Name: Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Leer een nieuwe methode voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen in het centrale zenuwstelsel met behulp van TVA-receptorspecificiteit en een trans-synaptisch virus. Deze techniek maakt hoogdoorvoeranalyse van neurale circuits mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Sean Whelan erkennen voor hulp bij het redden van recombinante VSV-varianten, en Didem Goz en Ryan Chrenek voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door HHMI (CLC), en # NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met virussen neurale circuits studie een relatief high throughput werkwijze voor het analyseren verbonden neuronen. Echter, het genereren van zowel VSV en RABV virionen is niet triviaal. Hoewel het bovenstaande protocol voor reddings virus van cDNA wordt, is het nog steeds een lage waarschijnlijkheid event. De niveaus van elk van de N, P en L plasmiden moeten fijn worden aangepast en vele proeven en gerepliceerd moet worden gedaan om virale rescue waarborgen. De vorming van de ribonucleotide deeltjes waarin een volledig...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Weefselkweek&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Baby Hamster Kidney (BSRT7) cellen</td><td>beschikbaar op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>beschikbaar op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pN, pP, pl plasmiden</td><td>beschikbaar op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cellen</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC-behandelde kweekschaal</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; rechthoekige kweekfles met schuine hals en ventilatiedop</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Medium: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: Foetaal Bovien Serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2,000 transfectiereagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Spuit: 5 ml Luer-Lock spuit</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilters</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: High Potency Lineair PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Virale Centrifugatie&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning 150 ml buis vacuümfiltersysteem, 0.45 &amp;mu;m porie</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Dunwandige, ultracleare ultracentrifugebuizen, 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>SW28 ultracentrifugerotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Injectie in muis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Capillaire micropipetten</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Ump injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Vierkanaals microcontroller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>M.TXB tafelmotor met C.EMX-1 draaischakelaar, 115 Volt</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 handstuk, snelwisselend</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Trapsboormachine, 0.5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Micro&amp;#8211;elektrodehouder</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuit</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge injectienaald</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Beschermende oogzalf</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Jodium</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Chirurgische en dissectie-instrumenten&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Scharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Standaard pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas veerscharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelhouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelmesjes</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Hechtmaterialen</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissectie en antilichaamkleuring&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Donkeyserum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Antilichamen&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Montage van weefsel&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Superfrost plus microscopische objectglazen</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas 22 x 22, 0 dikte</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen elastomeer</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Transparante nagellak</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagens</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

