Name: Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Leer glycaanprofilering van plantencelwandpolymeren met CoMPP-microarrays en monoklonale antilichamen. Deze methode maakt snelle, hoogdoorvoeranalyse van glycaansamenstelling in diverse plantenweefsels mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IEM wil graag de Deense Raad voor Onderzoek (FTP en FNU) bevestigt de voor financiering. ERL erkent de steun van een ARC DP subsidie. AB erkent de steun van het ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls subsidie.

1. Tissue Collection &amp; voorbereiding <ol><li> Verzamel 100 mg vers gewicht van plantenweefsels (minimaal 10 mg drooggewicht) in tenminste drievoud elk weefsel plaats. De volgende stappen beschrijven de bereiding van celwandmateriaal van vegetatieve weefsels. Bij opslagweefsels is van ongewenste zetmeel enzymatisch verwijderd alvorens de extractie van celwandpolymeren zoals eerder beschreven 13. </li><li> Homogeniseer de monsters tot een fijn poeder met vloeibare stikstof met een Qiagen TissueLyser II, met 24 buisadapter sets en 3 mm wolfraamcarbide kralen (30 Hz, 2 x 30 sec). Alternatief indien slechts enkele monsters worden verwerkt, wordt een vijzel gebruikt. </li><li> Breng de homogenaten in 10 ml plastic conische buizen. </li><li> Bereid celwandmateriaal door wassen van de homogenaten in 10 ml 80% v / v ethanol bij kamertemperatuur en krachtig vortexen gedurende 2 minuten. </li><li> Centrifugeer monsters op 3.500 xg en verwijder het supernatant. Herhaal de 70% ethanol wast minstens drie keer of totdat de supernatant helder, vooral voor weefsels die chlorofyl. </li><li> Voer een laatste wasbeurt met 100% aceton en laat de pellets die Alcohol onoplosbare residu (AIR) aan de lucht drogen. </li><li> Zeef de luchtmonsters met een 0,4 mm 2 mesh tot een fijn, homogeen poeder te bereiken en te verwijderen grotere, slecht gemalen deeltjes die ergens blijven in de homogenaat. </li><li> Weeg 10 mg AIR monster in microbuizen, die elk een 3 mm glaskraal het mengen van monsters steun. </li></ol> 2. Extractie van celwand Glycanen <ol><li> Pectinen en polymeren verbonden pectines worden uit de monsters door toevoeging van 500 ul van 50 uM CDTA (pH 7,5) aan elk monster. </li><li> Kort vortex de buizen te zorgen het oplosmiddel in contact met het monster en meng met de TissueLyser gedurende 3 uur bij 8 Hz. </li><li> Centrifugeer monsters bij 12.000 xg, zorgvuldig rchrap het supernatants en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Was pellets in 1 ml gedeïoniseerd water te verdunnen en te verwijderen alle resterende oplosmiddel, vortex en centrifugeer bij 13.000 x g. Herhaal deze stap zonder de pellet en verwijder alle vloeistof uit de buizen alvorens de volgende stap. </li><li> Verknoping glycanen worden achtereenvolgens uit de resterende celwand pellet met 500 pi 4M NaOH met 0,1% w / v NaBH4, volgens dezelfde procedure beschreven in stap 2,1 tot 2,4 voor de extractie CDTA. NaBH4 toegevoegd aan het aldehyde (of keto) groep aan het reducerende einde van de polysachariden reduceren tot een alcohol waardoor ze base schil van polysacchariden. </li><li> Na centrifugatie worden supernatanten weer verwijderd, bewaard bij 4 ° C en de pellets tweemaal gewassen in gedeïoniseerd water alvorens de volgende extractie. </li><li> Als een optionele stap zijn resterende polymeren, zoals cellulose geëxtraheerd met 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane met 0,78 M CdO) volgens dezelfde procedure als beschreven in stappen 2.1 - 2.4. Als alternatief kan absoluut cellulose-gehalte in resterende pellets worden bepaald met behulp van azijnzuur / Nitric assays (zie bespreking). </li></ol> 3. Afdrukken Microarrays <ol><li> Centrifuge supernatanten bevattend gewonnen celwandpolymeren bij 13.000 xg om vaste deeltjes te verwijderen. </li><li> Plaats 50 ul van elk monster in een polypropyleen 384 putjes microtiterplaat met een vooraf ontworpen aangepaste indeling waar monsters worden geordend weefseltype en extractie type. </li><li> Verdun de