Name: Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Leer hoe je adenovirusoppervlakken chemoselectief kunt modificeren via bioorthogonale klikchemie met azidegroepen en fluorescentieprobes. Deze methode verbetert gerichte gentherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen de NSF voor financiering (cbet-0846259) erkennen.

Zie tabel 1 voor de bereiding van alle media, buffers en oplossingen die in dit protocol. 1. Productie van Aha-gelabelde adenovirus <ol><li> Bereid elf 100 mm weefselkweekschalen menselijke embryonale niercellen (HEK 293) gehandhaafd HEK293 cellen groeimedium (zie tabel 1) bij 37 ° C tot het bereiken 80 - 90% confluentie. (Opmerking:. Cultures met confluentie dan 90% kan moeilijk te infecteren en mogelijk niet virussen gewenst) </li><li> Draai de cellen in een van de schotels door eerst het groeimedium spoelen eenmaal met 5 ml buffer TD vervolgens de cellen te incuberen gedurende een min in 1 ml trypsine-EDTA (1 x). </li><li> Voeg 9 ml van HEK293 cellen groeimedium en gebruikt een hemocytometer het aantal geoogste HEK293 cellen tellen van de schotel. Dit nummer de hoeveelheid adenovirus type 5 (Ad5) vereist voor infectie berekenen volgens een multiplicity van infectie (MOI) 10 pfu / cel. Rekening met het feit dat voor normale Ad5 de infectiviteit index (verhouding van infectieuze deeltjes tot het totale aantal deeltjes) typisch 1:20. </li><li> Bereid 10 ml infectie buffer. </li><li> Verwijder langzaam de HEK 293 celgroei medium uit de tien overgebleven cultuur gerechten, daarna wassen met 5 ml van TD buffer. Voeg 1 ml buffer infectie elke schaal en incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Tijdens deze infectie periode, schud elke cultuur schotel kant naar de andere op 15-min intervallen. </li><li> Na infectie, voeg 9 ml verse HEK293 cellen groeimedium en incuberen bij 37 ° C gedurende 18 uur. </li><li> Bereid 100 ml Aha etikettering medium (of Met controle medium voor de controle). Zorg ervoor dat de geconcentreerde stamoplossing te filteren met een 0,2-um steriele spuit filter voor de voorbereiding van de etikettering media. </li><li> Voorzichtig (om niet weg te wassen van de geïnfecteerde cellen) te verwijderen van de HEK 293 cellen groeimedium na 18 uur eennd wassen elke cultuur schotel met 5 ml van TD buffer. </li><li> Verwijder de TD buffer wasoplossing en voeg 10 ml van Aha etikettering medium om elke cultuur gerecht. Voor een controle, moet methionine controle medium in plaats van de Aha etikettering medium gebruikt worden bij deze stap. </li><li> Incubeer de geïnfecteerde cellen labelen medium bij 37 ° C gedurende 6 uur. Labeling kan worden uitgevoerd elk tussen 12 - 24 uur na infectie maar niet langer dan 6 uur duren. Dit interval is vastgesteld om overlappingen te maximaliseren met virale structurele eiwitten vertaling en tegelijkertijd besmettelijkheid is niet significant verminderd. 7 </li><li> Verwijder voorzichtig het etiket medium om te voorkomen dat de cellen verstoren. Voeg 10 ml vers HEK293 cellen groeimedium elke schotel en incuberen van de cellen bij 37 ° C gedurende nog eens 18 uur. Om verlies van geïnfecteerde cellen te minimaliseren deze stap is niet noodzakelijk etikettering oplossing volledig verwijderen. De HEK 293 cellen groeimedium bevat een overmaat van Met die wegconcurreren resten Aha. </li><li> Ga verder met stap 3 voor zuivering. </li></ol> 2. Productie van azido-Sugar-gelabelde adenovirus <ol><li> Volg de procedure met de titel De productie van Aha-label Adenovirus tot en met stap 1.5. </li><li> Bereid 100 ml azido-suiker etikettering medium. </li><li> Bedek de cellen met 10 ml verse azido-suiker labeling medium en incuberen bij 37 ° C voor 44 uur. </li></ol> 3. Zuivering van azide-gelabeld Adenovirale Particles <ol><li> Verwijder het medium met de geïnfecteerde cellen per kweekschaal en transfer naar conisch. Centrifugeer bij 2.