Name: Neurale Explantatie Culturen van Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer neurale explantatieculturen maken van Xenopus laevis embryo's voor beeldanalyse van groeikegelcytoskeletdynamica. Deze methode maakt fluorescentiemicroscopie van eiwitlokalisatie in levende cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Bob Freeman bedanken voor de opleiding en de Kirschner lab voor het gebruik van de kikker faciliteit, en leden van de Van Vactor lab voor ondersteuning. Wij danken de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School voor hulp bij lichtmicroscopie voor de afbeeldingen in figuur 1. Dit werk werd gefinancierd door het volgende: NRSA NIH gemeenschap en NIH K99 gemeenschap te LAL, Basic Science Partnership financiering ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) naar AEF, en NIH RO1 NS035909 naar DVV

Let op: We beschrijven de stappen in de eerste twee secties alleen in het kort, als uitstekende protocollen met gedetailleerde informatie is elders gepubliceerd die zich richten meer bepaald op de volgende stappen (bijv. 8-12). Daarnaast heeft de algemene protocol van het werken met Xenopus spinale neuronen in levende celculturen al eerder gepubliceerd in een gedetailleerde methoden artikel 8. We raden herziening van dat artikel als aanvulling op deze video, maar hier zijn we niet genoeg informatie om met succes uit te voeren en het oplossen van de neurale buis dissectie en plating protocol in stap 3. 1. In Vitro Fertilisatie van Xenopus Eieren <ol><li> Verkrijgen eieren van vrouwelijke kikkers die werden met choriongonadotrofine (400 eenheden / frog) 12-18 uur ingespoten voordat het ei collectie. Verzamel eieren in gemodificeerde Ringer oplossing 1X Marc (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 2,0 mM CaCl2, 5,0 mM HEPES, pH 7,4 9). </li><li> Bevruchten eieren in vitro met gehakt testes, zoals eerder beschreven negen. </li><li> Na ten minste 20 minuten, verwijder embryo gelei coat door incubatie embryo in 2% cysteine ​​in 1X MMR (tot pH 7,8 met NaOH) gedurende 3-5 min. Wassen met 0,1 x MMR (of 0,1 x MBS (Modified Saline, Barth&#39;s 1X recept: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 keer, en houdt embryo bij kamertemperatuur totdat injecties of desgewenst plaats embryo bij 14-18 ° C om de ontwikkeling te vertragen. </li></ol> 2. Micro-injectie van RNA Opmerking: we gebruiken terwijl RNA injectie hier zijn deze technieken niet beperkt tot RNA en DNA, eiwitten of gemodificeerde nucleïnezuren voor genmanipulatie kan ook worden gebruikt en zijn eerder 12 beschreven. <ol><li> Vóór experiment, RNA voor het labelen cytoskelet of andere structuren are getranscribeerd van gelineariseerde DNA templates met de mMessage mMachine kit (Ambion). mRNA vereist 5 &#39;cap en een 3&#39; polyadenylatie staart vertaling en preventie degradatie in embryo&#39;s. pCS2 + is een algemeen gebruikte vector voor dit doel, en de transcriptie kit bevat een dop analoge tijdens de synthesereactie. We getranscribeerde mRNA in nuclease-vrij ddH 2 0 opnieuw in suspensie in een stock concentratie tussen 500 en 2.000 ng / pl, gevolgd door snelle opslag bij -80 ° C. Vóór injectie verdunnen RNA in ddH 2 0 de geschikte concentratie voor injectie. Aangezien slechts een klein volume worden geïnjecteerd in embryo&#39;s opnieuw suspenderen in buffer is niet nodig. De laatste injectie concentratie typisch 50-200 pg / nl, afhankelijk van de construct en we meestal zullen injecteren tot 4 nl per embryo, maar veel laboratoria traditioneel tot injecteren 10 nl, ongeveer 1% van de totale een embryo. RNA kan giftig zijn bij hoge doses, en de dosis per embryo geslachtenlly varieert van 10 pg tot 1 ng, hoewel tot 5 ng kan worden getolereerd afhankelijk van het specifieke gen en zuiverheid. Echter, voor beeldvorming eiwit lokalisatie, het laagst mogelijke niveau worden geïnjecteerd om overexpressie artefacten te vermijden. RNA voor EB1-GFP in dit protocol wordt gebruikt eindbedrag van 250 pg per embryo. </li><li> Bereid injectienaalden door te trekken capillair met een naald trekker 9, om een tip diameter van ~ 0,2 urn. Met een Sutter P-87 trekker, gebruiken we de volgende instellingen: warmte 644, pull 125, snelheid 70, tijd 250, maar deze parameters verschillen, afhankelijk van machine en moet worden bijgesteld na het veranderen van de gloeidraad (die we momenteel gebruik van een 2,5 mm vierkante doos gloeidraad die is 2,5 mm breed). Onder een microscoop, breek naald met een pincet onder een hoek met een ganzenveer-achtige vorm te genereren. Er zijn andere methoden voor het breken en vullen injectienaalden (bijvoorbeeld 11,12), maar we vullen naald RNA door een kleine druppel (0,5 - 1 ul) aan de achterzijde van denaald. Voor microinjecting tot embryo&#39;s, zijn er een aantal commercieel verkrijgbare injectiesystemen, twee van de bekendste zijn Pico-injector (Medical Systems), en Nanoject (Drummond Scientific) (zie 11 voor meer informatie). We gebruiken de Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, die samengeperst gas gebruikt voor een digitaal ingesteld tijd om consistente nanoliter volumes te leveren. Injectievolume worden geijkt voor elke nieuwe micropipet met een micrometer