celwand polymeermonster in een 0, 5 en 25 x seriële verdunningsreeks met gedeïoniseerd water. </li><li> Parameters zoals pin hoogte, verzameling en de duur, en het wassen stappen worden ingesteld op de software die de microarrayer. </li><li> De vochtigheid van de gedrukte kamer geregeld op 60% sample verdamping te voorkomen. </li><li> De afdruktaak wordt gestart met behulp van LabNEXT software en een programma dat overeenkomt met de microarray layout. </li><li> De robot gebruikt capillaire kanalen kunnen oplossingen van de monsterplaat afdrukken op 20 x 20 cm nitrocellulose membraan dat is bevestigd aan een vlakke plaat in de machine. Elke spot op de array bevat 15 nl oplossing en wordt gedrukt in drievoud. </li><li> Identieke microarrays worden naast elkaar afgedrukt op het membraan en snijd ze in afzonderlijke arrays nadat de afdruktaak is voltooid. </li><li> In elk experiment de arrays kunnen worden gemodificeerd om meer of minder samples, of verdunningen repliceert tegemoet. </li></ol> 4. Probing van Glycan Microarrays <ol><li> Na het afdrukken blokkeren individuele microarrays in 5% w / v magere melkpoeder opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (MPBS) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om niet-specifieke binding te verminderen. </li><li> Probe microarrays met monoklonale antilichamen specifiek voor celwand glycan epitopen gedurende 2 uur in MPBS. De meeste monoklonale ANTIBodies tegen celwand glycanen zijn verkrijgbaar bij drie bedrijven; Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ), Carbosource Services ( <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a> ) en PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ). </li><li> Onder een negatieve controle, een microarray geïncubeerd met alleen MPBS en geen primair antilichaam. </li><li> Was de microarrays 3 maal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 min niet-specifieke binding te verwijderen. </li><li> Probe de microarrays met secundair antilichaam geconjugeerd aan mierikswortel peroxidase (HRP) in MPBS gedurende 2 uur. De meeste monoklonale antilichamen tegen celwand glycanen een anti-muis of anti-rat secundair antilichamen. </li><li> Herhaal de wasstappen 3 keer met PBS-buffer gedurende 5 min niet-specifieke binding te verwijderen. </li><li> Ontwikkel de microarrays met behulp van chromogene (3,3-diaminobenzidine) of chemiluminecent (luminol) substraten. </li></ol> 5. Kwantificatie <ol><li> Na ontwikkeling, scan de individuele microarrays met behulp van een hoge-resolutie (1.200 dpi) desktop scanner en sla de afbeeldingen als negatief, 16-bits TIFF-bestanden (figuur 3). </li><li> Bereken de integraal intensiteit van elke plaats met behulp van Xplore beeldbewerkingssoftware (LabNEXT) uitgerust met een geautomatiseerde rooster tool. De geïntegreerde intensiteit spot is afgeleid van de som van pixels in het raster omgeving vlekken. </li><li> Het raster gegevens voor elke microarray wordt geëxporteerd als een txt-bestand en kan handmatig worden geïmporteerd in een Excel-spreadsheet voor analyse. Een online tool ( <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/</a> ) is ontwikkeld om automatisch te vertalen en gegevens van individuele txt-bestanden te verwerken. </li><li> De integrale plek intensiteit wordt gemiddeld over het afdrukken repliceert en verdunningen te verkrijgen van een &#39;gemiddelde spotintensiteit &quot;waarde voor elk monster (figuur 2). Soms worden spot die corresponderen met slechts een verdunning waarde op de array gebruikt om de relatieve abundantie glycan epitoop voor elk monster te kwantificeren. </li><li> De relatieve gemiddelde plek intensiteiten tussen de verschillende monsters worden gepresenteerd als een heatmap (figuur 4) met behulp van voorwaardelijke opmaak in excel of online heatmapper tools ( <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm</a> ). De gegevens voor elk type antilichaam gecorrigeerd 100 en een 5% grenswaarde wordt opgelegd achtergrondsignaal en valse positieven verwijderen. </li></ol>