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in buffer TD (met behulp van 8 ml van de TD-buffer per 10 gerechten). </li><li> Lyseren de geïnfecteerde cellen door herhaalde (3 of meer) vries-ontdooi cycli met een dewarvat vloeibare stikstof en 37 ° C waterbad. Centrifugeer bij 2.000 g gedurende 10 minbij 4 ° C celresten te scheiden van de supernatant. </li><li> Maak een CsCl dichtheidsgradiënt centrifugebuis door eerst pipetteren 2,5 ml van 1,25 g / ml CsCl oplossing in een Ultra Clear centrifugebuis. Vervolgens gebruikt een pipet met de punt aan de onderkant van de buis langzaam toevoegen van 2,0 ml 1,4 g / ml CsCl oplossing te vermijden dat de gradiënt-interface verstoren. </li><li> Pipetteer het supernatans van stap 3.2 bovenop de CsCl dichtheidsgradient buis en eventueel toevoegen TD buffer aan de buis vullen. Centrifugeer de monsters in een zwaaiende emmer rotor op 125.000 g gedurende 1 uur bij 15 ° C in een ultracentrifuge. </li><li> Na voltooiing van ultracentrifugatie moet de virusdeeltjes zichtbaar als een dikke band op het grensvlak van de twee CsCl oplossingen. Een kleine perforatie in de bodem van de buis met een steriele naald om de oplossing kan afvloeien toegedruppeld. </li><li> Verzamel de dikke witte band, moet bevatten de gelabelde Ad5 deeltjes, taking zorg overmaat CsCl oplossing sluiten. Voorkom verzamelen cellulaire eiwitten die band boven het virus laag. Bovendien sluiten lege virion capsiden waarbij een lichtere laag iets boven de dikke witte virus band op te richten. </li><li> Optioneel, een laatste zuivering op het label Ad5 deeltjes. Voeg de verzamelde fractie van stap 3,6 tot 4 ml ultracentrifuge buis vullen van de buis met 1,35 g / ml CsCl oplossing. Centrifugeer op 125.000 g gedurende 18 uur bij 15 ° C en het verzamelen van de dikke witte band die vormt in het midden van de buis zoals beschreven in stap 3.5 en 3.6. (Als de virale titer laag is, witte band niet zichtbaar na de tweede centrifugatie en het niet mogelijk met de gelabelde virus terug). </li><li> Voor de opslag van de virusdeeltjes gedurende lange tijd moet dialyse van de verzamelde virus extract worden uitgevoerd ten opzichte virus opslagbuffer. Bewaar de gedialyseerd virus monsters bij -80 ° C. </li></ol> 4. Liplichting van gemodificeerde Adenovirale Deeltjes met Acetyleenalkoholen Probes Met behulp van Stam-Gepromoveerd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) <ol><li> Aan een oplossing van 50 pi van azide gemodificeerde Ad5 in opslagbuffer virus, voeg 0,25 pl SPAAC labelingoplossing. (Zie de tabel van reagentia voor een lijst van venders van commercieel beschikbare gespannen alkynen). </li><li> Laat de stam-bevorderd cycloadditiereactie om &#39;s nachts te gaan bij kamertemperatuur. Als een lichtgevoelige sensor (bijvoorbeeld TAMRA) wordt gebruikt, omvatten het reactievat met aluminiumfolie. </li><li> Zuiver het gemerkte virus volgens stap 6. </li></ol> 5. Ligatie van gemodificeerde Adenovirale Deeltjes met Acetyleenalkoholen Probes het gebruik van koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) in zuurstofarme atmosfeer <ol><li> Plaats 7,2 mg koper (I) bromide (CuBr) poeder in een Eppendorf buis met aluminiumfolie. </li><li> Pipet 1 ml van DMSO in een tweede eppendorfbuisje. </li><li> Bereiden50 pi CuAAC labelingoplossing in een derde eppendorfbuisje. Dek af met aluminiumfolie als de alkyn sonde is licht-gevoelig zijn (bijvoorbeeld TAMRA-alkyn). </li><li> Plaats de drie Eppendorf-buisjes, de afgetopte, in een zuurstofarme handschoen tas voor 6 uur. Alle monsters moeten blijven binnen de handschoen zak tot aan de voltooiing van de CuAAC reactie. </li><li> Bereid een 50 x voorraadoplossing van CuBr door 1 ml DMSO 7,2 mg CuBr poeder, die beide zijn gedeoxygeneerd volgens stap 5.4. </li><li> Start de CuAAC reactie van pipetteren 1 pi van dit CuBr stockoplossing 50 pi CuAAC labelingoplossing, die is gedeoxygeneerd volgens stap 5.4. Laat de reactie te laten verlopen voor 12 uur binnen in de handschoen zak. </li><li> Zuiver het gemerkte virus volgens stap 6. </li></ol> 6. Zuivering en opslag van gelabelde virusdeeltjes <ol><li> Zuiver het gemerkte virus monsters met behulp van Centri-sep gelfiltratie spin-columns evenwicht gebracht met Virus opslagbuffer, volgens de richtlijnen van de fabrikant. </li><li> Als alternatief kan zuivering uitgevoerd door dialyse tegen Virus opslagbuffer. </li><li> De gelabelde virusdeeltjes moeten worden bewaard bij -80 ° C. </li></ol> 7. SDS-PAGE van gelabelde adenovirus en TL-Gel Scanning <ol><li> Voeg 20 pi Laemmli monsterbuffer (2x) en 20 pi van gezuiverd gelabeld virus en kook gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden aan een onoplosbare precipitaten te verwijderen. Als resterende