en injectietijd worden aangepast aan de gewenste hoeveelheid ingespoten RNA bereiken. </li><li> Place embryo&#39;s op de 1 - tot 4-cellig stadium in een plastic schotel met 5% Ficoll in 0,1 x MMR. Die de embryo vast met forceps of plaatsing in een holding platform (een plastic mesh, met ~ 1 mm raster gehecht aan de bodem van de schaal met plasticine of tandheelkundige wax), injecteer gewenste volume in dierlijke blastomeren (zie stap 2.1 voor meer informatie met betrekking tot injectie volumes). Verdelen in verschillende locties in embryo, ten minste een injectie in elke dier blastomeren verkrijgen meer uniforme verdeling (bijvoorbeeld voor een 4-cellig stadium embryo, we meestal 1-2 keer geïnjecteerd in elk blastomeer, terwijl in een 2-cellig stadium embryo, we injecteren 2-4 keer in elk blastomeer). Een voordeel van te wachten tot de 2-4 cel stadium is dat u ervoor zorgen het embryo is begonnen normaal aan te hangen. Echter, als de tijd is van de essentie, kunt u beginnen op de 1-cellig stadium, met weinig verschil in het eindresultaat dan meer embryo&#39;s om te worden geïnjecteerd. Oudere embryo&#39;s kunnen ook gebruikt worden, en dit is bijzonder nuttig indien specifieke celtypen zijn gericht voor injectie, maar we algemeen de voorkeur breder expressie we injecteren in jonge embryo&#39;s de behoefte aan talrijke injecties te verminderen. </li><li> Overdracht geïnjecteerde embryo&#39;s om een plastic schotel met 0,1 x BMR en hen in staat stellen te ontwikkelen tot stadium 20 tot 23 13. Incubeer embryo 14 tot 22 ° C afhankelijk van de gewenste speed. van de ontwikkeling. (Voor het ontleden van neurale buis de volgende dag, gebruik ~ 22 ° C. Voor de dag na, gebruik dan ~ 14 ° C) </li></ol> 3. Neurale buis Dissection en Plating <ol><li> Voorafgaand aan het uitvoeren van de dissecties, de voorbereiding van de cultuur gerechten 14. Eerste laag dekglaasjes met voldoende oplossing van 200 ug / ml poly-lysine in PBS tot pool over het oppervlak van het dekglaasje van hetzij Mattek of Lab-Tek kweekschalen, en incubeer gedurende een uur (als alternatief kan men gebruik dekglaasjes zitten los in een petrischaal voor later plaatsing op glasplaatjes voor beeldvorming en immunocytochemie). Zuig en was met een overmaat PBS 3 keer, en laat drogen. Smeer schalen met 10 ug / ml laminine in PBS (we gebruiken 500 ul per coverslip, genoeg om pool over het oppervlak) gedurende een uur bij 37 graden. Zuig laminine oplossing weg en was 3 keer met een overmaat PBS, en let niet te laten laminine-gecoate oppervlakken worden blootgesteld aan de lucht-interface. Vervane PBS met kweekmedium (50% Ringer&#39;s, 49% L-15 media, 1% foetaal runderserum, plus 50 ug / ml penicilline / streptomycine en gentamycine, pH 7,4 en filter gesteriliseerd). (Ringer&#39;s Media, 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Terwijl onze protocol gebruikt deze media, moet worden opgemerkt dat dit een verrijkt medium gebruikelijk oudere Xenopus retinale ganglioncellen culturen, waarbij neuronen minder energie voorbehouden. Jonge ruggenmerg culturen zal overleven en groeien meer dan 24 uur in de zuivere Ringers Media zonder extra groeifactoren, en dit is inderdaad een van de voordelen van het gebruik van dit systeem. Optioneel: Voeg NT3 en BNDF (tot uiteindelijke concentraties van 25 ng / pl elk) aan kweekmedia op axon uitgroei verhogen. </li><li> Vanwege de variabiliteit in de expressie van mRNA geïnjecteerd, kan embryo vertonen een mozaïek van fluorescentie. Voorafgaand aan het uitvoeren ontledingen, embryo scherm op de aanwezigheid van fluorescentie, die embryo&#39;s Exp identificerenruk de fluorescent eiwit in de neurale buis. Plaats fluorescent embryo&#39;s in stadium 20-23 in een agarose-coated plastic schaal gevuld met Steinberg&#39;s media (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO4, 4,6 mM Tris, pH tot 7,8 dan geautoclaveerd) 5. Om de agarose-gecoate schaal, jas bodem van kunststof schotel met gesmolten 1% agarose in 0,1 X BMR en laten uitharden te maken. Dit verschaft een zacht oppervlak dat geen schade kan optreden aan de fijne forceps en wolfraam naalden tijdens de daaropvolgende stappen dissectie. Dissectie van embryo na trap 23 is mogelijk, maar het is moeilijker als weefsels beter aan elkaar hechten en daarmee een langere behandeling met collagenase. </li><li> Onder een ontleden scope, verwijder de vitelline membraan met fijne tang, en dan isoleren de gehele dorsale deel van het embryo, door het maken van een serie van incisies. Terwijl de ene tang houden het embryo in de plaats, gebruik maken van de tweede naar een incisie te maken op dezijde van het embryo aan het holle inwendige bloot. Gebruik vervolgens beide tang te knijpen langs het weefsel tussen de dorsale en ventrale helften van het embryo, waardoor het snijden van het embryo in de helft van de dorsale gedeelte dat de neurale buis te isoleren. </li><li> Plaats de dorsale explantaat in een Eppendorf buis met 2 mg / ml collagenase in Steinberg media gedurende 15-20 minuten op een rotator om weefsel los te maken en dorsale explant pipet in een plastic agarose-gecoate schaal met verse oplossing Steinberg. Als alternatief kan de explant worden geplaatst in een