virale tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Klassieke methodes voor het bestuderen van neuronale circuits zijn vrij geringe capaciteit. Transsynaptic virussen, met name de pseudorabies (PRV) en rabiësvirus (RABV), en meer recent vesiculair stomatitis virus (VSV), voor het bestuderen schakelingen, wordt steeds populairder. Deze hogere doorvoersnelheid methoden gebruiken virussen die overbrengen tussen neuronen in zowel de anterograde of retrograde richting. Onlangs werd een aangepaste RABV voor monosynaptic retrograde tracing ontwikkeld. (Figuur 1A). In deze methode wordt het glycoproteïne (G) gen verwijderd uit het virale genoom en alleen in bevoorraad gerichte neuronen. Infectie specificiteit wordt bereikt door het substitueren van een chimeer G, bestaande uit het extracellulaire domein van de ASLV-A glycoproteïne en het cytoplasmatische domein van de G-RABV (A / RG) voor de normale RABV-G 1. Deze chimere G infecteert specifiek cellen die de TVA-receptor 1. Het gen dat codeert TVA kan zijn delivered op verschillende manieren 2-8. Na RABV-G infectie van een TVA-expressie neuron kan de RABV verzenden naar andere, synaptisch verbonden neuronen in een achteruitgaande richting van nature eigen G was geleverd samen met TVA receptor. Deze techniek labels een relatief groot aantal ingangen (5-10%) 2 op een bepaald celtype, die een bemonstering van alle ingangen op een bepaald celtype starter. We hebben onlangs gemodificeerd deze techniek VSV als een tracer transsynaptic 9. VSV heeft een aantal voordelen, waaronder de snelheid van genexpressie. Hier hebben we detail een nieuwe virale tracing systeem met behulp van VSV nuttig voor het sonderen van microcircuits met verhoogde resolutie. Terwijl de oorspronkelijke gepubliceerde strategieën Wickersham et al.. 4 en Beier et al.. 9 vergunning etiket van neuronen die aanvankelijk op geïnfecteerd TVA-expressie-cellen hier VSV werd ontworpen om slechts aan TVA-expressie brengende cellen (Figuur 1B). Het virus wordt eerst met pseudogetypeerd RABV-G infectie van neuronen stroomafwaarts van TVA-expressie neuronen mogelijk. Na het infecteren deze eerste populatie van cellen, het virus infecteren model alleen TVA tot expressie brengende cellen. Omdat de transsynaptic virale verspreiding beperkt tot TVA tot expressie brengende cellen, of afwezigheid van connectiviteit van gedefinieerde celtypes kunnen worden onderzocht met hoge resolutie. Een experimentele stroomschema van deze experimenten wordt getoond in Figuur 2. Hier laten we een model circuit, dat van richting-selectiviteit in de muis retina. We onderzoeken de connectiviteit van starburst amacrine cellen (SBZ) aan retinale ganglioncellen (RGC).