koper aanwezig na zuivering kan koken monster resulteert in dikke stroken eiwit op de SDS-PAGE gel, waardoor moeilijkheden tijdens weergave. In dit geval, afgezien koken van het monster in deze stap. </li><li> Sluit de gel cassette de elektroforesecel en voeg loopbuffer. Plaats het vereiste aantal putjes met het virale eiwit monsters. Gebruik een goed te pre-stai te ladenned molecuulgewichtmerkers. Laat de gel gedurende 1 uur bij 200 V. houden de elektroforesecel met aluminiumfolie gedurende de gehele periode te verminderen fotobleken van de fluorofoor label. </li><li> Voor de beste resolutie en alle gratis fluorofoor te verwijderen, laat de tracking kleurstof te raken van de gel tijdens de elektroforese. Stop de elektroforese en snel de gel over te dragen aan een tl-gel scanner en scan de gel voor fluorescentie-emissie op de juiste golflengte (574 nm voor TAMRA). </li><li> Het aantal kleurstofmoleculen geconjugeerd aan elke virusdeeltje kunnen worden gekwantificeerd door het meten van de fluorescentie van verschillende standaard TAMRA concentraties en vergelijking met het monster bij stap 7.3. </li></ol> 8. Representatieve resultaten De waargenomen resultaten van SDS-PAGE en fluorescerende gel scannen TAMRA-geconjugeerde Ad5 worden getoond in Figuur 3. Hoewel deze fluorescerende gel scans werden uitgevoerd op monsters modigeschied via CuAAC, moeten de resultaten vergelijkbaar zijn als probes geligeerd via SPAAC. Deze gel scans blijkt dat Ha kenmerken leidt wijziging van de drie Ad5 capside eiwitten (Hexon, Penton en Fiber), terwijl suiker kenmerken wijzigt alleen Fiber capside-eiwit. Bovendien kan een toename in Aha concentratie (4 mM tegenover 32 mM) resulteert in een grotere mate van Aha verwerking, maar ook is aangetoond dat infectiviteit verlagen. Voorafgaande resultaten 7 blijkt dat Ad5 geproduceerd 4mM Ha, ongeveer 5% van blootgesteld methionine sites TAMRA gemodificeerde met dit aantal verhogen tot 10% bij 32 mM Aha gebruikt. Dit komt overeen met ongeveer 280 en 510 respectievelijk kleurstof-gelabelde plaatsen per Ad5 deeltje. Analyse van de suiker-etikettering 1 heeft aangegeven dat ongeveer 22 van de 36 glycosylatieplaatsen op Ad5 worden bezet door een azido suiker en vervolgens voorzien van TAMRA. Als tien weefselkweek platen worden gebruikt voor het azide-gemodificeerde Ad5 te produceren, zoals beschreven<html> in dit protocol 200 - moet 300 pi azide gemodificeerde virus te verkrijgen van de witte band verzameld in stap 3,6, met een titer van ongeveer 1,5 x 10 12 deeltjes / ml. Een veel voorkomend probleem van deze procedure is de afwezigheid van een virale band in deze zuiveringsstap die kan worden toegeschreven aan een lage virale titer. Dit is meestal een gevolg van het infecteren cellen die ofwel over-of onder-confluent, of door het wegwassen van cellen - die raken los van de plaat na de infectie - tijdens het spoelen tijdens stap 1. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Protocol overzicht. Azide-houdende Aha of GalNAz voor het eerst wordt opgenomen in adenovirus deeltjes. Ligatie met een fluorescerende alkyn probe wordt vervolgens uitgevoerd via &quot;click&quot; chemie. Tenslotte wordt SDS-PAGE gebruikt ligatie van de fluorescerende tonen. IGUUR 2 &quot;/&gt; Figuur 2. Ligatie van alkyn probe op azide gemodificeerde virus via (a) SPAAC, (b) CuAAC onder de-zuurstof en (c) zuurstof atmosfeer. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Fluorescent scans van SDS-PAGE van azide gelabelde adenovirus type 5 (Ad5) na conjugatie met CuAAC TAMRA-alkyn. (A) Aha gelabelde Ad5 met twee concentraties Aha. Labeling blijkt plaats te vinden op adenovirus Hexon, penton en Fiber capside-eiwitten, met de mate van labeling toeneemt met toenemende concentratie Aha. (B) Ac 4 GalNAz gelabelde adenovirus lijkt worden voorzien alleen de fiber capside-eiwit. <table border="1"><tbody><tr><td> Oplossing </td><td> Voorbereiding </td><td> Opmerkingen </td></tr><tr><td> Ad5 opslagbuffer </td><td> 5 mM Tris-HCl buffer (pH 8,0) die 0,5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 25% (v / v) glycerol en 0,05% (w / v) Bovine Serum Albumine (BSA) </td><td> Bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Ad5 infectie buffer </td><td> 2% (v / v) bovine kalfserum, 1 x TC oplossing Ad5 in opslagbuffer (volume bepaald