Fischer </td></tr><tr><td> Fluorescecence stereomicroscoop </td><td> Olympus </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens Standaard </td><td> Olympus </td><td> versie 1.3 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Elektrodepositie en fluorescentie visualisatie apparatuur. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Chitosan, medium moleculair gewicht </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Zoutzuur, ARISTAR. ACS, NF, FCC klasse </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Natriumhydroxide, oplossing. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> Alginezuur, natriumzout </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM Geprecipiteerd Calciumcarbonaat, 70 Nm deeltjes </td><td> Specialiteit Minerals Inc </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Chitosan en alginaatoplossing reagentia. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Calciumchloride, dihydraat </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Natriumchloride, Certified ACS kristallijne </td><td> Fischer Wetenschappelijk </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Kalium monobase, watervrij </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Kalium dibasisch, watervrij </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Andere oplossingen en buffer reagentia. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Bedrijf / Bron </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Glucoseoxidase van Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> Tyrosinase van paddestoel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LB bouillon, Miller (granulaat) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-synthase&quot; (HGLPT) </td><td> Lab voorraad 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 wild-type cellen </td><td> Lab voorraad 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + PET- <em&gt; DsRed - kan r cellen </td><td> Lab voorraad 30 </td><td></td></tr><tr><td> FluoroSpheres: 1 uM diameter, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (en-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidylester, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight antilichaam labeling kit, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Enzymen, cellen en andere functionalisering reagentia.

het overbruggen van de bio-elektronische interface met biofabrication

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

De vooruitgang in lab-on-a-chip technologie belofte van zowel het onderzoek en geneeskunde een revolutie door lagere kosten, betere gevoeligheid, draagbaarheid en hogere doorvoer. De integratie van biologische componenten op biologische micro-elektromechanische systemen (BioMEMS) heeft laten zien een groot potentieel voor het bereiken van deze doelstellingen. Microfabricated elektronische chips zorgen voor micrometer-schaal functies en een elektrische aansluiting voor de detectie en bediening. Functionele biologische componenten geeft het systeem de capaciteit voor de specifieke detectie van analyten, enzymatische functies en whole-cell mogelijkheden. Standaard microfabricage processen en bio-analytische technieken zijn met succes gebruikt voor decennia in de computer en de biologische industrie, respectievelijk. Hun combinatie en interfacing in een lab-on-a-chip-omgeving, maar brengt weer nieuwe uitdagingen. Er is een oproep tot technieken die een interface tussen de elektrode en biologische compo kan bouwenENT dat is mild en is eenvoudig te fabriceren en patroon. Biofabrication, hier beschreven, is een dergelijke benadering die heeft laten zien een grote belofte voor zijn eenvoudig te monteren incorporatie van biologische componenten met veelzijdigheid in de on-chip-functies die zijn ingeschakeld. Biofabrication maakt gebruik van biologische materialen en biologische mechanismen (zelf-assemblage, enzymatische montage) voor de bottom-up hiërarchische montage. Terwijl onze laboratoria hebben aangetoond dat deze begrippen in vele formaten 1,2,3, hier tonen we de assemblage proces op basis van elektrodepositie, gevolgd door meerdere toepassingen van het signaal op basis van interacties. Het samenstel bestaat uit de elektrodepositie van biocompatibele stimuli-responsieve polymeer films elektroden en de daaropvolgende functionalisering met biologische componenten zoals DNA, enzymen of levende cellen 4,5. Elektrodepositie maakt gebruik van de pH-gradiënt gecreëerd op het oppervlak van een voorgespannen elektrode uit de elektrolysewater 6,7. Chitosan en alginaat zijn stimuli-responsieve biologische polymeren die kunnen om zelf te monteren in de hydrogel films worden geactiveerd als reactie op opgelegde elektrische signalen 8. De dikte van deze hydrogelen wordt bepaald door de mate waarin de pH gradient uitstrekt van de elektrode. Dit kan worden gewijzigd met behulp van verschillende stroomdichtheden en depositie keer 6,7. Dit protocol beschrijft hoe chitosan films worden afgezet en gefunctionaliseerd met covalent verbonden biologische componenten van de overvloedige primaire amine groepen aanwezig op de film door enzymatische of elektrochemische methoden 9,10. Alginaat films en de beknelling van levende cellen, zullen aan bod 11. Tenslotte wordt het nut van biofabrication aangetoond door voorbeelden signaal gebaseerde interactie, chemische-elektrische, cel-cel, en enzym-cel signaaloverdracht. Zowel de elektrodepositieen funktionalisering kan onder nagenoeg fysiologische omstandigheden zonder reagentia en dus labiele biologische componenten besparen zware omstandigheden. Daarnaast hebben zowel chitosan en alginaat lang gebruikt voor biologisch relevante doeleinden 12,13. Algemeen kan biofabrication een snelle techniek die eenvoudig kan worden uitgevoerd op een werkblad, worden gebruikt voor het creëren micronschaal patronen van functionele biologische componenten elektroden en kan gebruikt worden voor verschillende lab-on-a-chip toepassingen.

