Name: High Throughput Sequentiële ELISA voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-Host ziekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer een high throughput sequentiële ELISA-methode voor biomarker-validatie bij acute graft-versus-host ziekte. Deze techniek minimaliseert bevriezen/ontdooien cycli en bespaart waardevol plasma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door NIH subsidie ​​RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​de Hartwell Foundation, en de Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny is een onderzoeker van de Eric Hartwell fonds en de Amy Strelzer Manasevit Research Program.

1. Experiment Dag 0: Monstervoorbereiding en ELISA Test Plaat Coating met Capture Antilichaam voor IL-2Ra, REG3α en HGF <ol><li> Plasma hoeveelheid te analyseren monsters worden getrokken, ontdooid en gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 10 min om de stolsels scheiden onderaan en bovenaan lipiden uit het plasma. 150 pi van onverdund plasma wordt van elk monster uitgeplaat op een 96-well V-bodem plaat (source plaat) door handmatige pipetteren volgens vooraf bepaalde kaarten. De monsters worden verpakt in parafilm en bewaard in een vochtige kamer bij 4 ° C gedurende het gehele proces, niet langer dan 72 uur. </li><li> IL-2Ra en HGF invangantilichamen wordt opgelost en verdund per fabrikantspecificatie en 50 ul wordt uitgeplaat in elk putje van de respectieve 96-well hoge binding half-well platen, die vervolgens worden afgedicht en overnacht geïncubeerd bij 4 ° C. Ook kunnen vele platen worden gedroogd bij 37 ° C en opgeslagen bij 4 ° C voor later gebruik, afhankelijkIng op de stabiliteit van het eiwit. </li><li> REG3α invangantilichaam wordt verdund volgens fabrikant protocol gebruikt fabrikant coating buffer en 25 pi worden uitgeplaat in elk putje van een 384 putjes Nunc Maxi-SORP plaat die vervolgens wordt afgesloten en een nacht geïncubeerd bij 4 ° C. </li></ol> 2. Experiment Dag 1: IL-2Ra ELISA (figuur 1) <ol><li> De IL-2Ra testplaat wordt gewassen, geblokkeerd met BLOTTO in TBS en de standaard wordt opgelost en een 8-punts standaard curve wordt bereid per fabrikant protocol. </li><li> Na wassen van de plaat na de blokkeringsstap wordt 50 pi onverdund plasma uitgeplaat in tweevoud van de bron plaat aan de ELISA plaat, en 50 pi van elk van de uitgeplaat in tweevoud. De plaat wordt afgedicht en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rotator plaat ingesteld op 300 rpm. </li><li> Het plasma wordt teruggewonnen uit de IL-2Ra ELISA plaat en teruggeplaatst in het unverdund plasma bron plaat. De ELISA wordt voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd. </li></ol> 3. Experiment Dag 1: REG3α ELISA (figuur 1) <ol><li> 10 pi van onverdund plasma wordt overgebracht naar een afzonderlijk v-bodem source plaat. 90 ul van de fabrikant geleverde verdunningsbuffer toegevoegd aan elk putje om een ​​1:10 verdunning bron plaat maken. </li><li> De REG3α ELISA wordt uitgevoerd per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor 384-wells platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een bord lezer ingesteld op 450 tot 620 nm, en de gegevens worden opgeslagen en geanalyseerd. </li></ol> 4. Experiment Dag 1: Elafin en TNFR1 Test Plaat Coating met Capture Antilichaam <ol><li> Elafin en TNFR1 capture antilichamen zullen opnieuw worden samengesteld en dildeeld per fabrikantspecificatie en 50 ul wordt uitgeplaat in elk putje van de respectieve 96-well hoge binding half-well platen, die vervolgens worden afgedicht en overnacht geïncubeerd bij kamertemperatuur Elafin en bij 4 ° C gedurende TNFR1. </li></ol> 5. Experiment Dag 1-2: HGF ELISA (figuur 1) <ol><li> Na de IL-2Ra ELISA en verzekeren de test niet te worden herhaald, wordt 60 pl onverdund plasma overgebracht naar een nieuwe bron plaat en dan 60 pi 1% BSA in 1 x PBS wordt aan elk putje toegevoegd om te verdunning 1:2 plasmabron plaat. </li><li> De HGF testplaat wordt gewassen, geblokkeerd met BLOTTO in TBS en de standaard wordt opgelost en een 8-punts standaard curve wordt bereid per fabrikant protocol. </li><li> Na wassen van de plaat na de blokkeringsstap wordt 50 pl van 1:2 verdunde plasma uitgeplaat in tweevoud op de ELISA plaat, en 50 pi van elk van de uitgeplaat in tweevoud. De plaat wordt afgesloten enovernacht geïncubeerd bij kamertemperatuur op een rotator plaat ingesteld op 300 RPM. </li><li> De verdunning 1:2 plasma wordt teruggewonnen uit de HGF ELISA-test plaat en terug geplaatst in de verdunning 1:2 plasmabron plaat. De ELISA wordt voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd. </li></ol> 6. Experiment Dag 2: Elafin ELISA <ol><li> 10 pi van onverdund plasma wordt overgebracht naar een nieuwe bron plaat en 190 pi 1% BSA in 1 x PBS wordt aan elk putje toegevoegd aan 200 ul plasma dluted 1:20 maken. </li><li> De Elafin ELISA uitgevoerd volgens fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd. </li></ol> 7. Experiment Day 2: ELISA TNFR1 <ol><li> 25 pi van 1% BSA in PBS toegevoegd aan de source 1:20 plaat (nu met 100 ul van 1:20 plasma) aan 125 ui van 1:25 verdund plasma verkrijgen. </li><li> De TNFR1 ELISA voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd. </li></ol> 8. Experiment Dag 2: IL-8-ELISA <ol><li> 60 pl van 1:2 verdunde plasma wordt overgebracht naar een nieuwe bron plaat en vervolgens 180 ul van IL-8 verdunningsmiddel toegevoegd aan elk putje om een ​​1:6 verdunde plasma bron plaat te maken. </li><li> De IL-8 ELISA voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen door een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm worden, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd. </li></ol> Zodra alle ELISA&#39;s zijn afgerond, unused stock plasma wordt teruggeplaatst in de ontdooide monsters en ingevroren voor toekomstig gebruik.