met een moi van 10 pfu / cel en een infectiviteit index van 1:20). Breng de oplossing aan het uiteindelijke volume met behulp van TD-buffer </td><td> Ad5 concentratie worden bepaald door UV-absorptie. </td></tr><tr><td> TC-oplossing (200 ×) </td><td> 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> TD buffer </td><td> 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4 en 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293 cellen groeimedium </td><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v / v) bovine kalfsserum (BCS) en 1% (v / v) Pen Strep </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Cys-stamoplossing (100 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 200 mM L-Cysteine </td><td> Bereid verse en filter met een 0,2-um steriele spuit filter voor gebruik. </td></tr><tr><td> Aha stockoplossing (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 100 mM L-Azidohomoalanine </td><td> Bereid verse en filter met een 0,2-um steriele spuit filter voor gebruik. </td></tr><tr><td> Aha etikettering medium </td><td> DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 10% BCS, Aha stockoplossing (1 ×), 2 mM L-cysteïne </td><td> Bereid voor gebruik. Dit komt overeen met 4 mM concentration van Aha, hoewel de verschillende concentraties kunnen worden gebruikt (zie representatieve resultaten). </td></tr><tr><td> Met stockoplossing (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 100 mM L-Methionine </td><td> Bereid verse en filter met een 0,2-um steriele spuit filter voor gebruik. </td></tr><tr><td> Met controlemedium </td><td> DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 10% BCS Met stock oplossing (1 x), 2 mM L-Cysteine </td><td> Bereid voor gebruik. </td></tr><tr><td> AC 4 GalNAz stockoplossing (1.000 ×) </td><td> 50 mM peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) in methanol </td><td> Bewaar bij 4 ° C. AC 4 GalNAz is een metabole voorloper van GlcNAz. </td></tr><tr><td> Azido-suiker etikettering medium </td><td> 100 pi AC 4 GalNAz stockoplossing, 100 ml HEK 293 cellen groeimedium </td><td> Laat methanol vóór verdampen aan het toevoegen van HEK 293 celgroei medium. </td></tr><tr><td> Cesiumchloride oplossingen </td><td> CsCl opgelost in TD buffer: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H2O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H2O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H2O) </td><td> Dichtheidsgradiënten voor ultracentrifugatie </td></tr><tr><td> Virus opslagbuffer </td><td> Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2, die 0,5 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2, en 10% (v / v) glycerol </td><td> Bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) labelingoplossing </td><td> TAMRA-BCN in DMSO: <ol><li> Gebruik UV-absorbance (OD 260 Assay) de titer van het virus oplossing bepalen stap 4.1 </li><li> Bepaal de totale aantal virusdeeltjes de 50 pi monster (N Ad5) </li><li> De TAMRA-BCN molariteit (in M) wordt bepaald met: c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) N Avo = 6,022 × 10 23 (Zodat het reactiemengsel bereid in stap 4 100 alkyn probes per virion bevat) </li></ol></td><td> Strain-bevorderd alkyn probe Voor SDS-PAGE een virale titer van ongeveer 10 12 deeltjes / ml wordt voorgesteld </td></tr><tr><td> TAMRA-alkyn (CuAAC) labelingoplossing </td><td> 50 ul van azide gemodificeerde Ad5 in opslagbuffer virus (N Ad5 bepaald zoals hierboven), 1,5 mM Batho<html> fenantroline disulfonaat (dat wil zeggen 1,5 x uiteindelijke CuBr concentratie), TAMRA-alkyn. TAMRA-alkyn molariteit (in M) wordt bepaald met: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (Zodat het reactiemengsel bereid in stap 5 100 alkyn probes per virion bevat) </td><td> Tris-buffer is bekend dat het een competitieve en remmende ligand van koper zijn. 8 </td></tr><tr><td> Laemmli monsterbuffer (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6,8) 4% (w / v) SDS 20% (v / v) glycerol, 10% (v / v) 2-mercaptoethanol, en 0,004% (w / v) broomfenolblauw </td><td></td></tr><tr><td> Running buffer </td><td> 187 mM glycine, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS in H2O </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tabel 1. Voorbereiding van de buffers en de oplossingen die nodig zijn door dit protocol.