Dit artikel beschrijft een biofabrication benadering: depositie van stimuli reagerende polysachariden in de aanwezigheid van voorgespannen elektroden biocompatibel films kan worden gefunctionaliseerd met cellen of eiwitten te maken. We tonen een bench-top strategie voor de generatie van de films en hun fundamentele toepassingen voor het maken van interactieve biofunctionalized oppervlakken voor lab-on-a-chip toepassingen.

Het overbruggen van de Bio-elektronische interface met Biofabrication

Vooruitgang in lab-on-a-chip-technologie belooft zowel het onderzoek als de geneeskunde te revolutioneren door lagere kosten, een betere gevoeligheid, draagbaarheid en ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om biopolymeerfilms elektrisch neer te slaan en deze te functionaliseren met biologische componenten, zoals eiwitten en cellen. Elektrodepositie wordt bereikt door gebruik te maken van de pH-verandering die lokaal optreedt bij een onder spanning staande elektrode in combinatie met een pH-responsieve polysaccharide-oplossing. Na het kiezen van een kathodische of anodische depositiestrategie wordt de elektrode onder spanning gezet om een sol-gel-overgang te triggeren, waardoor een dunne film wordt gegenereerd met een patroon dat wordt bepaald door de elektrogeometrie.Bovendien kunnen biologische componenten, zoals eiwitten en cellen, gedurende het proces van elektrodepositie worden geïntroduceerd. Om de film biologisch te functionaliseren, zijn resultaten behaald die via fluorescentiebeeldvorming aantonen dat de biologische componenten in de films zijn gelokaliseerd. Daarnaast zijn de componenten functioneel en in staat om met hun omgeving te interageren, wat is aangetoond door elektrochemische detectie van enzymatische activiteit en het gebruik van de respons van reportercellen.Biofabricage biedt een innovatieve gereedschapskist voor het bouwen van de interface tussen biologie en elektronica. Wij geloven dat de belangrijkste voordelen de eenvoud zijn en het vermogen om assemblage uit te voeren onder bijna fysiologische omstandigheden. De biologie is deskundig in fabricage op nanoschaal via zelfassemblage en enzymatische weg. Door gebruik te maken van deze vermogens omzeilen we complexe, gevaarlijke en tijdrovende synthesemethoden die bij andere assemblage-technieken worden gebruikt.Ons collaboratieve team kwam op het idee om de interface van het BioD-apparaat te bouwen met biologische materialen en mechanismen toen we observeerden dat kitan via elektroden kon worden gedeponeerd. Kitan is een pH-responsieve, filmvormende polysaccharide die door het apparaat opgelegde elektrische signalen kan herkennen en zich als een dunne film kan afzetten. Toen we zagen dat kitan via elektroden kon worden gedeponeerd, beseften we dat we toegang hadden tot een bredere set instrumenten uit de biochemie en moleculaire biologie om een interface voor het BioD-apparaat te bouwen.De toepassing van deze techniek strekt zich uit tot lab-on-a-chip-instellingen waar functionele biologische componenten vereist zijn, aangezien ze een goedkope en eenvoudige manier bieden om dergelijke componenten te lokaliseren op een elektrode waar ze levensvatbaar kunnen blijven. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien een bio-gefabriceerde film fragiel kan zijn en gemakkelijk beschadigd kan raken. Daarom moet men voorzichtig zijn om niet te hardhandig te zijn tijdens het wassen of het afspoelen van de film.Aangezien de film gemakkelijk verstoord kan worden, is dit een nadeel. Een voordeel is echter dat de elektroden hergebruikt kunnen worden omdat de film eenvoudig verwijderd kan worden. Om dit protocol te starten, sluit u een voeding aan op de op maat gemaakte elektroden via patchkabels met krokodillenklemmen.Een glazen objectglas bedekt met indiumtinoxide (ITO) dient als anode of werkelektrode; platinafolie dient als kathode of tegenelektrode. Positioneer de elektrode zodanig dat het te functionaliseren ITO-oppervlak tegenover de tegenelektrode