Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo's en differentiëren van embryonale stamcellen
11 oktober 2012
Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.
Het doel van de volgende procedure is om aan te tonen hoe de lysosomen van twee soorten monsters, muisembryo's en gedifferentieerde stamcellen, met lyo tracker kleurstof kunnen worden behouden om patronen van celdood te detecteren. Om embryomonsters voor te bereiden, worden embryo's eerst chirurgisch geïsoleerd en in een schaal geplaatst om gedifferentieerde cellen voor te bereiden. Embryonale stamcellen worden gebruikt om embryolichamen te creëren.
Deze embryolichamen worden in suspensie gekweekt en vervolgens als monolaag op een kamerschijven gekweekt. De embryo's kunnen allemaal worden beïnvloed door een monolayer en kunnen worden beïnvloed in ot tracker rood en worden vervolgens gespoeld en gefixeerd. monsters kunnen dan worden gefotografeerd om de kleuringsresultaten te onderzoeken en te kwantificeren die worden verkregen die Liso Tracker tonen. Kleuring is een eenvoudige procedure die kan worden gebruikt om geprogrammeerde celdood in embryo's en gekweekte cellen te meten.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals tunnelanalyse is dat omdat OT tracker kleurstof een klein molecuul is, dik weefsel snel en gemakkelijk kan worden onderzocht. Hoewel deze methode inzicht kan geven in patronen van geprogrammeerde celdood in muisembryo's en gedifferentieerde culturen, kan deze ook worden toegepast op andere weefsels zoals kippenembryo's en differentiërende volwassen stamcellen. Koppel jonge vrouwelijke muizen met een dekmannetje en controleer de volgende ochtenden op een vaginale plug, wat aangeeft dat er paring heeft plaatsgevonden.
Middag op de dag dat de vaginale plug verschijnt is effectief 0,5 dagen. Na coitus op de embryonale dag van belang, euthanaseerd de vrouw volgens goedgekeurde protocollen en verwijder de baarmoeder naar een 10 centimeter petrischaal met Hank's BSS en spoel eventueel bloed weg. Scheid de embryo's en verwijder ze uit de baarmoeder.
Verwijder de extra embryonale membranen en doe ten minste één spoeling met Hank's BSS om overtollig weefsel en bloed te verwijderen. Houd de gedissecteerde embryo's op ijs terwijl u schoonmaakt. De anderen.
Bereid vijf milliliter Liso tracker embryo kleuringsoplossing. Dit is een voldoende volume voor een of twee embryocollecties. Meng de oplossing voorzichtig om de kleurstof te verspreiden, gelijkmatig de dan breng de embryo's over in de oplossing en incubeer ze 45 minuten bij 37 graden Celsius.
Na de incubatie spoelt u de embryo's voorzichtig in Hank's BSS vier keer gedurende vijf minuten per wassing. Het is belangrijk om de spoelingen voorzichtig te doen om het weefsel niet te beschadigen. Verwijder het vloeistof, let goed op waar de delicate embryo's zich bevinden, en laat altijd een deel van de vloeistof achter om ze te bedekken.
Bevestig vervolgens de embryo's in 4% para formaldehyde overnacht de volgende dag. Spoel de embryo's eenmaal in Hank's BSS gedurende 10 minuten om het fixeermiddel te verwijderen. Hydrateer nu de weefsels door een methanolserie om achtergrondkleuring te elimineren.
Deze stap verbetert de signaal-ruisverhouding tijdens beeldvorming vóór opslag. Indien nodig, verzamel een weefselmonster van elk embryo voor genetische analyse. Later, rehydrateer het weefselmonster voorafgaand aan genotypering.
Schei de embryo's in afzonderlijke buisjes met labels die overeenkomen met het weefselmonster. Nu is het mogelijk om de geïsoleerde embryo's voor onbepaalde tijd in methanol van min 20 graden Celsius op te slaan. Beschermd tegen licht.
Begin met het voorbereiden van embryolichamen via de hangende druppelmethode. Met een startdichtheid van 500 cellen per 20 microliter druppel na drie dagen, brengt u de embryolichamen over naar suspensieculturen op 10 centimeter niet-aderente petrischalen. Kweek ze vijf dagen lang, waarbij u het medium om de twee dagen ververst na vijf dagen.
Breng de embryolichamen over naar gelatineerde achtkamerslides en plaats een of twee embryolichamen in elke kamer. Kweek de embryolichamen nog eens 10 dagen. Na 10 dagen, ververs het medium om de dag, aspireer voorzichtig het bestaande medium en voeg 300 microliter Lyo tracker celkleuringsoplossing toe aan elke kamer.
Wees voorzichtig om het medium handmatig te pipetten en plaats de pipettentip in de hoek van de kamer. Op deze manier verwijdert u niet per ongeluk de, nog steeds hecht elke body van het glazen oppervlak. Wanneer u het medium weer toevoegt, plaatst u de pipettentip in de hoek van de kamer en voegt u het medium heel langzaam terug toe.
Incubeer de kamers gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Spoel ze vervolgens twee keer met DPBS gedurende vijf minuten per spoeling. Bevestig nu de cellen in 4%paraldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Verwijder vervolgens het fixeermiddel met DPBS in twee spoelingen van vijf minuten. Om de embryo's te monteren, plaatst u ze in een diepe depressie glasplaat of kleine petrischaal infector schild. Bereid de celmonsters voor voor microscopie door de DPBS te aspireren.