<ol><li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants%3A+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li>
<li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action%2C+matrix+properties%2C+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li>
<li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+walls%3A+the+skeleton+of+the+plant+world%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li>
<li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall%3A+searching+for+the+genes+that+define+structure%2C+architecture+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li>
<li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li>
<li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li>
<li>Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillats%2C+WGT+%22The+Plant+Cell+Wall%22">The Plant Cell Wall</a>. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).</li>
<li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li>
<li>Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li>
<li>Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506(2011).</li>
<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , In Press (2012).</li>
<li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7%2C+JIM5+and+JIM7%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li>
<li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li>
<li>Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li>
<li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li>
<li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li>
<li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+linkage+%281%E2%86%923%29%2C%281%E2%86%924%29-%CE%B2-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li>
<li>Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga%2C+Chara%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li>
<li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li>
<li>Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

CoMPP is een snelle en gevoelige werkwijze voor het profileren van de glycan samenstelling van honderden plantaardige monsters in een paar dagen. Deze methode aanvulling op de reeds beschikbare bacteriën of zoogdiercellen glycan matrix platforms voor high-throughput screening van koolhydraat interacties met glycan-binding zoals lectines, receptors en antilichamen 16. Met een grote verscheidenheid van probes voor het detecteren celwand glycanen, is het mogelijk om gedetailleerde informatie te krijgen over glyc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> 3 mm Tungsten Carbide kralen </td><td> Qiagen </td><td> 69997 </td><td></td></tr><tr><td> Collection microbuisjes (1,2 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 19560 </td><td> 1,5 ml microfugebuizen kan ook </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser II </td><td> Qiagen </td><td> 85300 </td><td></td></tr><tr><td> 3 mm glasparels </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 34588 </td><td></td></tr><tr><td> Cadmiumoxide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-diaminoethaan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 03550 </td><td></td></<html> tr&gt; <tr><td> Nitrocellulosemembraan (0,22 urn poriegrootte) </td><td> GE-Water &amp; Process Technologies </td><td> EP2HY00010 </td><td> verschillende porie grootte membranen zijn geschikt voor verschillende pin typen </td></tr><tr><td> Xact II microarrayer robot </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> de Xact II robot is uitgerust met een aangepaste 20 x 20 cm keramische plaat waarop de nitrocellulose membraan is bevestigd </td></tr><tr><td> Xtend RM microarray pinnen </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> pennen moeten geschikt zijn voor het spotten op membranen </td></tr><tr><td> 384 goed microtiterplaten (polypropyleen) </td><td> Greiner </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-glycan monoklonale antilichamen </td><td> Plant Sondes / CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> Websites; PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ), Carbosource (ww.carbosource.net &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.carbosource.net) en Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ). </td></tr><tr><td> Anti-Rat IgG (volledige molecuul) - Peroxidase antilichaam geproduceerd in geiten. </td><td> Sigma </td><td> A9037 </td><td> welk secundair antilichamen afhankelijk van de gebruikte primaire antilichaam (zoals verhoogde in rat, muis, geit enz.). </td></tr><tr><td> SIGMA FAST 3,3 &#39;-diaminobenzidine tabletten </td><td> Sigma </td><td> D4293 </td><td> het type ontwikkelend reagens afhankelijk van de gebruikte secundaire antilichamen en de detectie (colorimetrische of chemiluminecent). </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico chemiluminescentiesubstraat </td><td> Thermoscientific </td><td> 34080 </td><td> zie hierboven </td></tr><tr><td> Xplore Image Processing Software </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> veel software met automatische gridding hulpmiddelen zijn beschikbaarom pixelwaarde van microarray plekken te meten. </td></tr><tr><td> Plant polysacchariden </td><td> Sigma / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