<ol><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li>
<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).</li>
<li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li>
<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li>
<li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li>
<li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li>
<li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines%3A+the+sequential+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li>
<li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

<html> De sequentiële ELISA methode hier gepresenteerde maakt meting van meerdere plasmaeiwitten op kleine hoeveelheden plasma die moeilijk te verkrijgen en / of onvervangbare zoals monsters uit proefpersonen met zeldzame ziekten of plasmamonsters verkregen van muizen 9,10. De sequentiële ELISA wordt typisch uitgevoerd in de volgorde van toenemende plasma verdunningsfactor met ELISA waarbij plasma verdund ≥ 1:10 doorgaans niet om worden teruggewonnen, hoewel dit kan indien gewenst. Het vermogen om sequentiële ELISA voeren wordt beperkt door ELISA kits / protocollen waarin het plasma wordt gemengd met andere reagentia of waarvoor verschillende verdunning buffers nodig zijn voor het plasma, deze sluit de ablility opnieuw een steekproef vanwege zorgen dat een incompatibele buffer / reagens interfereren met de uitvoering van een bepaalde test. Met zorgvuldige planning kan 10 of meer ELISA uitgevoerd op dezelfde plasmamonster. ent &quot;&gt; elk laboratorium wellicht plasmaverdunningen passen om interpreteerbare resultaten gebaseerd op de verwachte plasmaconcentratie van het eiwit van interesse in de monsters van de proefpersonen hebben. Verschillen in laboratoriumapparatuur kan resulteren in de noodzaak om incubatie en colorimetrische ontwikkeling te verbeteren tijden, het aantal wassingen en / of was uitzettijden om een ​​bepaalde ELISA optimaliseren. Met hoge doorvoercapaciteit en nauwkeurigheid vergroten en analyses in een kosteneffectieve wijze, het gebruik van een robot vloeistofverwerking platform kan analyse van platen met 384 putjes en een automatische plaatwasser met stapelblok aanbevolen. Deze apparatuur kan de nauwkeurigheid en juistheid van de analyse uitgevoerd door meerdere gebruikers, en hulp te bieden consistentie van analyse tot inter-en intra-assay variatie te verminderen. We gebruikten sequentiële ELISA dan beschikbaar multiplex platforms om twee redenen: 1) Het merendeel van deantilichaam paren voor nieuwe eiwitten kunnen niet gemakkelijk worden geconjugeerd aan kralen of ander materiaal, alsmede tijdrovend en duur; 2) individuele ELISA-assays zijn nauwkeuriger dan multiplex microarray of kralen, secundair aan een gebrek aan cross-reactiviteit 11. Indien er een betrouwbare methode aangetoond gemultiplext, bead-based microarrays vervullen, kan hij in staat om de sequentiële ELISA proces te vervangen, maar zijn beperkt door het vermogen om de antilichamen te conjugeren kralen en / of door het aantal gewenste eiwitten te geanalyseerd.

Acute graft-versus-host disease (GVHD), een belangrijke oorzaak van niet-terugval sterfte (NRM) na allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT), wordt gemeten door disfunctie in drie orgaansystemen: de huid, lever en gastro-intestinale (GI) darmkanaal 4. Acute GVHD gebeurt meestal twee tot acht weken na transplantatie maar kan later optreden en vaak klinisch onderscheiden van andere post-HSCT complicaties zoals conditionering toxiciteit, infectie of bijwerkingen van medicijnen. Door het gebruik van proteomische strategieën en high-throughput validatie sequentiële ELISA