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Klassieke methoden voor het bestuderen van neuronale circuits hebben een vrij lage doorvoer. Transsynaptische virussen, in het bijzonder het pseudorabiesvirus (PRV) en het rabiësvirus ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontwikkelen van een nieuwe techniek voor het analyseren van microcircuits in het centrale zenuwstelsel. Dit wordt bereikt door eerst een populatie neuronen te definiëren voor infectie door expressie van de TVA-receptor. Als tweede stap wordt het transsynaptische virus in het CZS geïnjecteerd, dat de primaire neuronen naar keuze infecteert.Vervolgens zal het virus zich alleen transsynaptisch verspreiden naar verbonden neuronen die de TVA-receptor tot expressie brengen. Om te onderzoeken of deze neuronen verbonden zijn, worden resultaten verkregen die aantonen dat deze techniek kan worden gebruikt om microcircuitry te analyseren, gebaseerd op de validatie van de labeling van bekende verbonden microcircuitry. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektrofysiologie en microscopie is dat het een high-throughput methode is voor het analyseren van neuronale circuitry.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we de eerste studie naar monosynaptisch beperkte virale tracing van Wickersham en collega's lazen. We waren van mening dat virussen verder gemodificeerd konden worden om verbonden neuronen op nieuwe manieren te bestuderen. Raadpleeg het geschreven protocol voor details over het herstel van VSV uit CD NA met behulp van het VACCINIA T seven-systeem om cellen voor passage te genereren.Aspireren eerst het medium uit vier 10 centimeter platen met 80% confluente TV eight 800-cellen die de vorige dag zijn uitgeplaat, en vervangen dit door vijf milliliter ongesupplementeerd DMEM. Transfecten elke plaat met vijf microgram van het plasmide dat codeert voor het gewenste glycoproteïne volgens standaardprocedures. Vervangen na ongeveer zes uur na transfectie het medium door DMEM gesupplementeerd met 10% FBS. Incubeeren de platen overnight in een weefselkweekincubator ingesteld op 34 °C met 5% koolstofdioxide om glycoproteïne-expressie en oppervlakteaccumulatie mogelijk te maken.Aspirer na de incubatie het medium en vervang dit door vijf milliliter DMEM plus 10%FBS. Infecteer vervolgens elke plaat met VSV dat het MA rabiës G chimeer glycoproteïne bevat bij een multipliciteit van infectie van 0,01 tot 0,1 en incubeer dit gedurende de nacht bij 34 °C. Controleer 24 uur later de infectiegraad van elke plaat met fluorescentiemicroscopie. Als meer dan 50% van de cellen geïnfecteerd was, verzamel dan het medium.Vervang door vijf milliliter vers medium en vries het verzamelde medium vervolgens in bij -80 °C. Herhaal de verzamelprocedure 24 uur later gedurende drie dagen, voor een totale verzamelperiode van vier dagen. Vries elke aliquot van het verzamelde medium in nadat de laatste aliquot volledig is bevroren bij -80 °C; aangezien alle verzamelde mediumaliquots op dit punt bij 37 °C zijn, zouden er 80 milliliter verzameld medium moeten zijn. Filter het verzamelde medium op ijs door 0,45 micron filters. verdeel vervolgens 36 milliliters virus over een Beckman-centrifugebuis en concentreer het supernatant door middel van ultracentrifugatie bij 80, 000 ×g gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius. Zorg ervoor dat de rotor correct is gebalanceerd en giet na de centrifugatie de inhoud in een bekerglas met 10% bleekmiddel; gebruik een aspirator om vloeistof van de wand van de buis te verwijderen. Schud vervolgens de buizen met het virus gedurende één uur bij 120 RPM bij vier graden Celsius en resuspendeer het virale pellet in het kleinst mogelijke volume, meestal rond de 30 microliters.Zodra het virus opnieuw is gesuspendeerd, wordt het virus getitreerd door een 24-wells plaat met 2 9 3 T-cellen te infecteren met een verdunningsreeks van 1 tot 1 miljoen (tienvoudig) en de titratie ongeveer twee dagen na infectie uit te voeren. Volgens standaardprocedures kunnen viraal geïnfecteerde cellen via fluorescentie worden gedetecteerd. Het is belangrijk om de juiste cellijn voor deze experimenten te gebruiken.Het doel is om de TVA-receptor te laten tot expressie komen in de celtypen die men in kaart wil brengen. Dit kan worden bereikt door expressie van de TVA-receptor via virale middelen of via een transgeen allel. In dit experiment worden triple transgene muizen van zes tot 10 weken oud gebruikt.Muizen die een conditioneel TVA-allel tot expressie brengen, worden gekruist met muizen die een chat-Cre-allel tot expressie brengen. Vervolgens werden deze muizen gekruist met een lijn die een fluorescent TD-tomato-allel tot expressie brengt. De uiteindelijke transgene muis brengt TVA en een conditioneel TD-tomato-allel tot expressie in alle cellen die Cre tot expressie brengen, inclusief de relevante starburst omicron-cellen.Deze expressie kan worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. Controleer de stereotaxische coördinaten voor het interessegebied in een muizenbreinatlas en bereid het stereotaxische apparaat voor door de controller van de micro-injector in te schakelen en de zuiger en de elektrodehouder op hun plaats te bewegen. Vul vervolgens de naald achteraf met minerale olie om een interface met het virus te creëren en plaats de naald op de zuiger, waarbij u er zeker van bent dat er geen luchtbellen in de naald zitten.Ontdooi het virus en plaats het op ijs. Stel de micro-injector in op opzuigen en plaats de buis met virus onder de capillaire in de micro-injector. Laat de punt van de capillaire in het virus zakken en zuig de benodigde hoeveelheid virus voor het experiment op.Nadat een preoperatieve dosis buprenorfine is toegediend, wordt het dier adequaat geanestheseerd volgens de institutionele richtlijnen. Voer een knijptest bij de teen uit en stel vast dat de reflexrespons afwezig is voordat de procedure wordt gestart.Plaats de geanestheseerde muis op een warmtemat die op een verstelbare standaard is geplaatst voor het positioneren van de muis. Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen terwijl het dier onder anesthesie is. Plaats de muis vervolgens in het stereotaxische apparaat door de oorstaven voorzichtig in het gehoorgang in te brengen.Zorg ervoor dat de kop parallel staat aan de basis van de stereotaxis en niet zijwaarts beweegt. Pas vervolgens de bijtbalk aan om de kop verder te stabiliseren. Verwijder de vacht in het gebied van de incisie.Was dit gebied vervolgens drie keer met ethanol, gevolgd door drie keer met jodium. Maak daarna met een schaar een sagittale incisie in de huid om de schedel bloot te leggen en duw de huid terug met zelfgemaakte chirurgische haken. Zet vervolgens de microcapillair vast met bgma en gebruik de draaiknoppen om de micro-injector naar de coördinaten van de laterale gent-nucleus te verplaatsen.Zodra de LGN is gelokaliseerd, wordt er een klein gaatje in de schedel geboord boven de injectieplaats. Plaats de capillair boven het gaatje en laat deze langzaam zakken tot een positie net dorsaal van het breinoppervlak. Dit is de nulpositie van de dorso-ventrale coördinaat.De microcapillaire moet scherp genoeg zijn om de dura van de muis te doorboren. Breng deze langzaam naar een diepte van 2,75 millimeters en injecteer de benodigde hoeveelheid virus met een snelheid van ongeveer 100 nanoliters per minuut. Laat de naald ongeveer zeven minuten in de hersenen zitten om diffusie van het virus vanuit de injectieplaats mogelijk te maken en te voorkomen dat het virus langs de naald omhoog beweegt.Trek de naald vervolgens gedurende twee minuten zeer langzaam uit de injectieplaats en uit de hersenen. Hecht tot slot de chirurgische wond en houd de dieren in de gaten totdat ze volledig bijgekomen zijn uit de anesthesie. Dien gedurende twee dagen elke 12 uur buprenorfine toe.Over het algemeen kan de transsynaptische verspreiding van VSV ongeveer 24 uur na injectie worden waargenomen. Langere wachttijden leiden echter tot een verdere verspreiding. Na euthanasie van de muis door koolstofdioxide-inhalatie wordt het oog gedisseceerd in 4% formaldehyde en gedurende één uur geïncubeerd, waarbij erop wordt toegezien dat het oog volledig ondergedompeld blijft.Breng het oog vervolgens over naar een Petrischaal met PBS. Gebruik een pincet nr. 55 om de cornea snel te verwijderen en de retina los te maken en te dissekeren van andere weefsels. De whole mount-analyse.Snijd het netvlies op een objectglas zodanig dat het plat ligt. Plaats siliconen spacers rond de randen van het objectglas met prolonged gold mounting medium en plaats vervolgens een dekglas met nul-dikte voor de analyse van netvliessneden. Plaats het netvlies in 30% sucrose in PBS totdat het netvlies volledig is ondergedompeld.Plaats de retina vervolgens gedurende drie uur in een mengsel bestaande uit een one-to-one ratio van OCT en een 30% sucrose-oplossing. Vries de retina ten slotte snel in en bewaar deze bij minus 80 graden Celsius tot het moment van sectie. Deze afbeelding toont een tijdreeks-experiment waarin de infectiviteit van TVA 800-cellen en 2 9 3 T-cellen door vsv A slash rg wordt aangetoond.De bovenste panelen tonen TVA 800-cellen na zes uur, één dag en twee dagen na infectie. De onderste panelen tonen 2 9 3 T-cellen op dezelfde tijdstippen. Het virus verspreidt zich tussen TVA-exprimerende cellen in een kwestie van uren, terwijl de verspreiding in 2 9 3 T-cellen, die de TVA-receptor niet tot expressie brengen, weliswaar plaatsvindt, maar veel langzamer verloopt.De schaalbalk staat voor 100 micron. Deze afbeelding toont een representatieve infectie van retinale ganglioncellen van muizen die geen TVA tot expressie brengen. Dieren werden in de LGN geïnjecteerd met het vsv A/RG-virus.Gpseudotypisch gemaakt met R-A-B-V-G en het weefsel is twee dagen na injectie geoogst. Hier is een schaarse infectie te zien, waarbij de retinale ganglioncellen zijn aangegeven met de gele pijlpunten. Deze afbeelding toont een dichtere infectie.Dit kan worden bereikt met een hogere TI van het virus en een injectie van goede kwaliteit, zoals hier te zien is. Verschillende typen retinale ganglioncellen kunnen worden geïdentificeerd op basis van morfologie, waaronder kleine arbor-ganglioncellen, type één melanopsine-ganglioncellen, 'on'-richtingsselectieve ganglioncellen (DS GC's) en 'off'-DS GC's. Hier stelt de schaalbalk 50 microns voor, zoals te zien is in de volgende afbeeldingen van een TVA-expresserende muis.De transmissie van VSVA/RG van on-off DS GCs naar Starburst omics volgt het verwachte patroon. De on-off DS GCs, aangegeven met de witte pijlpunten en een groene vulling, transporteren het virus naar meerdere Starburst omics, aangegeven door de gele pijlpunten. Zoals hier te zien is, co-labelen alle groene cellen die geen DS GCs zijn met de Cree-reporter, wat aangeeft dat het TVA-expresserende Starburst omics zijn.De DS GC's, aangegeven door witte pijlpunten met groene vulling, en de starburst omics, aangegeven door gele pijlpunten, stratificeren de bijbehorende chatlagen van de binnenste plexiforme laag van het netvlies of IPL; de cellen waarnaar het virus wordt overgedragen omvatten zowel on- als off-cellen. Starburst omicron. De getallen in deze figuur geven de lagen van de IPL aan. Eenmaal beheerst, kan het gehele experiment in één of twee dagen worden voltooid indien het correct wordt uitgevoerd.De snelheid van VSV is een van de belangrijkste voordelen na deze procedure. Andere methoden, zoals channel red of opsine-gebaseerde circuitmapping, kunnen worden uitgevoerd om de virale circuittracing te valideren en de eigenschappen van deze synaptische verbindingen te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in de meeste verschillende stappen die komen kijken bij virale circuittracing, van het kweken van het virus tot de in vivo injectie en het analyseren van fluorescentielabelen neuronen.