glycaan profilering van plant celwandpolymeren met behulp van microarrays

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant celwanden zijn complexe matrices van heterogene glycanen die een belangrijke rol in de fysiologie en ontwikkeling van planten te spelen en bieden de grondstoffen voor de menselijke samenleving (bv hout, papier, textiel en biobrandstof-industrie) 1,2. Echter, het begrijpen van de biosynthese en functie van deze componenten blijft uitdagend. Celwand glycanen zijn chemisch en conformationeel gevarieerd vanwege de complexiteit van hun bouwstenen, de glycosyl residuen. Deze vormen bindingen op meerdere posities en verschillen in ringstructuur isomere of anomere configuratie, en bovendien zijn gesubstitueerd met een array van niet-suikerresten. Glycaan samenstelling varieert in verschillende cel-en / of weefseltypen of subgebieden van een celwand 3. Bovendien is de samenstelling ook aangepast tijdens de ontwikkeling 1 of in reactie op omgevingsfactoren 4. In exproces van 2.000 genen Plant celwanden zijn complex arrays heterogene glycanen voorspeld betrokken bij celwand glycan biosynthese en modificatie in Arabidopsis 5. Echter, relatief weinig biosynthetische genen functioneel 4,5 gekarakteriseerd. Reverse genetics benaderingen moeilijk omdat de genen vaak differentieel tot expressie, vaak op lage niveaus tussen celtypes 6. Ook zijn mutant studies vaak belemmerd door gen redundantie of compenserende mechanismen om te zorgen voor passende celwand functie is 7 gehandhaafd. Zo nieuwe benaderingen nodig zijn om snel te karakteriseren van de uiteenlopende glycaanstructuren en functionele genomica gebaseerde benaderingen bevorderen om te begrijpen celwand biosynthese en modificatie. Monoklonale antilichamen (mAbs) 8,9 naar voren zijn gekomen als een belangrijk instrument voor het bepalen van glycan structuur en de verdeling in planten. Deze herkent distInCT epitopen aanwezig in grote klassen van plantencelwand glycanen, met inbegrip van pectines, xyloglucanen, xylanen, mannanen, glucanen en arabinogalactans. Onlangs het gebruik uitgebreid tot grootschalige screening experimenten om de relatieve abundantie van glycanen bepalen in een breed scala van planten en weefseltypes tegelijkertijd 9,10,11. Hier wordt een microarray gebaseerde glycan screening methode genaamd Comprehensive Polymer Microarray Profiling (CoMPP) (figuren 1 en 2) 10,11 die meerdere monsters kan (100 sec) worden gescreend met een geminiaturiseerde microarray platform met beperkte reagens en monstervolumes. De plek signalen op de microarray kan formeel worden gekwantificeerd aan semi-kwantitatieve gegevens over glycan epitoop optreden te geven. Deze benadering is geschikt voor het bijhouden glycan veranderingen in complexe biologische systemen 12 en een globaal overzicht van celwandsamenstelling bijzonder wanneer voorkennis of deze niet beschikbaar is.

De relatieve overvloed van glycanen in zes weefseltypen (helmknop filamenten, pollen, eierstokken, bloemblaadjes, kelkbladen en stigmatisering) van Nicotiana alata bloemen werd bepaald met behulp CoMPP. Figuur 3A toont een representatieve microarray die is gemerkt met mAb specifiek voor JIM5 gedeeltelijk (laag) methylesterified homogalacturonan (HG), een epitoop die optreedt op pecto polysacchariden 14. De JIM5 epitoop wordt gedetecteerd in CDTA extracten van bloemen weefsels echter het grootst in po...