petrischaal met de collagenase oplossing gedurende 15 min, waarbij de gehele dissectie zouden kunnen worden uitgevoerd. </li><li> Met behulp van een pincet voorzichtig ontleden de neurale buis van de dorsale epidermis en de ventrale notochord. Schuif het uiteinde van de tang tussen de opperhuid en het onderliggende weefsel en langzaam trek de opperhuid, het openbaren van de neurale buis onder. Vervolgens gebruikt u een tang om het weefsel vast te houden en een andere om de punt tussen de schuifneurale buis en notochord. Tenslotte tang om de somieten verwijderen aan weerszijden van de buis. </li><li> Breng de neurale buis op een agarose-gecoate schaal gevuld met kweekmedium, zoals beschreven in stap 3.1. </li><li> Na het verzamelen van verschillende neurale buizen, snijd ze in tal van stukken (ongeveer 20, als de hele buis wordt geïsoleerd) met behulp van geslepen wolfraam naald of een tang, en dan het bord van de stukken in cultuur gerechten gevuld met medium (bereid in stap 3.1), uitspreiden de explantaten gelijkmatig in rijen. </li><li> Na plating, niet bewegen de gerechten omdat dit zou verstoren de beslagleggende cellen. Incubeer de vergulde neurale buis explantaten rond 20-22 ° C. We meestal de schotel van cellen op de bank een nacht rusten bij kamertemperatuur. Een van de voordelen van Xenopus laevis neuronen is dat een speciaal voor celkweek incubator dat CO2 niveaus of reguleert niet nodig. Neurieten en groei kegels kunnen worden waargenomen en afgebeeld bij kamertemperatuur 12-24 Uur na het uitplaten hoewel uitgroei kan worden versneld door toevoeging van groeifactoren. In het algemeen zal expressie van een RNA of plasmide product leiden tot variabele expressie van cellen en daarom is er een waaier van fluorescentie expressieniveaus tussen groei kegels zijn. We hebben waargenomen RNA expressie van fluorescerende eiwitten blijven bestaan ​​na 48 uur na uitplating, uiteraard afhankelijk van de specifieke construct. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Na het volgen van het protocol, dat wordt samengevat in figuur 1A, zal gezonde, goed-ontleed en gekweekt neurale explantaten sturen talrijke axons of neurieten in elke richting op laminine / poly-lysine substraat, getoond in figuur 1B. De groei kegels aan de uiteinden van de axonen kunnen worden afgebeeld door een DIC optiek, zie Figuur 1C, om beeld totale dynamiek motiliteit of hoge resolutie fluorescentiemicroscopie de lo onderzochtcalization van fluorescent gemerkte cytoskeleteiwitten, bijvoorbeeld, EB1-GFP in figuur 1D. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> Figuur 1. Samenvatting van experimenteel protocol en de verwachte uitkomst. A) Protocol flow-chart. Zie filmpje voor meer informatie over dissectie op dag 3. De gehele neurale buis moet worden gesneden in ongeveer 20 gelijke grootte stukken en verspreid gelijkmatig in rijen op het dekglaasje. In deze cartoon, zijn schaar afgebeeld te vertegenwoordigen het snijden van het weefsel met fijn pincet. CG choriongonadotrofine B) DIC beeld van axonen of neurieten uit explantatie (explantatie in de linkerbovenhoek) groeien. C) Hogere vergroting beeld van de groei kegel aan het uiteinde van een groeiend axon. D) Fluorescentie microscopie afbeelding van EB1-GFP in de groei kegel. Scale bar 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li>
<li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li>
<li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li>
<li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li>
<li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li>
<li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual+2010%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890(2008).</li>
<li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li>
<li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+Laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).</li>
<li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li>
<li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li>
<li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li>
<li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li>
<li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Xenopus laevis neurale explantaten sturen neurieten in een robuuste wijze door 24 uur na het uitplaten van de laminine / poly-lysine substraat als de omstandigheden nodig. Met dit substraat groei kegels zijn zeer beweeglijke en kunnen axon lengtes bereiken 1 mm, die in alle richtingen naar buiten uit het explantaat, hoewel typische lengtes 100 urn of meer. Als neurieten niet groeien, zijn er een beperkt aantal redenen het geval. Een mogelijkheid is dat de neurale explantaten niet goed hechten aan de schotel. Zo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Choriongonadotrofine </td><td> Argent Chemical Laboratories </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cysteine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Capillaire Borosil Naalden 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Biologie Inox Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek gerechten </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neurale explantatie culturen van<em&gt; xenopus laevis</em