<ol><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+%22Clickable%22+Amino+Acids+and+Sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors%3A+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li>
<li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li>
<li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+%28Ad%29+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li>
<li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Strain-Promoted+%5B3+%2B+2%5D+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De ontwikkeling van chemoselectieve en bioorthogonal klik op reacties, waaronder die van aziden, is een zich snel ontwikkelende gebied van onderzoek, en vervolgens is er een groeiend aantal van deze reacties om uit te kiezen voor bioconjugation toepassingen. We hebben de reikwijdte van dit protocol om slechts twee methoden die werden omwille van hun nut gekozen in ons eigen lab en de commerciële beschikbaarheid van alle reagentia op te nemen. In de eerste van deze route - stam-bevorderd azid...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Adenovirus type 5 (Ad5) met een GFP transgen </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Humane embryonale nier (HEK 293) cellen </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium geen Methionine geen cysteine ​​(DMEM-Met /-Cys) High Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Kalf </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicilline - Streptomycine 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% trypsine-EDTA (10 x) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm Cultuur van de Cel Dish, weefselkweek behandelde polystyreen </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Celcultuur CO 2 incubator </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bioveiligheid kast </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Steriele spuit filter (0,2 micrometer, cellulose acetaat) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0.061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE centrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Conische buizen (50 ml, steriel) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, dunwandige, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge uitgerust met een SW 41 en SW 60 ROtor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf biopur Safe-Lock Buizen, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifuge 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep gelfiltratie spin-kolommen </td><td> Princeton Scheidingen </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Steriele naald, 18 gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stikstof handschoen tas (als zuurstofarme CuAAC wordt uitgevoerd) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewarvat </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vloeibare stikstof </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektroforesecel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TL-gel-scanner </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ready Gel Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disulfonzuur (BDA) dinatriumzout </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimethyl sulfoxide (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris base (tris (hydroxymethyl) aminomethaan) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dinatrium fosfaat (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bovine serum albumine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cysteïne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-methionine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (natriumdodecylsulfaat) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Broomfenolblauw </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cesium Chloride (CSCL) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Koper (I) bromide (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Calciumchloride (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchloride (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnesium Chloride (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alkyn sonde voor CuAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Acetyleenalkoholen </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Gespannen alkyn sonde voor SPAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DiBO Acetyleenalkoholen </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Opmerkelijke leveranciers van click chemie reagentia en kits bevatten Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Scheikunde Klik op Extra en Baseclick. Een verscheidenheid aan alkyn kleurstoffen en targeting liganden zijn te vinden in deze verkopers &#39;catalogi.