Genaamd Een techniek<strong&gt; C</strong&gt; Omprehensive<strong&gt; M</strong&gt; Icroarray<strong&gt; P</strong&gt; Olymer Profiling (CoMPP) voor de karakterisering van plantencelwand glycanen wordt beschreven. Deze methode combineert de specificiteit van monoklonale antilichamen gericht tegen bepaalde epitopen-glycan met een miniatuur microarray analyse platform zodat screening van glycan voorkomen in een breed scala aan biologische context.

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Plantaardige celwanden zijn complexe matrices van heterogene glycanen die een belangrijke rol spelen in de fysiologie en ontwikkeling van planten en die zorgen voor de ...

Het algemene doel van deze procedure is om de samenstelling van celwandpolymeren in een breed scala aan planten of weefseltypes te vergelijken met behulp van glycaan-microarrays. Oogst eerst de gewenste planteweefsels. Bereid na homogenisatie alcohol-onoplosbare residuen.Extraheer vervolgens de glycanen van de celwand sequentieel met CDTA en natriumhydroxide. Print daarna de extracten van de celwandglycanen in een microarray met behulp van een robot. Sondeer de microarrays met monoklonale antilichamen gericht tegen celwandglycanen en kwantificeer de spotsignalen op de microarrays.Uiteindelijk kunnen de resultaten worden gebruikt om de relatieve abundantie van glycaan-epitopen te bepalen over een set van monsters waarin men geïnteresseerd is. We hebben deze microarray-methode ontwikkeld toen we ons realiseerden dat er behoefte was aan een globaal overzicht van het voorkomen van celwandglycanen over meerdere planteweefseltypes gelijktijdig, om zo compositorische verschillen te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden, zoals monosacharide-analyse, is dat dit een op microarrays gebaseerd platform is waarbij honderden monsters gelijktijdig gescreend kunnen worden. Dit is een snelle en uitgebreide methode voor het profileren van de celwandsamenstelling. Begin voor elk weefsel van belang met triplikaat monsters van 100 mg vers gewicht aan planteweefsels met behulp van vloeibare stikstof.Homogeniseer de monsters tot een fijn poeder en breng het homogenaat vervolgens over in plastic conische buizen van 10 milliliter om celwandmateriaal te bereiden. Resuspendeer het homogenaat in 10 milliliters van 80% ethanol bij kamertemperatuur en vortex krachtig gedurende twee minuten. Centrifugeer de monsters bij 3.500 ×g en verwijder het supernatant.Herhaal de wasbeurten met 70% ethanol minstens drie keer of totdat het supernatant helder is. Voer vervolgens een laatste wasbeurt uit met 100% aceton. Palletteer de alcohol-onoplosbare residuen en laat deze gedurende de nacht aan de lucht drogen tot een fijn en homogeen poeder; zeef de monsters van het alcohol-onoplosbare residu met een zeef met een maaswijdte van 0,4 millimeter.Weeg vervolgens 10 milligram van de alcoholonoplosbare residu-monsters af in microtubes die elk een glazen kraal van drie millimeter bevatten voor het mengen. Voeg voor de extractie van pectinen en met pectinen geassocieerde polymeren 500 microliters 50 millimolair CDTA toe aan elk monster, vortex de buisjes kort en meng ze vervolgens gedurende drie uur op acht hertz met de tissueizer. Centrifugeer de monsters op 12.000 keer.G. Verwijder zorgvuldig de supernatanten en bewaar deze bij vier graden Celsius. Was de pellets tweemaal met één milliliter gedeïoniseerd water. Verwijder alle vloeistof uit de buisjes van de resterende celwandpellet.Ga verder met het extraheren van cross-linking glycanen met 500 µL 4 M natriumhydroxide met 0,1% natriumhydride. Bewaar de supernatanten die de cross-linking glycanen bevatten bij 4 °C, volgens het eerder beschreven extractieproces. Was de pellets tweemaal met gedeïoniseerd water.Gebruik vervolgens 500 µL Cain om residuele polymeren zoals cellulose te extraheren en centrifugeer de supernatanten die de geëxtraheerde celwandpolymeren bevatten om eventuele vaste bestanddelen te verwijderen. Breng daarna 50 µL van elk monster over in een polypropyleen 384-well microtiterplaat volgens een vooraf ontworpen aangepaste lay-out, waarbij de monsters zijn gerangschikt op weefseltype en extractietype.Verdun vervolgens de celwandpolymeer-monsters met gedeïoniseerd water om seriële verdunningen van nul, vijf en 25 keer voor te bereiden. Stel parameters in voor de microarray, zoals pinhoogte, collectie, verblijftijd en wasstappen. Houd de luchtvochtigheid van de printkamer op 60% om verdamping van de monsters te voorkomen.Start nu met het printen. De robot gebruikt capillaire kanaalspoelden om oplossingen van de monsterplaat te printen op een nitrocellulosemembraan dat aan een vlakke plaat in de machine is bevestigd. Elke spot op de array bevat 15 nanoliters oplossing en wordt in triplikaat geprint.Print identieke microarrays naast elkaar op het membraan en snijd deze