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Het complexe axon begeleiding wordt voornamelijk veroorzaakt door de groei cone, dat de dynamische beweeglijke structuur aan het uiteinde van de groeiende axon. Tijdens axon uitgroei, moet de groei kegel integreren meerdere bronnen van begeleiding cue informatie voor het moduleren van de cytoskelet om de groei kegel vooruit te stuwen en nauwkeurig navigeren naar de specifieke doelstellingen ervan vinden 1. Hoe deze integratie vindt plaats op het cytoskelet niveau is nog steeds in opkomst, en onderzoek van het cytoskelet eiwitten en effector dynamiek binnen de groei conus kan de opheldering van deze mechanismen toe te staan. Xenopus laevis groei kegels zijn groot genoeg (10-30 micron in diameter) aan op hoge resolutie beeldvorming van levende cytoskelet dynamiek (bijvoorbeeld 2-4) en zijn gemakkelijk te isoleren en in een laboratoriumomgeving manipuleren vergelijking met andere vertebraten. De kikker is een klassiek model voor de ontwikkelingsbiologie neurobiologie studies en belangrijke vroege inzichten in de groei kegel microtubule dynamiek werden in eerste instantie gevonden met behulp van dit systeem 5-7. In deze werkwijze 8 worden verzameld en eitjes bevrucht in vitro, geïnjecteerd met RNA dat codeert fluorescent gelabeld cytoskelet fusie-eiwitten of andere constructies om genexpressie te manipuleren, en vervolgens liet men ontwikkelen om de neurale buis fase. Neurale buizen worden geïsoleerd door dissectie en vervolgens gekweekt en groei kegels op uitgroeiende neurieten worden afgebeeld. In dit artikel beschrijven we hoe u deze methode, waarvan het doel is om de cultuur Xenopus laevis groei kegels voor de volgende afbeelding in hoge resolutie analyse uit te voeren. Terwijl wij het voorbeeld van + TIP fusieproteïne EB1-GFP, kan deze werkwijze worden toegepast op een aantal eiwitten om hun gedrag verduidelijken in de groeikegel.