hebben we vastgesteld 6 eiwitten waarvan concentraties worden verhoogd bij het begin van klinische manifestaties van GVHD. IL-2Ra, TNFR1, HGF en IL-8 in combinatie in een 4-biomarker panel kan diagnosticeren GVHD bij het ​​begin van klinische symptomen en kan na HSCT overleving voorspellen onafhankelijk van GVHD ernst 1. Elafin, een biomarker voor GVHD van de skin, onderscheid kan maken tussen GVHD huiduitslag en huiduitslag door andere oorzaken, zoals drug uitbarstingen en kan transplantatie overleving 2 te voorspellen. We hebben onlangs geïdentificeerd REG3α als biomarker van GVHD van de lagere maag-darmkanaal, het doelorgaan het meest geassocieerd met NRM. Plasma REG3α concentratie op betrouwbare wijze kan identificeren GVHD als de oorzaak voor post-HSCT diarree en correleren met histologische ernst van GVHD op diagnostische darm biopten. REG3α concentraties op GI GVHD begin kan ook voorspellen respons op GVHD therapie en NRM 3. De incorporatie van deze gevalideerde GVHD biomarkers in de klinische zorg wordt momenteel onderzocht in klinische studies. Deze experimenten werden uitgevoerd op kleine plasma monsters verzameld van patiënten die HSCT tussen 2000 en 2010 op het moment van GVHD optreden die onvervangbaar en beperkte hoeveelheid. Door de kostbare aard van deze monsters hebben we een gehaaldhod meten van meerdere plasma eiwitconcentraties op een efficiënte en reproduceerbare wijze overtollige vries-dooi cycli, ontdooien tijd en plasma gebruik elimineren. Deze techniek kan worden toegepast op ELISA voor meerdere eiwitten / cytokines plaats uitvoeren op hetzelfde monster (s) die de monsters niet te worden gemengd met andere reagentia. Als ELISA kits komen niet met pre-beklede platen met 96 putjes half putjes of 384 putjes gebruikt kan worden ter minimalisering gebruik van monsters / reagentia. Dit manuscript is gericht op de technologische aspecten van het meten van GVHD biomarkers.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Humaan IL-2 R alpha Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> Menselijke HGF Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> Menselijk IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match MONTAGE Human PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Human Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> R &amp; D Systelen </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well platen polystyreen conische bodem </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Wordt gebruikt voor plasma-source platen </td></tr><tr><td> Costar half-en high-binding 96-well platen </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Voor IL-2Ra, HGF, TNFR1 en elafin ELISA </td></tr><tr><td> Nunc 384-wells platen MaxiSorp </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Voor REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Runderserumalbumine, fractie V, behandeld Heat Shock </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker BLOTTO in TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Blokkerend middel voor IL-2Ra HGF en TNFR1 ELISA&#39;s </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;sFosfaat gebufferde zoutoplossing </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> Wasbuffer voor IL-2Ra, HGF, Elafin en TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> TMB Peroxide Susbtrate </td><td> Kirkegaard en Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> Wasbuffer voor IL-2Ra, HGF, Elafin en TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> Zwavelzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Verdund tot 2N) voor stop-oplossing </td></tr></tbody></table>