in individuele arrays. Om aspecifieke binding te verminderen, wordt elke microarray gedurende twee uur bij kamertemperatuur geblokkeerd in een oplossing van 5% magere melkpoeder.Voeg de monoklonale antilichamen toe die specifiek zijn voor celwandglycaan-epitopen en laat deze twee uur incuberen. Was de microarrays vervolgens drie keer gedurende vijf minuten in PBS om aspecifieke binding te verwijderen. Probeer de microarrays daarna twee uur lang met een secundair antilichaam geconjugeerd aan peroxidase uit mierikruid, na drie wasbeurten van vijf minuten in PBS.Ontwikkel de microarrays met chromogene of chemiluminescente substraten. Scan de afzonderlijke microarrays met een desktopscanner met een hoge resolutie. Sla de afbeeldingen op als negatieve 16-bit TIFF-bestanden.Bereken de integrale intensiteit van elke spot met behulp van explore-beeldverwerkingssoftware die is uitgerust met een geautomatiseerde gridtool. Exporteer vervolgens de gridgegevens voor elke microarray als een tekstbestand. Importeer het gegevensbestand handmatig in een Excel-spreadsheet voor analyse.Bereken het gemiddelde van de integrale spotintensiteit over de printreplicaten en verdunningen om een gemiddelde spotintensiteitswaarde voor elk monster te verkrijgen. Zet de relatieve gemiddelde spotintensiteiten tussen verschillende monsters uit als een heatmap met behulp van voorwaardelijke opmaak in Excel of een online heatmap-tool. Gebruik tools om het achtergrondsignaal en fout-positieven voor elk antilichaamtype te verwijderen, corrigeer de gegevens naar 100 en stel een afkapwaarde van 5% in.Uitgebreide microarray-polymeerprofilering werd gebruikt om de relatieve overvloed van glycanen in zes weefseltypen te meten: helmdraden, pollen, ovaria, kroonbladen, kelkbladen en het stigma van Nicotiana. De microarray werd gesondeerd met het monoklonale antilichaam JIM5, dat specifiek is voor een epitoop op pectische polysachariden. Let op: het JIM5-epitoop wordt gedetecteerd in CDTA-extracten van alle bloemweefsels.Het is echter het hoogst in pollen en het laagst in stempelweefsel. Interessant genoeg wordt het JIM five-epitoop ook gedetecteerd in de natriumhydroxide-extracten van pollen, maar niet in die van andere weefsels. Kwantitatieve informatie wordt verkregen door standaardcurves te genereren van de verschillende gezuiverde polysachariden die als interne standaarden op de microarray in eierstokweefsel werden verwerkt.In elk monster was ongeveer 157 microgram hoog aanwezig dat het JIM five-epitoop bevatte, wat overeenkomt met ongeveer 1,5% van de totale celwandresiduen, terwijl in pollenweefsel 625 microgram hoog Ronin aanwezig was dat het JIM five-epitoop bevatte, wat overeenkomt met ongeveer 6,25% van het totale celwandresidu. De relatieve abundantie van 15 glycaanepitopen in alle weefseltypen is samengevat als een heat map. De intensiteit van de kleurbalken is proportioneel aan de gecorrigeerde gemiddelde spotintensiteit voor elk monster.Een visuele weergave van deze gegevens maakt een snelle interpretatie mogelijk van de verschillen in het voorkomen van glycaanepitopen tussen de verschillende bloemweefsels. Deze resultaten geven aan dat individuele glycaanepitopen uniek verdeeld zijn over verschillende bloemtypen. Zo is het LM 13-epitoop bijvoorbeeld het meest overvloedig aanwezig in anthrop-filamenten en SE L-weefsels in vergelijking met andere weefsels.Dit patroon staat in schril contrast met dat van kortere keten epitopen die bij voorkeur worden gedetecteerd door MAB LM six. Cross-linking glycanen vertonen daarnaast verschillende voorkomingspatronen in diverse bloemen. Zo is het LM 10 epitoop overvloedig aanwezig in stempelweefsel vergeleken met andere weefsels, maar ontbreekt het in het weefsel van de vruchtbeginsel.De LM 15 xog glycaan-epitopen komen het sterkst voor in het bloemblad en de helmdraad in vergelijking met andere weefsels, terwijl hetero-mannanen het sterkst aanwezig zijn in de helmdraden. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het extraheren en bepalen van de relatieve abundantie van celwandglycanen in een breed scala aan planten en weefseltypes. Zodra men het gebruik van microarrays onder de knie heeft, kan deze techniek in drie dagen worden voltooid.Het is belangrijk om eraan te denken dat monsters en replica's bij elke stap van deze procedure consistent worden behandeld. Andere methoden, zoals azijnzuur-salpeterzuurassays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld: wat is de absolute cellulosehouding die overblijft na sequentiële extractie van pectinen en cons glycans met behulp van CDTA en natriumhydroxide?Deze techniek heeft een brede toepasbaarheid binnen de plantencelbiologie om snel het voorkomen van glycaten te vergelijken in modelplanten zoals Arabidopsis en Fisca, Nutella, alsook in andere planten zoals katoen, tarwe, eucalyptus en tabak.

