Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

Het algemene doel van deze procedure is om een flexibele methode te demonstreren voor het herontwerpen van virale oppervlakken via clickchemie. In de eerste stap van deze procedure worden menselijke embryonale niercellen geïnfecteerd met adenovirus type vijf en geïncubeerd in de aanwezigheid van ofwel het onnatuurlijke aminozuur homoalanine of de aceto-suiker parasite N-acetoacetylglucosamine. Na twee dagen worden de azide-gelabelde adenovirusdeeltjes geoogst en gezuiverd.

Vervolgens wordt de chemospecifieke azid-alkyn-cycloadditie gebruikt om fluorescente probes aan het oppervlak van deze deeltjes te koppelen. Zoals uitgelegd in het schriftelijke protocol, wordt dit uitgevoerd met een van de twee mogelijke ligatiemethoden: spanningsgepromoveerde of kopergekatalyseerde azid-alkyn-cycloadditie.

Bij therapeutische toepassingen kunnen deze koppelingen bestaan uit polypeptidepolymeren of kleine moleculen. In dit experiment wordt een fluorescerende probe gebruikt, zodat de ligatie van de probe op capside-eiwitten via SDS-PAGE kan worden aangetoond. Er is grote belangstelling voor de ontwikkeling van virussen als dragers voor genoverdracht, in het bijzonder in de context van therapeutica, gentherapie, oncologische therapie en vaccintechnologie.

In die context is het afstemmen van de interface tussen virus en gastheer bijzonder belangrijk om de juiste eigenschappen te verkrijgen voor die therapeutische weefseltargeting van immuunstimulatie. Een aantal andere factoren is van belang bij het afstemmen van de interface tussen gastheer en virus. In dit kader hebben we een labelingsprotocol in twee stappen ontwikkeld.

De eerste stap is de metabole introductie van een onnatuurlijk aminozuur of een onnatuurlijke suiker. Hiermee wordt een ankerpunt geplaatst dat we vervolgens verder kunnen uitwerken met zeer hoogselectieve chemie, waardoor we deze virussen kunnen voorzien van vrijwel elke gewenste functionaliteit zonder de infectiviteit of de algehele fitness van het virus significant te verstoren, wat een belangrijke hindernis is om te overwinnen. Nadat de zuurkast en de laboratoriumapparatuur zijn gesteriliseerd, worden 11 cultuurschalen van 100 millimeter met HEK 293-cellen voorbereid, die worden onderhouden in HEK-groeimedium bij 37 °C.

Zodra de celcultuur 80 tot 90% confluent is, verwijdert u het groeimedium uit een van de schaaltjes en wast u deze één keer met TD-buffer. Los de cellen los met één milliliter trypsine EDTA en laat dit één minuut incuberen. Voeg negen milliliter groeimedium toe en tel het aantal geoogste cellen in dit schaaltje.

Bereken met een hemocytometer het aantal adenovirusdeeltjes dat nodig is voor infectie voor elk van de 10 overige kweekschalen. Verwijder langzaam het groeimedium en was vervolgens met vijf milliliter TD-buffer. Voeg één milliliter infectiebuffer toe en incubeer gedurende deze periode één uur.

Schud de schalen na infectie elke 15 minuten voorzichtig van zij naar zij. Voeg voorzichtig negen milliliter HEK-groeimedium toe aan elke schaal en incubeer nog eens 18 uur. Uit geconcentreerde voorraadoplossingen van een HA in Sistine.

Bereid een HA-labelingsmedium voor volgens het schriftelijke protocol. Zorg ervoor dat u deze voorraadoplossingen eerst filtert met een spuitfilter van 0,2 micrometer. Steriliseer de methionine-voorraadoplossing voor de controle op dezelfde wijze, verwijder vervolgens voorzichtig het groeimedium en was elke kweekschaal met vijf milliliter TD-buffer.

Vervang dit door 10 milliliters van een HA-labelingsmedium en incubeer de geïnfecteerde cellen nogmaals zes uur. De virale kapside-eiwitten zullen nu worden vertaald in aanwezigheid van azo homo alanine en afwezigheid van methionine. Vervang het labelingsmedium voorzichtig door 10 milliliters vers groeimedium en incubeer gedurende nog eens 18 uur.

Na voltooiing van deze stap gaat u over naar de zuiveringsprocedure in stap drie van de video. Alternatief kunnen azi-tags worden geïntroduceerd via azi-bevattende suikers in plaats van het onnatuurlijke aminozuur a HA. In dit protocol wordt een parasiet-gerelateerde n acetoacetyl galacto a metabolische precursor voor UDPN Acetoacetyl glucosamine gebruikt, gekweekt in de aanwezigheid van deze aceto-suiker.

Adenovirus type vijf vertoont azigroepen uitsluitend op de fiber om suikerlabeling mogelijk te maken. Volg eerst stap één van de video tot aan de prompt op het scherm. Dit komt overeen met stap 1,5 in het schriftelijke protocol.