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Wij bieden een praktische gids voor het leveren van...

Revealing Neurale Circuit Topografie in Multi-Color

Transsynaptisch traceren is een krachtig hulpmiddel geworden voor het analyseren van centrale efferente regulatie van perifere doelwitten via multi-synaptische circuits. Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van het transsynaptische pseudorabiësvirus om een functionele hersencircuit te identificeren en lokaliseren, gevolgd door klassieke tract tracing-technieken om specifieke verbindingen in het circuit tussen geïdentificeerde groepen neuronen te valideren.

Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling

Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van selectieve neuronale populaties, het label na retrograde infectie met een gemodificeerde rabiësvirus uiten van fluorescerende markers, en onafhankelijke, onpartijdige cluster analyses waarmee uitgebreide karakterisering van morfologische metrics onder verschillende neuronale subklassen.

Grootschalige Reconstructies en Onafhankelijk, Unbiased Clustering Gebaseerd op morfologische Metrics om neuronen te classificeren in Selective Populaties

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Dit protocol is gericht op het genereren van direct geherprogrammeerde interneuronen in vivo, met behulp van een AAV-gebaseerd virale systeem in de hersenen en een FLEX synapsin-driven GFP Reporter, die het mogelijk maakt voor celidentificatie en verdere analyse in vivo.

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.

Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer een nieuwe methode voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen in het centrale zenuwstelsel met behulp van TVA-receptorspecificiteit en een trans-synaptisch virus. Deze techniek maakt hoogdoorvoeranalyse van neurale circuits mogelijk.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Meer video's verkennen