staat, waarbij het ITO-oppervlak ofwel verticaal is geplaatst om in de oplossing te worden gedompeld, of horizontaal, zodat de oplossing op het oppervlak kan worden vastgehouden. Bereid vervolgens een alginaat-depositieoplossing door 1% alginaat en 0,5% calciumcarbonaat in gedestilleerd water te mengen en het mengsel te autoclaveren. Label het alginaat vervolgens fluorescent met Fluorspheres door middel van mengen en vortexen.Dit maakt fluorescentie-imaging van de resulterende film mogelijk. Dompel na het autoclaveren beide elektroden onder in de bereide depositie-oplossing en breng gedurende twee minuten een constante stroomdichtheid van 3 A/m² aan. Het voltage zal verschuiven in het bereik van 2 tot 3 V. Koppel na twee minuten de elektrode los en verwijder de resterende depositie-oplossing. Spoel de film voorzichtig met natriumchloride om overtollig alginaat te verwijderen.Incubeer de film kort in 0,1 molair calciumchloride om de gel te verstevigen. De film wordt vervolgens geïncubeerd in de gewenste bewaaroplossing. Beeld de film vervolgens af met fluorescentiemicroscopie voorafgaand aan de co-depositie.Kweek een signaalzender-celcultuur en een signaalontvanger-celcultuur volgens de instructies in het schriftelijke protocol dat bij deze video is gevoegd. Bereid vervolgens een depositieoplossing van alginaat en calciumcarbonaat. Meng de oplossing met elke celcultuur in een verhouding van één-op-één tot een eindconcentratie van 1% alginaat en 0,5% calciumcarbonaat, waarbij de cellen zijn verdund tot ongeveer de helft van de kweekdichtheid.Gebruik een glazen objectglas voorzien van twee ITO-elektroden, begrensd door een polydimethysilaan-kuiltje, en een platina tegenelektrode. Verbind één ITO-elektrode en de platina elektrode met een spanningsbron. Dompel de elektroden, zoals voorheen, onder in de depositie-oplossing die de ontvangercellen bevat.Stel de voeding in op een constante stroom met een dichtheid van drie ampère per meter vier, waarbij de afmeting van het oppervlak wordt bepaald door de enkele elektrode waarop de depositie plaatsvindt. Breng de stroom gedurende twee minuten toe om de codepositie van de cellen in de alginaatmatrix mogelijk te maken. Spoel de film af met natriumchloride zoals voorheen en verplaats de anodeverbinding naar de aangrenzende ITO-elektrode.Herhaal de depositieprocedure, maar voeg deze keer de oplossing met de zendercellen toe. Incubeer de twee-elektrode chip met de co-gedeponeerde cellen en calciumargenat een nacht lang bij 37 °C in fosfaatgebufferde zoutoplossing.Aangevuld met 10% LB-medium en één millimolaire calciumchloride. Na incubatie wordt de chip gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop om te beginnen met de depositie van de chitosan-elektrode. Sluit de voeding aan op de elektroden.Bevestig de krokodillenklemmen. Een goudgecoate siliciumchip dient als kathode en een platinafolie dient als anode. Positioneer het goudoppervlak van de elektrode zodanig dat deze de tegenelektrode tegenover staat, zoals eerder beschreven.Bereid een Kato-zandoplossing door Kato-zandvlokken te mengen met water en langzaam twee molair zoutzuur toe te voegen om de polysachariden op te lossen. Volgens de in de tekst beschreven procedure kan de Kato-zandoplossing fluorescent gelabeld worden om de op de elektrode neergeslagen film via fluorescentiemicroscopie te visualiseren. Plaats vervolgens de elektroden in de kaizan-oplossing, waarbij het gewenste gebied voor depositie volledig wordt ondergedompeld.Pas gedurende twee minuten een constante stroom toe, berekend op een dichtheid van vier ampère per vierkante meter op basis van het oppervlak van de werkelektrode. In dit geval wordt een stroom van 16 µA aangelegd op een gouden elektrode van vier mm², waarbij de spanning zal verschuiven binnen het bereik van twee tot drie volt. Spoel vervolgens de elektrode met gedeïoniseerd water om overtollig chitosan te verwijderen. Ga over tot het afbeelden van de film met een fluorescentiemicroscoop; copos