high throughput sequentiële elisa voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-host ziekte

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Onpartijdige ontdekking proteomics strategieën de mogelijkheid om grote aantallen van nieuwe biomarkers die diagnostische en prognostische testen kan verbeteren in een klinische setting en kan helpen sturen therapeutische interventies. Wanneer grote aantallen kandidaat-eiwitten geïdentificeerd, kan het moeilijk zijn om kandidaat biomarkers in een tijdige en efficiënte wijze valideren van patiënt plasmamonsters die gebeurtenisgestuurde van eindige volume en onvervangbaar, zoals aan het begin van acute graft-versus- host disease (GVHD), een potentieel levensbedreigende complicatie van allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT). Hier beschrijven we het proces van het uitvoeren handel verkrijgbare ELISA gevalideerd GVHD zes eiwitten: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2 en REG3α 3 (ook bekend als PAP1) in een sequentiële wijze te minimaliseren vries-dooi cycli, Ontdooid plasma-tijd-en plasma gebruik. Voor deze procedure voeren wij de ELISA&#39;s in de juiste volgorde, zoals bepaald door monster verdunningsfactor zoals bepaald in ons laboratorium met behulp van fabrikant ELISA-kits en protocollen met kleine aanpassingen om een ​​optimale sequentiële ELISA te vergemakkelijken. De resulterende plasma biomarker concentraties kan dan worden samengesteld en geanalyseerd op significante bevindingen binnen een patiëntenpopulatie. Hoewel deze biomarkers zijn op dit moment alleen voor onderzoeksdoeleinden, wordt de opname daarvan in de klinische zorg op dit moment onderzocht in klinische studies. Deze techniek kan worden toegepast op ELISA voor meerdere eiwitten / cytokines plaats uitvoeren op hetzelfde monster (s) die de monsters niet te worden gemengd met andere reagentia. Als ELISA kits komen niet met pre-beklede platen met 96 putjes half putjes of 384 putjes gebruikt kan worden ter minimalisering gebruik van monsters / reagentia.