chemoselectieve wijziging van viral oppervlakken via bioorthogonal klik chemie

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

De wijziging van virusdeeltjes heeft een aanzienlijk deel van de aandacht voor zijn enorme potentieel voor invloed gentherapie, oncolytische toepassingen en de ontwikkeling van vaccins. 1,2,3 huidige aanpak op de wijziging van virale oppervlakken, die meestal op basis van de genetica, vaak last van demping van het virus productie, infectiviteit en cellulaire transductie. 4,5 Met behulp van chemoselectieve klik chemie, hebben we een duidelijke alternatieve benadering, waarin deze aspecten omzeilt, terwijl de resterende zowel zeer flexibel en toegankelijk. 1,2 Het doel van dit protocol is om aan te tonen de effectiviteit van het gebruik van bioorthogonal klik chemie aan de oppervlakte van adenovirus type 5 deeltjes te wijzigen. Deze twee stappen kunnen zowel therapeutisch 1 of analytisch, 2,6 worden gebruikt als het zorgt voor chemoselectieve ligatie van targeting moleculen, kleurstoffen of andere moleculen van belang op eiwittengelabelde met azide tags. De drie grote voordelen van deze methode zijn dat (1) metabole etikettering weinig tot geen invloed op de virale fitness, 1,7 laat zien (2) een brede waaier van effector liganden kan worden gebruikt, en (3) het is opmerkelijk snel, betrouwbaar en makkelijk te bereiken. 1,2,7 In de eerste stap van deze procedure worden adenoviruspartikels geproduceerd met een azidohomoalanine (Ha een methionine surrogaat) of onnatuurlijke suiker O-gekoppelde N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide de azide (N-3) functionele groep. Na zuivering van azide gemodificeerde virus deeltjes wordt een alkyn probe met de fluorescerende TAMRA groep geligeerd in chemoselectieve wijze de pre-gemerkte eiwitten of glycoproteïnen. Tenslotte is een SDS-PAGE analyse uitgevoerd om de succesvolle ligatie van de probe aangetoond op het virale capside eiwitten. Aha opname wordt getoond aan alle virale capside-labeleiwitten (Hexon, Penton en Fiber), terwijl O-GlcNAz opname resulteert in de etikettering van Fiber alleen. In deze ontwikkelende gebied zijn er verschillende methoden voor het azide-alkyn ligatie met succes ontwikkeld, maar alleen de twee die we hebben gevonden zijn meest handige handleiding worden aangetoond - stam-bevorderd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) en koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) onder zuurstofarme atmosfeer.

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker bevatten<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. De azide groep elk is chemoselectively geligeerd via &quot;klik&quot; chemische reacties als middel van virale oppervlaktemodificatie.

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

De modificatie van virusdeeltjes heeft aanzienlijke aandacht gekregen vanwege het enorme potentieel voor het beïnvloeden van gentherapie, oncolytische ...

