High Throughput Sequentiële ELISA voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-Host ziekte

Het algemene doel van het volgende experiment is om high throughput sequentiële Eliza te gebruiken om efficiënt grote aantallen nieuwe biomarkers te analyseren die ontdekt zijn door proteomics. Dit wordt bereikt door eerst monsters toe te voegen aan een bronplaat, die wordt gebruikt om verdunning voor elke biomarker te creëren en om hersteld plasma tussen tests op te slaan. Vervolgens worden Eliza's uitgevoerd voor elk eiwit om hun concentraties in monsters van patiënten te bepalen.

Uiteindelijk kan de verhoging van de eiwitniveaus van deze biomarkers bij het begin van klinische manifestaties van acute graft versus host disease worden beoordeeld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat sequentiële analyzers meerdere nieuwe eiwitten kunnen analyseren die niet altijd beschikbaar zijn met multiplexing-platforms. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van acute graft versus host disease.

Aangezien biomarkers die via deze methode zijn gevalideerd nu worden onderzocht voor klinische zorg. Hoewel deze methode inzicht kan geven in complicaties bij post-traumatische poëtische stamceltransplantatie. Het kan ook worden toegepast op biomarkerontdekking en -validatie voor andere ziekten zoals longtransplantatie, complicaties, longkanker of potentieel elke ziekte waarvoor een diagnostische bloedtest nuttig zal zijn.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het belangrijk is dat de meerdere stappen consistent worden uitgevoerd om reproduceerbaarheid en lage batchvariabiliteit te garanderen. Op de dag voor het experiment worden plasma-monsters gedurende 10 minuten bij 15.300 RCF en vier graden Celsius gecentrifugeerd om de stolsels op de bodem en de lipiden op de top van het plasma te scheiden. Vervolgens worden 150 microliter onverdund plasma van elk monster geplaatst op een 96-well V-bodemplaat door middel van handmatig pipetteren volgens vooraf gedefinieerde kaarten. De plaat wordt vervolgens in Paraform gewikkeld en geplaatst in een menselijke kamer bij vier graden Celsius gedurende maximaal 72 uur.

Vervolgens, na het reconstitueren en verdunnen van IL twee receptor alfa en humane groeifactor, of HGF-capture-antilichamen volgens de specificaties van de fabrikant, worden 50 microliter aliquots van elk antilichaam in elk putje van respectieve 96-well high binding half well-plates geplaatst. Deze platen worden vervolgens verzegeld met een plaatverzegelaar en overnacht bij vier graden Celsius geïncubeerd. Vervolgens wordt reg drie alfa verdund met de coatingbuffer van de fabrikant volgens het protocol van de fabrikant en worden 25 microliter van de oplossing in elk putje van een 384-well no maxor-plaat geplaatst.

Vervolgens wordt deze plaat eveneens verzegeld bij vier graden Celsius opgeslagen op de eerste dag van het experiment. Begin door de IL twee receptor alfa-testplaat te wassen en deze te blokkeren met blotto in TBS. Na reconstitutie van de standaard, zet een achtpunts standaardcurve op volgens het protocol van de fabrikant.

Plaats vervolgens 50 microliter onverdund plasma en 50 microliter van elke standaard in duplicaat van de bronplaat op de ELIZA-testplaat. Incubeer vervolgens de verzegeld plaat bij kamertemperatuur op een plaatrotator ingesteld op 300 RPM. Na twee uur wordt het plasma van de IL twee receptor alfa ELIZA-testplaat teruggehaald en teruggeplaatst in de bronplaat met onverdund plasma.

Na het voltooien van de EIA volgens het protocol van de fabrikant, lees de optische dichtheid van elk putje met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer voor de rich drie alfa Eliza. Plaats eerst 10 microliter onverdund plasma op een aparte viewbodemplaat en voeg vervolgens 90 microliter van de door de fabrikant verstrekte verdunningsbuffer toe aan elk putje om een 1 op 10 verdunningsbronplaat te creëren. Na het voltooien van de Reg drie alfa Eliza, volgens het protocol van de fabrikant, voegt u de stopoplossing toe aan de 384-well plaat en lees de optische dichtheid van elk putje met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450 tot 620 nanometer. Na het reconstitueren en verdunnen van de olifant en tn FFR een capture-antilichamen volgens de specificaties van de fabrikant, codeert u elk putje van de respectieve 96-well high binding half well-plates met 50 microliter van de capture-antilichamen.

Incubeer vervolgens de verzegeld testplaten overnacht bij kamertemperatuur voor de olifantenplaat en bij vier graden Celsius voor de TN FFR een plaat. Na het voltooien van de IL twee receptor alfa Eliza, plaatst u 60 microliter onverdund plasma op een nieuwe bronplaat. Voeg vervolgens 60 microliter 1%BSA in PBS toe aan elk putje om een 1 op 2 verdunningsbronplaat te maken.

Was vervolgens en blokkeer de HGF-testplaat met BLOTTO in TBS en zet vervolgens de achtpunts standaardcurveverdunning op. Na het wassen van de plaat, zet u na de blokkeringsstap 50 microliter, dubbele aliquots van 1 op 2 verdund plasma en van elke standaard op de EISA-testplaat. Incubeer vervolgens de verzegeld plaat overnacht bij kamertemperatuur op een plaatrotator ingesteld op 300 RPM.

De volgende ochtend haalt u het 1 op 2 verdunde plasma van de HGF Eliza-testplaat terug en plaatst u het terug op de 1 op 2 verdunde plasmabronplaat. Na het voltooien van de EIA, volgens het protocol van de fabrikant, lees de optische dichtheid van elk putje met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer op de tweede dag van het experiment. Plaats eerst 10 microliter onverdund plasma op een nieuwe bronplaat en vervolgens 190 microliter 1%BSA in PBS om 200 microliter 1 op 20 verdund plasma te maken.

Na het voltooien van de olifant, Eliza, volgens het protocol van de fabrikant, lees de optische dichtheid met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer. Voor de TN FFR een, Eliza voegt u eerst 25 microliter 1%BSA en PBS toe aan de 1 op 20 bronplaat, wat resulteert in 125 microliter 1 op 25 verdund plasma per putje. Na het voltooien van de TN FFR een EIA volgens het protocol van de fabrikant, lees de optische dichtheid van elk putje met behulp van een plaatlezer ingesteld op