<html> De biomarker workflow en de tijdlijn worden gedetailleerd beschreven in tabel 1 en tabel 2, respectievelijk. Na voltooiing concentraties van 6 verschillende eiwitten zijn nu gekwantificeerd op dezelfde plasmamonster met een totaal van 150 pi plasma. Plateren de monsters in duplo per test zorgt voor interne kwaliteitszorg, met CV&#39;s minder dan 10% zijn optimaal. Als het uitvoeren van de opeenvolgende ELISA op meerdere platen, consistente optische dichtheid van het hoge niveau en de voorkeur voor verbeterde inter-plate betrouwbaarheid van de metingen; standaardcurve ODs worden vergeleken tussen de platen te zoeken beoordelen inconsistentie in ELISA resultaten (figuur 2). Ontwikkeltijden met colorimetrisch substraat tetramethylbenzidine en hoge concentratie ODs waargenomen voor elk biomarker in ons laboratorium zijn vermeld in tabel 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figuur 1 &quot;/&gt; Figuur 1. Workflow voor IL-2Ra, REG3α en HGF ELISA. Na de plasmamonsters werden uitgeplaat op de IL-2Ra ELISA platen wordt teruggevraagd verdunning bron platen maken voor andere ELISA. Voor de HGF ELISA, wordt het plasma teruggewonnen om de 1:06 verdunning plaat voor te bereiden voor IL-8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere afbeelding</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Optische dichtheid voor de standaardcurve van 7 verschillende ELISA platen van REG3α concentraties overeenkomend met de 1084 patiënten getest voor de eerste REG3α GI GVHD biomarker verslag 3. Consistent ODs tussen de platen zodanig zijn dat eiwitconcentratie gemeten tussen de platen. Concentraties van eiwittenin plasmamonsters worden berekend door monster optische dichtheden bij de standaardkromme optische dichtheden. <table border="1"><tbody><tr><td> Experiment Dag 0 </td><td> 1. Bereid monsters </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Ra, HGF en REG3α capture Ab </td></tr><tr><td> Experiment Dag 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (via sample plating) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin en TNFR capture Ab </td></tr><tr><td> Experiment Dag 2 </td><td> 1. HGF ELISA voltooiing </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Opnieuw invriezen ongebruikteplasma </td></tr></tbody></table> Tabel 1. GVHD Biomarker Workflow Overzicht <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Day 0 </td><td colspan="3"> Monstervoorbereiding en overnachting capture lichaam incubatie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Ra </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> (Uur) </td><td> 0,0 </td><td> Het blokkeren van </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Plated Monsters </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclaim plasmamonsters; Detectie Ab </td><td> Het blokkeren; Prepare Monsters (1:10 verdunning) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td> Monsters plated (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td> Streptavidine-HRP </td><td> Detectie Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidine-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td> Plate Reading </td><td> TMB </td><td> Het blokkeren; Prepare monsters (1:2 verdunning) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Plate Reading </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td> Monsters plated (1:2) </td><td> Capture Ab (incubatie gedurende de nacht) </td><td> Capture Ab (incubatie gedurende de nacht) </td><td></td></tr><tr><td> Dag 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (Uur) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim plasma, detectie Ab </td><td> Het blokkeren; Prepare monsters (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Sample plating (1:2) </td><td> Blokkeren; Verdere verdunning van 1:20 tot 1:25 verdunning samples </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Sample plating (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Plate Reading </td><td> Detectie Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Bereid monsters (1:6 verdunning) </td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Detectie Ab </td><td> Sample plating (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Plate Reading </td&gt; <td> HRP </td><td> Detectie Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plate Reading </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plaat lezen </td></tr><tr><td colspan="2"> Na voltooiing </td><td colspan="6"> Vervang bron plasma in porties en vries voor later gebruik </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Tijdlijn voor het uitvoeren van ELISA&#39;s. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plasma Verdunningsfactor </td><td> High Standard Concentratie </td><td> Substraat Ontwikkeling Tijd (min) </td><td> Hoge OD </td><td> Curve </td></tr><tr><td> IL-2Ra </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Lineair </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Lineair </td></tr></tbody></table> Tabel 3. ELISA Details voor 6 GVHD Biomarkers.