chitosan en glucose-oxidase zijn vanuit een oplossing bij een stroomdichtheid van vier ampère per vierkante meter op een gepatroneerde elektrode aangebracht.Volgens de procedure voor de depositie van de chitosan-elektrode wordt een kaizan-film gegenereerd waarin glucose-oxidase is ingesloten. Bevestig de behandelde elektrode als werkelektrode aan een drieelektrodensysteem, met een platina draad als tegenelektrode en zilver/zilverchloride als referentie-elektrode; dompel de elektroden onder in een fosfaatbuffersolution die natriumchloride bevat. Conjugeer het eiwit elektrochemisch aan de Kazam-film door middel van chronopyrometrie door gedurende 60 seconden een constante spanning aan te leggen na de conjugatie.Plaats de chip in fosfaatbuffer en was deze 10 minuten op een orbitale schudder om onreactief natriumchloride en niet-geconjugeerd glucose-oxidase te verwijderen. Sluit het drieelektrodensysteem opnieuw aan en dompel dit onder in een oplossing van 5 millimolaire glucose. Stel vervolgens de gewenste parameters voor cyclische voltammetrie in om het potentieel in positieve richting tot 0,7 volt te scannen.Verwijder de elektroden uit de glucose-oplossing en spoel deze af met fosfaatbuffer. Plaats de elektroden vervolgens in een bekerglas van 10 milliliter met acht milliliter fosfaatbuffer op een magnetische roerplaat. Stel de GOX-gefunctionaliseerde chip in op 0,6 volt om als werkelektrode te dienen.Nadat de gewenste parameters zijn ingesteld, wordt een basislijnmeting verzameld. Voeg aliquoten glucose toe aan de buffer om de glucoseconcentratie met vier millimolair per aliquot te verhogen. In dit experiment worden aliquoten van 400 µL 80 millimolair glucose aan de buffer toegevoegd. Correleer de gemeten stroom aan elke glucoseconcentratie. Om een standaardcurve te genereren voor de functionalisering van eiwitten, wordt een glazen objectglas gebruikt met een patroon van naast elkaar gelegen goud- en ITO-elektroden, ingesloten in A-P-D-M-S.Zet de gouden elektrode onder een kathodisch potentiaal om tizen elektrochemisch neer te slaan, zoals eerder beschreven. Spoel de film na en voeg een oplossing toe van blauw fluorescent gelabelde auto-inducer-2-synthase aangevuld met tyrosinase. Laat dit vervolgens één uur incuberen bij kamertemperatuur.Spoel de film zoals eerder beschreven met PBS, breng een anodisch potentieel aan op de ITO-elektrode die is ondergedompeld in een alginaatdepositie-oplossing met ontvangercellen. Ga verder met dezelfde stappen als beschreven bij de co-depositie van celpopulaties in alginaat om het verzonden signaal enzymatisch te genereren. Voeg na het spoelen van de films een oplossing toe van vijf micromolair SAH en PBS, aangevuld met 10% LB-medium en één millimolair.Dek de elektroden af met calciumchloride om verdamping van de oplossing te voorkomen en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. Dit maakt een respons van de ontvangercel mogelijk door de generering van een rood fluorescent eiwit DS red; aangrenzende elektroden kunnen worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie door de filters zo in te stellen dat zowel de blauwe fluorescentie van de inducer two synthase als de rode fluorescentie die wordt tot expressie gebracht door de gecoöpteerde ontvangercellen worden vastgelegd. Opgedrukte elektrische signalen kunnen gelokaliseerde micro-omgevingen nabij een elektrode-oppervlak creëren, en deze stimuli kunnen de zelfassemblage van polysachariden zoals alginaat en razan triggeren om als een hydrogel-film op het elektrode-oppervlak te neerslaan.Omdat deze sol-gelovergang plaatsvindt aan het elektrode-oppervlak, is de resulterende film elektro-geadresseerd met een geometrie die overeenkomt met het elektrodepatroon. Met behulp van alginaat zijn unieke celpopulaties co-gedeponeerd op afzonderlijke adressen. Bewijs van hun elektrode-adressering wordt waargenomen bij interactie tussen de zender- en ontvanger-celpopulatie.Het molecuul auto-inducer twee diffundeert vanuit de