glycan-profiling-of-plant-cell-wall-polymers-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Plantaardige biomassa is een belangrijke koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof die gebruikt kunnen worden voor de productie van biobrandstoffen. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een structureel complex composietmateriaal genoemd lignocellulose. Hier beschrijven we een protocol voor een uitgebreide analyse van de inhoud en de samenstelling van de muur afgeleid koolhydraten.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel II: Koolhydraten

Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

Kristalline cellulose is een belangrijk bestanddeel van de plantencelwand. De kwantificering ervan op cellulair niveau is echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we het gebruik van gepolariseerd lichttechnologie en worteldoorsneden om informatie te verkrijgen over de samenstelling van de celwand met een spatie-temporelle resolutie.

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van het reducerende einde (RE) en de interne glycosylsequenties van heteroxylanen door het RE te labelen met 2-aminobenzamide voorafgaand aan enzymatische (endoxylanase) hydrolyse en vervolgens analyse van de resulterende oligosacchariden met behulp van massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR).

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

Een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden door elektroforese van het gel (PACE), met behulp van mannan als voorbeeld is beschreven.

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Beschrijven we een eenvoudige en snelle methode voor de voorbereiding en analyse van N- glycanen van verschillende cultivars van radijs (Raphanus sativus).

Analyse van N- glycanen Raphanus sativus Cultivars met behulp van PNGase H+

Een protocol voor het voorbereiden van 13C,15N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia's. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.

Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Leer glycaanprofilering van plantencelwandpolymeren met CoMPP-microarrays en monoklonale antilichamen. Deze methode maakt snelle, hoogdoorvoeranalyse van glycaansamenstelling in diverse plantenweefsels mogelijk.

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Meer video's verkennen