High throughput validatie van meerdere kandidaat biomarkers kan worden uitgevoerd door opeenvolgende ELISA om vries / ontdooi cycli te minimaliseren en het gebruik van kostbare plasmamonsters. Hier laten we zien hoe u achtereenvolgens ELISA&#39;s voor zes verschillende gevalideerde plasma biomarkers te voeren<sup&gt; 1 tot 3</sup&gt; Of graft-versus-host disease (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; Op hetzelfde plasma monster.

High Throughput Sequentiële ELISA voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-Host ziekte

Onbevooroordeelde proteomics-strategieën voor discovery hebben het potentieel om grote aantallen nieuwe biomarkers te identificeren die de diagnostische en prognostische ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om gebruik te maken van high-throughput sequentiële ELISA om efficiënt een groot aantal nieuwe biomarkers te analyseren die via proteomics zijn ontdekt. Dit wordt bereikt door eerst monsters toe te voegen aan een bronplaat, die wordt gebruikt om verdunningen voor elke biomarker te maken en om herwonnen plasma tussen de tests door te bewaren. Vervolgens worden er ELISA's uitgevoerd voor elk eiwit om hun concentraties in patiëntenmonsters te bepalen.Uiteindelijk kan de verhoging van de proteïneniveaus van deze biomarkers bij het begin van de klinische manifestaties van acute graft-versus-hostziekte worden beoordeeld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat sequentiële analyzers meerdere nieuwe proteïnen kunnen analyseren die niet altijd beschikbaar zijn via multiplex-platforms. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van acute graft-versus-hostziekte.Aangezien biomarkers die via deze methode zijn gevalideerd nu worden onderzocht voor de klinische zorg, kan deze methode inzicht bieden in complicaties bij poëtische stamceltransplantatie na een trauma. Daarnaast kan de methode worden toegepast voor de ontdekking en validatie van biomarkers voor andere aandoeningen, zoals complicaties bij longtransplantaties, longkanker of potentieel elke ziekte waarbij een diagnostische bloedtest nuttig zou zijn.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het belangrijk is dat de verschillende stappen consistent worden uitgevoerd om reproduceerbaarheid te waarborgen en batchvariabiliteit te minimaliseren. Centrifugeer de dag vóór het experiment de plasma-aliquotmonsters gedurende 10 minuten bij 15.300 RCF en 4 °C om de stolsels aan de bodem en de lipiden aan de bovenkant van het plasma te scheiden. Pipetteer vervolgens handmatig 150 µL onverdund plasma van elk monster op een 96-well V-bodemplaat volgens vooraf gedefinieerde schema's. Wikkel de plaat in Parafilm en plaats deze in een koelkamer bij 4 °C voor maximaal 72 uur.Reconstitueer en verdun vervolgens de IL twee receptor alfa en de menselijke groeifactor, of HGF capture-antilichamen volgens de specificaties van de fabrikant, en breng aliquots van 50 µL van elk antilichaam aan in elke put van de respectievelijke 96-well high-binding halfwell-plates. Seal deze plates vervolgens met een plate sealer en incubeer ze overnight bij 4 °C. Verdun nu reg drie alpha met de coatingbuffer van de fabrikant volgens het protocol van de fabrikant en breng 25 µL van de oplossing aan in elke put van een 3 84-well no maxor plate.Bewaar deze plaat vervolgens ook op de eerste dag van het experiment verzegeld bij vier graden Celsius. Begin met het wassen van de IL two receptor alpha testplaat en het blokkeren ervan met blotto in TBS. Stel, na het reconstitueren van de standaard, een standaardcurve met acht punten op volgens het protocol van de fabrikant.Breng voor de volgende plaat 50 µL onverdund plasma en 50 µL van elke standaard in dubbeltoets van de bronplaat over naar de ELISA-testplaat. Incubeer vervolgens de afgesloten plaat bij kamertemperatuur op een platenrotator ingesteld op 300 RPM. Haal na twee uur het plasma uit de IL-2 receptor alfa ELISA-testplaat en plaats het terug in de bronplaat met onverdund plasma.Lees vervolgens, na voltooiing van de EIA volgens het protocol van de fabrikant, de optische dichtheid van elke well af met een platlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer. Voor de Reg IIIα ELISA wordt eerst 10 µL onverdund plasma overgebracht naar een aparte V-bodem bronplaat, waarna 90 µL van de door de fabrikant geleverde verdunningsbuffer aan elke well wordt