zendercellen en wordt opgenomen door de ontvangercellen, wat leidt tot expressie van het DS red-fluorescent eiwit. Hierbij wordt rode fluorescentie alleen waargenomen bij de elektrode waar de ontvangers worden geadresseerd. Omgekeerd biedt het biosensor-enzym glucose-oxidase de mogelijkheid om glucose te detecteren via een enzymatische reactie door waterstofperoxide te produceren, dat vervolgens elektrochemisch kan worden geoxideerd om een uitgangsstroom te genereren.Op deze manier kan een chemisch signaal worden omgezet in een elektrisch signaal. Deze grafiek laat zien dat films waarin Geo X chemisch was geconjugeerd een sterk antisignaal produceren in de aanwezigheid van glucose, in tegenstelling tot films zonder Geo X. Deze resultaten geven aan dat Geo X op een gedeponeerde zam-film kan worden samengesteld en/of katalytische activiteit behoudt. Bovendien wordt een stapsgewijze toename van een otische stroom geproduceerd als reactie op toenemende glucoseconcentraties.De getoonde standaardcurve laat zien dat de stapsgewijze toenames in een bijna lineaire mate plaatsvonden, afhankelijk van de hoeveelheid toegevoegde glucose. Deze resultaten tonen aan dat het enzym ook zijn gevoeligheid behoudt na conjugatie aan de Razza-film; zoals hier afgebeeld, bevat de I two synthase een Penta tyrosine-tag. Tyrosinase werkt in op de tyrosine-tag door de fenolgroepen van de residuen te oxideren tot o-chinonen, die vervolgens covalent binden aan de aminegroepen van de Kazam-film. Bewijs van functionalisering van de Kazam-film binnen de a i two synthase door tyrosinase-assemblage is te zien in deze fluorescentieafbeelding, waarop een kaza-film op goud wordt getoond waarbij de gefunctionaliseerde I two synthase blauw fluorescent gelabeld is. Omdat een I two synthase een I two genereert uit het substraat SAH op dezelfde wijze als de zendercellen, zorgt de nabijheid van gecoöpteerde ontvangercellen in aanwezigheid van SAH er ook voor dat de ontvangercellen fluorescent reageren door ds te expresseren.De rode fluorescentie van de ontvangercellen demonstreert opnieuw de interactie tussen adressen door de diffusie van ai, twee van de ene naar de andere, en geeft verder aan dat 10 enzymen geïmmobiliseerd aan tizen hun activiteit behouden zodra ze covalent gebonden zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u polysacharidefilms elektrodepositeert en hoe u deze functionaliseert met behulp van diverse technieken. We hebben de veelzijdigheid van deze functionalisatiestappen aangetoond, waardoor we in verdere tests met een multitude aan biologische componenten kunnen werken.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts enkele minuten worden uitgevoerd om goed gedefinieerde filmpatronen te genereren waarop biologische componenten nauwkeurig kunnen worden geënt. Op deze manier kunnen we zeer eenvoudig biologisch gepatronde en actieve oppervlakken op aangewezen elektroden creëren, waarbij alles op een georganiseerde wijze gebeurt en toch complexe biologische interacties kunnen worden gerealiseerd. Na deze procedure kan creativiteit worden toegepast, zowel bij het ontwerp van de elektrode-array als bij de keuze van de biologische componenten, om de beoogde interactie te bereiken.Onze hoop is dat de biofabricatietools twee uiteenlopende vakgebieden zullen overbruggen, biotechnologie en micro-elektronica, die elk afzonderlijk ons leven hebben gerevolutioneerd. Door deze twee velden te koppelen, geloven we dat we nieuwe oplossingen zullen creëren voor enkele van de meest urgente problemen van de samenleving. Zo voorzien we bijvoorbeeld dat biofabricatie eenvoudige en veelzijdige methoden kan bieden voor nieuwe manieren van detectie, voor point-of-care, de diagnose van ziekten en het detecteren van biologische en chemische dreigingen.Een voorbeeld van een verregaande toepassing zou kunnen zijn dat de volgende generatie arteriële stents niet alleen in staat is om de slagader open te houden, maar ook om uw metabole profiel te bewaken.