Kweken neurale explantaten van ontleed<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s die fluorescerende fusie eiwitten tot expressie zorgt voor beeldvorming van de groei kegel cytoskelet dynamiek.

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

Het complexe proces van axonale geleiding wordt grotendeels aangestuurd door de groeikegel, de dynamische, beweeglijke structuur aan de top van het groeiende axon. Tijdens ...

Het doel van deze procedure is het kweken van groeikegels van Xenopus laevis voor daaropvolgende beeldanalyse met een hoge resolutie. Dit wordt bereikt door eerst vrouwelijke kikkers te injecteren met hormonen om de eiproductie te stimuleren. De tweede stap is het verzamelen en bevruchten van de eitjes, om deze vervolgens te injecteren met mRNA of andere constructen van belang.De volgende dag worden de embryo's gedisseceerd en worden de neurale buizen geïsoleerd, in stukken gesneden en op dekglasplaatjes geplaatst. De laatste stap is het in beeld brengen van de uitgroeiende axonen en groeikegels. Uiteindelijk kan fluorescentiemicroscopie met een hoge resolutie worden gebruikt om veranderingen in de eiwitlokalisatie in groeikegels in de loop van de tijd aan te tonen.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de dissecties van de neurale buis moeilijk te leren zijn door enkel een methodensectie te lezen zonder de techniek in de praktijk te observeren. Verkrijg eitjes van vrouwelijke kikkers die 12 tot 14 uur voorafgaand zijn geïnjecteerd met 400 units choriongonadotropine. Verzamel de eitjes in een X marks gemodificeerde ringer-oplossing.Fertiliseer vervolgens de verzamelde X in vitro met fijngehakte testes zoals eerder beschreven, en voeg na ten minste 20 minuten 0,1 XMMR toe. Verwijder het medium en incubeer de embryo's in 2% cysteine in één XMMR bij pH 7,8 gedurende drie tot vijf minuten om de gelei-omhulling van de embryo's te verwijderen. Giet de embryo's vervolgens in een bekerglas.Was vervolgens de embryo's drie tot vijf keer met 0,1 XMMR of 0,1 x gemodificeerde zoutoplossing na de laatste wasbeurt. Bewaar de embryo's in 0,1 XMMR bij kamertemperatuur tot aan de injectie of indien gewenst. Plaats de embryo's bij 14 tot 18 °C om de ontwikkeling vóór de injectie te vertragen.Verdun eerder bereid gecapt RNA tot een eindconcentratie van 50 tot 200 picograms per liter met dubbel gedestilleerd water, en bewaar dit vervolgens op ijs tot de micro-injectie. Bereid daarna de injectienaald voor door een borosilicaatcapillair uit te trekken met een suter-puller of een soortgelijk instrument. Gebruik vervolgens onder een microscoop een pincet om de naaldpunt in een hoek af te breken om een penvormige punt te creëren en vul de naald van achteren aan met 0,5 tot 1 µL van de verdunde RNA-oplossing.Bevestig de naald op de micromanipulator; hier wordt een PLI 100 PICO-injector van A medical system gebruikt. Plaats nu de bevruchte embryo's in het stadium van één tot vier cellen in een plastic schaaltje met 5% fol in 0,1 XMMR. Kalibreer het injectievolume voor elke nieuwe micropipet met een oculairmicrometer of een voorwerpmicrometer.Stel vervolgens de pico-injector zo in dat de gewenste hoeveelheid RNA per injectie wordt toegediend. In dit geval wordt een injectievolume van 1 nanoliter gebruikt. Houd de embryo's vast met een pincet of plaats ze, indien gewenst, op een platform en injecteer het gewenste volume in de animal blastomeren.Verdeel de injecties over verschillende locaties in het embryo om een uniforme distributie van RNA te verkrijgen. Voor een embryo in het viercellige stadium worden één tot twee injecties per blastomeer uitgevoerd, terwijl voor een embryo in het tweecellige stadium twee tot vier injecties worden gebruikt. Breng de geïnjecteerde embryo's na de injecties over naar een plastic schaaltje met 0.1 XMMR en laat ze zich ontwikkelen tot stadium 