Het algemene doel van deze procedure is om een flexibele methode te demonstreren voor het herontwerpen van virale oppervlakken via clickchemie. In de eerste stap van deze procedure worden menselijke embryonale niercellen geïnfecteerd met adenovirus type vijf en geïncubeerd in de aanwezigheid van ofwel het onnatuurlijke aminozuur homoalanine of de aceto-suiker parasite N-acetoacetylglucosamine. Na twee dagen worden de azide-gelabelde adenovirusdeeltjes geoogst en gezuiverd.Vervolgens wordt de chemospecifieke azid-alkyn-cycloadditie gebruikt om fluorescente probes aan het oppervlak van deze deeltjes te koppelen. Zoals uitgelegd in het schriftelijke protocol, wordt dit uitgevoerd met een van de twee mogelijke ligatiemethoden: spanningsgepromoveerde of kopergekatalyseerde azid-alkyn-cycloadditie.Bij therapeutische toepassingen kunnen deze koppelingen bestaan uit polypeptidepolymeren of kleine moleculen. In dit experiment wordt een fluorescerende probe gebruikt, zodat de ligatie van de probe op capside-eiwitten via SDS-PAGE kan worden aangetoond. Er is grote belangstelling voor de ontwikkeling van virussen als dragers voor genoverdracht, in het bijzonder in de context van therapeutica,

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Deze methode beschrijft het gebruik van klikchemie op veranderingen in gastheercel transcriptie meten na infectie met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12. De resultaten kunnen worden gevisualiseerd kwalitatief via fluorescentie microscopie of verkregen kwantitatief via flowcytometrie. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met andere virussen.

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

We hebben de Eiwitmantel proteïne van hepatitis E virus ontworpen als een theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP assembleert zelf in een stabiele icosahedrale kooi in mucosale levering. Hier beschrijven we de wijziging van de HEVNPs voor tumor gericht op door muteert residuen oppervlak-blootgesteld aan cysteines, die conjugaat van synthetische liganden die specifiek tumorcellen binden.

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Hier presenteren we een procedure fluorescently functionalize de disulfides op Qβ VLP met dibromomaleimide. We beschrijven Qβ meningsuiting en zuivering, de synthese van dibromomaleimide-matiemaatschappij moleculen en de vervoeging reactie tussen dibromomaleimide en Qβ. Het resulterende gele fluorescerende geconjugeerd deeltje kan worden gebruikt als een fluorescentie sonde binnen cellen.

Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken

Het protocol hier beschreven kan onderzoekers specifiek adenovirus capsids op geselecteerde locaties wijzigen door eenvoudige chemie. Afgeschermde adenovirus vectoren deeltjes retargeted gene transfer vectoren kunnen worden gegenereerd en vector-gastheer interacties kunnen worden bestudeerd.

Gecombineerde genetische en chemische Eiwitmantel wijzigingen van genenoverdracht Adenovirus gebaseerde vectoren voor afscherming en Targeting

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de synthese en meting van de fotochemische eigenschappen van modulaire gekooide verbindingen met aanklikbare delen.

Ontwerp, synthese en fotochemische eigenschappen van aanklikbare gekooide verbindingen

De studie van vetacylatatie heeft belangrijke implicaties in cellulaire eiwitinteracties en ziekten. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd om de detectie van vet-geacyleerde eiwitten te verbeteren, die kunnen worden toegepast in verschillende celtypen en gecombineerd met andere testen, waaronder pulsachtervolging en massaspectrometrie.

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Hier stellen we een eenvoudig protocol voor dat metabole oligosacharide-engineering, klikchemie en expansiemicroscopie combineert en dat bioimaging van intracellulaire gesialyleerde N-glycoproteïnen met verbeterde resolutie mogelijk maakt met behulp van routinematige microscopieapparatuur.

Visualisatie van intracellulaire sialylering met klikchemie en expansiemicroscopie

Leer hoe je adenovirusoppervlakken chemoselectief kunt modificeren via bioorthogonale klikchemie met azidegroepen en fluorescentieprobes. Deze methode verbetert gerichte gentherapie.

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

Meer video's verkennen