bridging-the-bio-electronic-interface-with-biofabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we verschillende technieken voor microfluïdische snelle prototypeplatforms. De voorgestelde technieken zijn gebaseerd op ultraviolet (UV) gevoelige en temperatuurgeharde epoxyharsen, op polydimethylsiloxaan (PDMS) gebaseerde buizen, draadverbinding en anisotrope kleeffolies. De gepresenteerde assemblageprocedures zijn ontwikkeld voor zowel eenmalig gebruik als herbruikbare microfluïdische systemen.

High Throughput Microfluidic Rapid en Low Cost Prototyping Verpakking

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van het fabricageproces van een high-density contact flat-interface zenuw elektrode (FINE). Deze elektrode is geoptimaliseerd voor het opnemen en stimulerende neurale activiteit selectief in perifere zenuwen.

Fabrication van High-Density Contact, Flatscreen-Interface Nerve Elektroden voor het opnemen en Stimulatie Applications

Dit artikel presenteert een reeks protocollen voor het ontwikkelen van gemanipuleerde cellen en gefunctionaliseerde oppervlakken die het mogelijk maken synthetisch gemanipuleerde E. coli te beheersen en te manipuleren programmeerbare materiaal oppervlakken.

Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials

In deze paper presenteren we een protocol om organische materialen op textiel, die zorgt voor de directe integratie van organische elektronische apparaten met wearables selectief deponeren. De gefabriceerde apparaten kunnen volledig worden geïntegreerd in textiel, met respect voor hun mechanische uiterlijk en het mogelijk maken sensing mogelijkheden.