Bereid de suikermarkeringsoplossing voor door eerst 100 µL van de ATO-suikerstockoplossing in Falcon-buisjes te pipetteren en de methanol te laten verdampen. Voeg vervolgens 100 mL HEK-groeimedium toe. Bedek de cellen in elk schaaltje met 10 mL van dit suikermarkeringsmedium en incubeer gedurende 44 uur bij 37 °C.

Ga verder naar stap drie voor de zuivering. Breng het medium samen met de geïnfecteerde cellen vanuit de kweekschaal over naar twee conische buisjes en centrifugeer 10 minuten bij 2000 G. Bij vier graden.

Verwijder het supernatant en resuspendeer elk pellet in vier milliliter TD-buffer met behulp van vloeibare stikstof in een bad van 37 °C. Voer drie vries-dooi-cycli uit om de geïnfecteerde cellen te lyseren. Meng de suspensie tussen elke cyclus met een vortex.

Centrifugeer de ontdooisuspensie bij 2000 G gedurende 10 minuten om het celdebris neer te slaan; aangezien het adenovirus dat voor infectie in stap één is gebruikt een GFP-transgen bevatte, bevestigt fluorescentieactiviteit in deze stap de transductie en expressie van viraal DNA. Bereid zorgvuldig een cesiumchloride-dichtheidsgradiënt voor van 1,25 gram per milliliter tot 1,4 gram per milliliter. Pipetteer het supernatant van de gelyseerde cellen op de dichtheidsgradiënt en centrifugeer bij 126.000 G gedurende één uur bij 15 graden Celsius.

Na centrifugatie moet er een dikke, brede band in de centrifugebuis aanwezig zijn. Dit is het azi-gemodificeerde virus. Prik met een star L-naald in de bodem van de buis zodat de inhoud druppelsgewijs uitstroomt en verzamel dit virus voorzichtig.

Banden van de twee ligatiemethoden demonstreerden de spanning. De route via spanningspromotie hanteert eenvoudigere reactiecondities, maar heeft als nadeel een beperktere selectie van commercieel beschikbare probes om spanningsgepromoteerde ligatie uit te voeren. Meng 50 µL azide-gemodificeerd virus in virusopslagbuffer met 0,25 µL Tamara BCN-labelingsoplossing door tegen de onderkant van de buis te tikken, bedek deze met folie en laat het gedurende de nacht roteren bij kamertemperatuur.

Purificeer het click-virus met behulp van centris sub gelfiltratie. Eveneer de spinzuilen met virusbewaarbuffer. De zuurstofvrije koper(I)-gekatalyseerde cycloadditie biedt een grotere beschikbaarheid van probes, maar heeft als nadeel dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is om een zuurstofvrije atmosfeer te handhaven.

Om de kopergekatalyseerde ligatie uit te voeren: ontzuurstof eerst alle reactiematerialen en oplossingen gedurende zes uur in een stikstofhandschoenenkast. Bereid na deze periode de koper(I)-katalysatorstokoplossing in de handschoenenkast voor om de reactie te starten. Voeg 1 µL van deze koperstokoplossing toe aan een 50 µL oplossing van de virussonde en het chelaatvormer.

Laat de labelingsreactie een nacht lang doorgaan in de glove bag. Zuiver de acept-filtratie zoals in stap vier. Na het koken, gezuiverd, geklikt virus en laly-monsterbuffer gedurende 10 minuten.

Vul de putjes met het geselecteerde virus en de controles en voer de elektroforese uit. Houd de tank bedekt met folie om de fluorescente probe tegen licht te beschermen. Gebruik na één uur een fluorescente gelscanner om de gel te scannen.

Let op dat intacte of niet-azi-gelabelde virussen geen significante fluorescente labeling zouden mogen verdringen voor een HA labeling; de virussen geproduceerd in een hogere concentratie van een HA vertonen een sterkere fluorescente labeling vanwege een hogere graad van HA-incorporatie. Merk daarnaast op dat het suiker-gelabelde virus azi-tags alleen tot expressie brengt in het fiber-capside-eiwit. Uitgaande van 80% confluentie, moet rekening worden gehouden met twee dagen voor infectie en azi-labeling, vijf uur voor het oogsten en zuiveren van het gelabelde virus, één nacht voor de click-reactie en twee uur voor de SDS-PAGE-analyse, wat neerkomt op een totaal van drie en een half dag. Samenvattend zijn twee typen azi-labelingsmethoden en twee azido-alkyn click-chemie reacties gedemonstreerd.

Uw toepassing en beschikbare middelen moeten bepalen welke methode of methoden het beste geschikt zijn voor uw doel. Hoewel alle materialen in dit protocol commercieel verkrijgbaar zijn, hebben wij vastgesteld dat het synthetiseren van HA-aceto-suikers en INE-probes aanzienlijk kosteneffectiever is en een grotere flexibiliteit biedt bij modificaties van het virusoppervlak.