toegevoegd om een 1:10 verdunningsbronplaat te maken. Na voltooiing van de Reg IIIα ELISA, conform het protocol van de fabrikant, wordt de stopoplossing aan de 384-well plaat toegevoegd en de optische dichtheid van elke well afgelezen met een platlezer ingesteld op 450 tot 620 nanometer. Na het reconstitueren en verdunnen van de elephant en TNF-R1 capture-antilichamen volgens de specificaties van de fabrikant, wordt elke well van de respectievelijke 96-well high-binding half-well platen gecoat met 50 µL van de capture-antilichamen.Incubeer vervolgens de verzegelde testplaten een nacht bij kamertemperatuur voor de elephant-plaat en bij vier graden Celsius voor de TN FFR one-plaat. Breng na voltooiing van de IL twee receptor alpha Eliza 60 µL onverdund plasma over naar een nieuwe bronplaat. Voeg vervolgens 60 µL 1%BSA in PBS toe aan elke put om een 1:2 verdunde plasmabronplaat te maken.Was vervolgens de HGF-testplaat en blokkeer deze met BLOTTO in TBS, en stel daarna de verdunningsreeks op voor de standaardcurve met acht punten. Nadat de plaat is gewassen en de blokkeringsstap is voltooid, brengt u duplicaat-aliquots van 50 µL van de plasmaverdunningen (1:2) en van elke standaard aan op de EISA-testplaat. Incubeer de afgedichte plaat vervolgens gedurende de nacht bij kamertemperatuur op een plaatrotor die is ingesteld op 300 RPM.Herstel de volgende ochtend het 1:2 verdunde plasma uit de HGF Eliza-testplaat en plaats dit terug in de bronplaat met het 1:2 verdunde plasma. Nadat de EIA volgens het protocol van de fabrikant is voltooid, wordt op de tweede dag van het experiment de optische dichtheid van elke put gemeten met een plaatlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer. Breng eerst 10 µL onverdund plasma over naar een nieuwe bronplaat, en voeg vervolgens 190 µL 1%BSA in PBS toe om 200 µL 1:20 verdund plasma te verkrijgen.Nadat de ELISA volgens het protocol van de fabrikant was voltooid, las zij de optische dichtheid af met een platenlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometers. Voor de TN FFR-analyse voegde zij eerst 25 microliters 1%BSA en PBS toe aan de 1:20 bronplaat, resulterend in 125 microliters 1:25 verdund plasma per well. Nadat de TN FFR EIA conform het protocol van de fabrikant was voltooid, las zij de optische dichtheid van elke well af met een platenlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometers. Voor de I-L-H-E-I-A transferde zij eerst 60 microliters 1:2 verdund plasma naar een nieuwe bronplaat en voegde vervolgens 180 microliters IL eight verdunningsvloeistof toe aan elke well om een 1:6 verdunde plasmaplatenbron te maken.Voer vervolgens de ILH-Elisa uit volgens het protocol van de fabrikant en lees de optische dichtheid van elke put af met een platenlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer. Wanneer alle ELISA's zijn voltooid, brengt u het ongebruikte plasma terug in de cryovials en vriest u deze in voor toekomstig gebruik. In deze grafiek worden de optische dichtheden voor de standaardcurve van zeven verschillende ELISA-platen getoond die de reg drie alpha-concentraties meten, overeenkomend met de 1084 patiënten die zijn getest voor het initiële reg drie alpha-biomarkerrapport voor gastro-intestinale graft-versus-hostziekte; consistente optische dichtheden tussen de platen waarborgen consistente eiwitconcentratiemetingen tussen de experimenten.De concentraties van de eiwitten in de plasmaproeven werden berekend door de optische dichtheden van de monsters te vergelijken met de optische dichtheden van de standaardcurve. Een robotisch schoon handlingsplatform kan worden gebruikt om de reproduceerbaarheid verder te verhogen en tegelijkertijd het volume gebruikte plasma te verkleinen door gebruik te maken van ELISA- en creatieve vorm-wellplaten. Bij het plannen van deze procedure is het belangrijk om eerst de EIS'en met onverdund plasma uit te voeren, zodat dit na ontwikkeling kan worden teruggewonnen en gebruikt kan worden in latere experimenten.Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de proteomica om kandidaat-biomarkers bij elke gewenste ziekte te onderzoeken door middel van het universele gebruik van sequentiële ELISA's. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe meerdere biomarkers gevalideerd kunnen worden met sequentiële E, waarbij kleine volumes plasma worden gebruikt en vrije cycli worden geminimaliseerd.