20 tot 23.Afhankelijk van de gewenste ontwikkelingssnelheid worden de embryo's geïncubeerd bij een temperatuur van 14 tot 22 °C. Coat PLL-behandelde kweekschalen met 10 µg/mL laminine in PBS en plaats de platen gedurende één uur bij 37 °C. Zodra de incubatietijd is verstreken, worden de platen drie keer gewassen met PBS, waarbij nauwkeurig moet worden voorkomen dat het laminine-gecoate oppervlak na de laatste wasbeurt aan de lucht wordt blootgesteld. Vervang het PBS door kweekmedium.Bereid tot slot drie met agarose gecoate petrischalen voor door de bodem van een kweekschaal te coaten met 1% agarose in 0,1 XMMR en dit te laten uitharden. Zodra dit is uitgehard, vult u één schaal met Steinberg-medium; variabiliteit in de expressie van het geïnjecteerde mRNA kan ertoe leiden dat embryo's een mozaïek van fluorescentie vertonen voorafgaand aan de dissecties. Screen de embryo's op de aanwezigheid van fluorescentie en identificeer die embryo's die het fluorescerende fusieprotein in de neurale buis tot expressie brengen.Breng vervolgens de fluorescerende embryo's in stadium 20 tot 23 over naar de met agros gecoate plastic schaal met Steinberg's Media. Plaats de schaal onder een dissectiemicroscoop en gebruik een fijne pincet om het vitellijnvlies te verwijderen. Houd vervolgens het embryo met één pincet op zijn plaats, terwijl u met de tweede pincet een incisie aan de zijkant van het embryo maakt om het holle interieur bloot te leggen.Gebruik vervolgens beide sets pincetten om het weefsel tussen de dorsale en ventrale helften van het embryo samen te knijpen, zodat het embryo in tweeën wordt gedeeld en het dorsale gedeelte met de neurale buis wordt geïsoleerd. Plaats het dorsale X explantaat in een microcentrifugebuisje met 2 mg/mL collagenase in Steinbergs medium en plaats dit 15 tot 20 minuten op een rotator. Draag het dorsale explantaat vervolgens over naar een agar-gecoate schaal gevuld met vers Steinbergs medium.Dissekeer onder de microscoop de neurale buis van de dorsale epidermis en de ventrale Noor door de punt van de pincet tussen de epidermis en het onderliggende weefsel te schuiven en de epidermis langzaam terug te trekken. Gebruik vervolgens één pincet om het weefsel vast te houden en een andere om het weefsel rondom de neurale buis te verwijderen. Breng de gedissekeerde neurale buis vervolgens over naar een met agros gecoate schaal gevuld met vers kweekmedium.Zodra er verschillende neurale buizen zijn verzameld, verscherpt u wolfraamnaalden of pincetten om elke buis in ongeveer 20 stukjes te snijden. Plaats de stukjes vervolgens op de met laminine gecoate kweekschaaltjes, waarbij de stukjes gelijkmatig in rijen worden verdeeld. Na het uitplaten van de neurale buizen mogen de schaaltjes niet worden verplaatst, omdat dit de aanhechting van de cellen zal verstoren.Incubeer het op de plaat gebrachte neurale buisexplant bij 20 tot 22 °C. Een celkweekincubator is niet vereist voor de kweek van XUS lavis neuronen 12 tot 24 uur na het uitplaten; beeldvorming van neuronen en groeikegels kan bij kamertemperatuur plaatsvinden. Houd er rekening mee dat variabele RNA-expressie kan leiden tot een variatie in fluorescentieniveaus tussen groeikegels.Deze DIC-afbeelding toont axonen en neurieten die groeien vanuit de X-explanat in de linkerbovenhoek van het gezichtsveld. De schaalbalk in deze afbeelding en de volgende afbeeldingen staat voor 10 microns. Deze film met een hogere vergroting toont de groeikegel aan de punt van een groeiend axon.Ten slotte laat deze fluorescentiemicroscopie-film de expressie van EB one GFP in een groeikegel zien. Hoewel we hier het voorbeeld geven van de beeldvorming van het plustip-fusie-eiwit EB one GFP, kan deze methode met neurale explantaten worden toegepast op een willekeurig aantal eiwitten om hun gedrag binnen de groeikegel tijdens de neurietuitgroei te verhelderen.