Verwijder de kamer van de dia en laat deze ongeveer vijf minuten aan de lucht drogen. Bedek met folie om de fluro te beschermen. Voeg vervolgens een waterige montagemiddel zoals vector shield met dappy toe en plaats een dekglas erop.
Nu is de dia gemonteerd en klaar voor beeldvorming. Visualiseer de monsters met een dissectiescoop of samengestelde microscoop uitgerust met een staaf, domine of Texas red filter. De kleuring is meestal vrij helder, dus lange belichtingen zijn meestal niet nodig in de handmatige modus.
Neem digitale foto's van alle monsters onder dezelfde belichtingscondities. Om de afbeeldingen te kwantificeren, opent u ze in Adobe Photoshop of een vergelijkbaar beeldprogramma. Om de hoeveelheid lyo tracker kleuring te bepalen, selecteert u het rode kanaal.
Noteer het pixeltelling voor de hele afbeelding zoals weergegeven door de histogramfunctie. Volgende drempel, de afbeelding zodat de rode kleuring nu wordt weergegeven door witte pixels. Dit zet de afbeelding om in zwart-wit.
Kies een drempelniveau en gebruik dit niveau voor alle afbeeldingen in de set. Selecteer de witte pixels met behulp van de kleurenbereiktool en gebruik de histogramfunctie om het totale
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol toont een methode om geprogrammeerde celdood (PCD) te visualiseren in muis-embryo's en differentiërende embryonale stamcel (ES) celculturen met behulp van LysoTracker kleurstof. De procedure omvat het isoleren van embryo's en het voorbereiden van gedifferentieerde stamcellen voor kleuring en analyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Geprogrammeerde celdood is een cruciaal proces tijdens de ontwikkeling.
- LysoTracker is een kleurstof die wordt gebruikt om lysosomen in cellen te kleuren.
- Inzicht in PCD-patronen kan inzicht geven in ontwikkelingsprocessen.
- Deze methode kan worden toegepast op zowel embryo's als gekweekte cellen.
Doel van de studie
- Om regio's van geprogrammeerde celdood in muis-embryo's te visualiseren.
- Om PCD te beoordelen in differentiërende embryonale stamcelculturen.
- Om een eenvoudig en effectief kleuringsprotocol te bieden.
Gebruikte methoden
- Isolatie van muis-embryo's en voorbereiding van gedifferentieerde stamcellen.
- Kweek van embryonale stamcellen om embryolichamen te vormen.
- Kleuren met LysoTracker kleurstof om lysosomen te visualiseren.
- Fotografie van gekleurde monsters voor analyse van celdoodpatronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van geprogrammeerde celdood in beide monstersoorten.
- Duidelijke kleuringspatronen waargenomen met LysoTracker.
- Aangetoond effectiviteit van het kleuringsprotocol.
- Resultaten kunnen helpen bij het begrijpen van de ontwikkelingsbiologie.
Conclusies
- Het LysoTracker kleuringsprotocol is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers.
- Het maakt de beoordeling van PCD in verschillende biologische monsters mogelijk.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om ontwikkelingsprocessen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of programmed cell death (PCD) using LysoTracker enables high-content analysis of cell viability and death patterns in complex embryonic and stem cell systems. This capability supports early discovery teams in de-risking developmental toxicity and mechanistic ambiguity, directly impacting target validation and translational model fidelity. Integrating robust PCD quantification informs portfolio triage and predictive confidence at critical inflection points in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell death pathways in genetically modified or chemically treated embryonic models.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing apoptosis from autophagy-related cell death.
- Facilitates functional target validation through quantifiable lysosomal activity readouts.
- Improves predictive confidence in developmental toxicity assessments.
Screening & Assay Development
- Provides a scalable, reproducible assay for detecting PCD in thick tissues and multilayer cultures.
- Delivers quantitative, image-based outputs suitable for high-content screening platforms.
- Enables standardization of cell death detection across diverse sample types.
- Supports reliable evaluation of compound-induced cytotoxicity in differentiating stem cell systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro stem cell models with in vivo embryonic outcomes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying developmental cell death in disease-relevant systems.
- Supports biomarker alignment through correlation of lysosomal activity with PCD phenotypes.
- Facilitates mechanistic studies of genetic or environmental perturbations in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
LysoTracker-based PCD detection integrates from early discovery through preclinical validation, bridging in vitro and in vivo model systems for comprehensive mechanistic insight.
- Discovery Biology: Quantifies cell death patterns to clarify pathway involvement and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound profiling.
- Analytics: Enables image-based measurement and statistical comparison of PCD across experimental conditions.
- Translational Research: Connects stem cell differentiation models to embryonic phenotypes for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, fixable staining protocol for diverse tissue and cell culture systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death analysis.
- Operational Value: Standardizes PCD detection with a rapid, scalable, and robust workflow.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryology, stem cell culture, and fluorescence imaging.
- Needs access to standard fluorescent or confocal microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and quantification protocols.
- Adaptable to various model systems, including embryos and differentiating adult stem cells.
- Interpretation must consider that increased lysosomal activity may reflect multiple PCD pathways.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
LysoTracker Staining of Mouse Embryos
4:53
LysoTracker Staining of Differentiating ES Cultures
6:51
Mounting Samples for Imaging
7:44
Viewing LysoTracker-stained Samples and Image Analysis
9:21
LysoTracker Staining in Shh Null Embryos and Cultured Cells
12:10
Conclusion