high-throughput-sequential-elisa-for-validation-biomarkers-acute

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te...

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

This video demonstrates an assay to detect anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients. A peptide array is synthesized to represent potential epitopes for antibody-mediated organ rejection. The array is incubated with the recipient's serum, containing alloantibodies that bind to their target epitopes. Antibody binding is detected using chemiluminescence to identify donor-specific HLA epitopes that incite alloantibody reactivity.

A Peptide Array-Based Detection of Anti-donor HLA Alloantibodies in Organ Recipients

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Incongruenties in menselijke leukocyten antigeen (HLA) sequenties tussen organ donor en ontvanger paren zijn de belangrijkste oorzaak van antilichaam-gemedieerde afwijzing in orgaantransplantatie. Hier presenteren we het gebruik van aangepaste antigeen arrays die zijn gebaseerd op individuele donoren HLA sequenties sonde anti-donor HLA alloantibodies orgel geadresseerden.

Gepersonaliseerd Peptide Arrays voor detectie van HLA Alloantibodies in orgaantransplantatie

Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft - versus - host-ziekte lijden.

Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

We modelleren een eenvoudige multiplexed ECL-test die 7 autoantilichaamtests samen combineert. De test is in staat om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere andere auto-immuunziekten, waaronder coeliakie, auto-immuun schildklierziekte en auto-immuun polyglandulair syndroom 1.

Een high-throughput elektrochemiluminescentie 7-Plex-test die tegelijkertijd screent op type 1 diabetes en meerdere auto-immuunziekten

In lijn met de dringende behoefte aan screening op type 1 diabetes, coeliakie en coronavirusziekte 2019, hebben we een high throughput 6-Plex elektrochemiluminescentietest ontwikkeld om tegelijkertijd alle vier de eilandjesautoantilichamen, weefseltransglutaminase autoantilichamen en antilichamen tegen het receptorbindingsdomein van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 te detecteren.

Een high-throughput multiplexed screening voor type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19

Op volbloed gebaseerde immunoassays bieden een gemakkelijk en hulpbronnenefficiënt hulpmiddel om antigeenspecifieke immuniteit te analyseren voor diagnostische en onderzoeksdoeleinden. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd volbloedprotocol met dubbele co-stimulatie voor uitgebreide analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen, inclusief een versie met een laag volume voor pediatrische patiënten en kleine dieren.

Volbloedtest met dubbele co-stimulatie voor antigeenspecifieke analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen

Leer een high throughput sequentiële ELISA-methode voor biomarker-validatie bij acute graft-versus-host ziekte. Deze techniek minimaliseert bevriezen/ontdooien cycli en bespaart waardevol plasma.

High Throughput Sequentiële ELISA voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-Host ziekte

Meer video's verkennen