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Xenopus laevis een ideaal model voor het bestuderen cellen lot specificatie en fysiologische functie van individuele retinale cellen in primaire celkweek. Hier wordt een methode voor het ontleden retinale weefsels en genereren primaire celculturen die afgebeeld voor calcium activiteit en geanalyseerd door in situ hybridisatie.

Dissection, Cultuur en Analyse van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonale netvliesweefsel

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt...

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.

Dissectie van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neurale lijst voor<em&gt; In vitro</em&gt; Explantaatkweek of<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantatie

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Zebravis blastoderm explantaten worden gegenereerd door embryonale cellen te isoleren van endogene signaleringscentra in het vroege embryo, waardoor relatief naïeve celclusters worden geproduceerd die gemakkelijk ex vivokunnen worden gemanipuleerd en gekweekt. Dit artikel geeft instructies voor het maken van dergelijke explants en toont hun nut aan door rollen te onderzoeken voor nodale signalering tijdens gastrulatie.

Generatie van naïeve Blastoderm Explants uit Zebravis Embryo's

Deze video protocol laat zien hoe om te discrimineren en te goeder trouw neurale stamcellen te sommen in een gemengde populatie van neurale voorloper cellen met behulp van de neurale kolonievormende cell assay.

Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

Leer neurale explantatieculturen maken van Xenopus laevis embryo's voor beeldanalyse van groeikegelcytoskeletdynamica. Deze methode maakt fluorescentiemicroscopie van eiwitlokalisatie in levende cellen mogelijk.

Neurale Explantatie Culturen van

Meer video's verkennen