Een eenvoudige en schaalbare Fabrication Methode voor biologisch Electronic Devices on Textiles

Deze publicatie beschrijft de fabricage van een apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden voor directe kwantificering van signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER). Voor een validatie, de bloed - hersen barrière werd geïmiteerd binnen dit microfluidic apparaat en zijn functie als barrière werd gecontroleerd. De gepresenteerde methoden voor de integratie van de elektrode en directe kwantificering van de TEER zijn algemeen toepasbaar.

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

We hebben aangetoond dat het etsen van nano-architectuur in intracorticale micro-elektrode-apparaten de ontstekingsreactie kan verminderen en de potentie heeft om elektrofysiologische opnames te verbeteren. De hierin beschreven methoden schetsen een benadering van etch nano-architecturen in het oppervlak van niet-functionele en functionele enkelvoudige schacht silicium intracorticale micro elektroden.

Gerichte ionen straal-lithografie voor etch nano-architecturen in micro elektroden

Een bioinspired steiger wordt vervaardigd door een zachte fotolithografietechniek met mechanisch robuuste en elektrisch geleidende hydrogels. De micropatroon hydrogels bieden directionele cardiomyocyte cel uitlijning, wat resulteert in een op maat gemaakte richting van actuatie. Flexibele micro-elektroden zijn ook geïntegreerd in het schavot om elektrische controleerbaarheid voor een zelf-actulerend hartweefsel te brengen.

Bioinspired Soft Robot met ingebouwde micro-elektroden

Twee recente technologieën - tatoeage en textiel - hebben veelbelovende resultaten laten zien in cutane sensing. Hier presenteren we de fabricage- en evaluatiemethoden van tatoeage- en textielelektroden voor cutane elektrofysiologische detectie. Deze elektronische interfaces van geleidende polymeren presteren beter dan de bestaande normen op het gebied van comfort en gevoeligheid.

Conforme draagbare elektroden: van fabricage tot elektrofysiologische beoordeling

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van organische elektrochemische transistors (OECT's) om extracellulaire elektronenoverdracht (EET) activiteit in Shewanella oneidensis te vertalen in elektrische signalen. Het hybride OECT-systeem biedt verbeterde robuustheid, gevoeligheid en potentieel voor snelle tests met hoge doorvoer, waardoor het een effectief hulpmiddel is voor EET-metingen.

Vertalen van extracellulaire elektronenoverdrachtsactiviteiten met organische elektrochemische transistors

Dit protocol schetst geavanceerde materiaalfabricage en ex vivo rattenhartmethoden voor optische en elektrische bidirectionele bio-interfacing, waardoor nauwkeurige hartstimulatie, registratie en infarctmodellering voor bio-elektronicaonderzoek mogelijk zijn.

Bidirectionele elektrische en opto-elektronische interfaces in gezonde en ischemische ex vivo rattenharten

Dit protocol beschrijft de fabricage van een indium-tinoxide (ITO)-gebaseerde ionengevoelige veldeffecttransistor (ISFET) uit één stuk, die kan worden geconstrueerd als een oplossingsafhankelijke FET-sensor (bijv. pH-sensor) met behulp van een kort en eenvoudig proces (ongeveer een halve dag). Deze ITO-ISFET uit één stuk kan ook worden toegepast op biosensing.

Fabricage van een oplossingsafhankelijke transistor op basis van indium-tinoxide uit één stuk die gevoelige biodetectie mogelijk maakt

Leer biofabricage van biologisch functionele films met elektrodepositie van pH-responsieve polysacchariden op gepolariseerde elektroden. Deze methode integreert eiwitten en cellen voor lab-on-a-chip toepassingen.

Het overbruggen van de Bio-elektronische interface met Biofabrication

Meer video's verkennen