Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

Het algemene doel van de volgende methode is om het gedrag van enkele cellen van verschillende gistsoorten onder dezelfde dynamische omstandigheden te beeldhouwen. Dit wordt bereikt door een tweetlaags microfluïdisch apparaat te fabriceren, of de onderste laag zal elke van de verschillende soorten afzonderlijk bevatten, en de bovenste laag zal de dynamische stromingsomstandigheden als tweede stap bieden. Verschillende gistsoorten worden in de putjes geplaatst en het apparaat wordt gesloten, waardoor een enkele kanaal met meerdere gescheiden stammen ontstaat.

Vervolgens beelden we de celreacties op dynamische mediumveranderingen af. Door de stroomsnelheden in de twee ingangen van het Y-kanaal te regelen, tonen de resultaten verschillende stammen die aan dezelfde dynamische omstandigheden zijn onderworpen en geen kruisbesmetting tussen putjes. Dit microfluïdische apparaat heeft verschillende belangrijke voordelen boven andere bestaande systemen. Het maakt het mogelijk om meerdere verschillende stammen onder dezelfde dynamische omstandigheden te beeldhouwen.

Ook, belangrijk, het kan eenvoudig in elke laboratorium worden vervaardigd zonder speciale apparatuur nodig te hebben. De oorsprong van deze methode kwam uit een discussie over hoe de reacties van verschillende wilde Oost-isolaten op hongerpassages te volgen. Start, teken of print de gewenste microkanaal-indeling op schaal.

Bedek vervolgens een glazen plaat met lagen plakband. Om de gewenste hoogte van het kanaal te bereiken, plaats de lay-out op een vlakke ondergrond en lijn de plaat uit over het ontwerppatroon. Knip nu voorzichtig het plakband op de glazen plaat volgens het lay-out. Verwijder het plakband uit alle regio's van de glazen plaat.

Accepteer degenen in de lay-out van het microkanaal. Plaats de plaat gedurende drie minuten in een oven van 65 graden Celsius. Reinig vervolgens voorzichtig met ethanol.

Meng de basis en uithardende componenten van PDMS zoals aanbevolen door de fabrikant. Giet ongeveer 30 milliliter PDMS-mengsel in een petrischaal tot een hoogte van ongeveer 0,5 centimeter. Degas de PDMS in vacuüm indien nodig.

Dompel de glazen plaat in het PDMS met het patroon van het plakband naar boven. Het plaatsen van het patroon na het PDMS voorkomt de vorming van luchtbellen tussen de plaat en de schaal. Cure voor 48 uur bij 65 graden Celsius, zorg ervoor dat de schaal horizontaal is met behulp van een waterpas in een nieuwe 90 millimeter petrischaal. Giet drie milliliter PDMS-mengsel.

Deze stap kan worden uitgevoerd op een spin-codeerder indien beschikbaar. DGAs en cure zoals eerder getoond. Snijd nu voorzichtig de stromingslaag van het microfluïdische apparaat naar de gewenste grootte met een biopsiepons.

Maak gaten voor de ingangen en uitgangen in de stromingslaag. Knip ook een even grote putjeslaag uit de tweede petrischaal en plaats deze op een dikke glasplaat. Schuif over het ontwerplay-out.

Boor vervolgens putjes in uitlijning met de microkanalen op het lay-out met behulp van ethanol, reinig beide PDMS-lagen en een glazen deksel en laat het drogen. Behandel vervolgens het glazen deksel en de putjeslaag PDMS met een standaard plasma-etcher voor niet-omkeerbare binding of een handbediende corona-behandelaar voor omkeerbare binding. Plaats voorzichtig de putjeslaag op het deksel om hechting te veroorzaken.

Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen. Bereid het gewenste medium voor in geschikte spuiten en verbind deze met tigon-slangen die door een spuitpomp worden geleid. Voor celbeeldvorming.

Gebruik sterktes. Ga naar de gewenste fase, vortex de cultuur grondig en breng 300 microliter over in microcentrifugebuisjes. Plaats voorzichtig een microliter con canna A in elk putje van de PDMS-putjeslaag.

Spoel overtollig conna A twee keer uit elk putje door voorzichtig water te pipetteren terwijl het con in A droogt. Was de stammen twee keer met 300 microliter SC-medium zonder glucose. Het wassen van restglucose van de celwanden helpt bij een goede hechting aan de conval.

Na het vortexen, pipet ongeveer 0,5 microliter van de celsuspensie in individuele putjes. Was voorzichtig restcellen weg met rijk medium. De volgende twee stappen moeten snel worden uitgevoerd om te voorkomen dat cellen uitdrogen.

Als optionele stap plasma, behandel de chip en de putjes voorzichtig zonder de putjes direct te raken. Plaats vervolgens onder een stereoscoop de chip voorzichtig op de putjes en let goed op de uitlijning tussen de twee. Druk voorzichtig om de twee PDMS-lagen te hechten.

Vul het apparaat langzaam volledig met ongeveer 50 microliter rijk medium, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het kanaal achterblijven. Verbind nu het apparaat door de buizen in de juiste ingangen te steken en start de mediastroom. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slangen ontstaan, omdat deze vast kunnen komen te zitten in het apparaat en de stroming kunnen verstoren.

Plaats het apparaat vervolgens onder een microscoop en zoek geschikte beeldvormingspunten in elk. Houd de cellen gedurende een uur of langer onder rijk mediumstroom, indien nodig. Om herstel mogelijk te maken.

Start het experiment met een constante stromingsinstellng. Pomp A naar 0,8 milliliter per uur en pomp B naar 0,2 milliliter per uur. Voor een medium dat over 80% van de breedte van het kanaal stroomt.

We kunnen de omstandigheden in het apparaat dynamisch veranderen door de relatieve stroomsnelheden te veranderen. De nieuwe omstandigheden stabiliseren binnen enkele seconden over de hele kanaal. Om de scheiding tussen verschillende stammen aan te tonen. Twee onderscheidbare gistsoorten worden in afwisselende putjes afgebeeld.

Merk op dat er in dit experiment geen cellek is tussen de putjes. Beide stammen hebben de transcriptiefactor MSN twee getagd met YFP om het gelijktijdige effect van dynamisch veranderende omstandigheden te testen. De stroomsnelheden in de twee ingangskanalen werden gewijzigd om een stap van geen glucosemedium te creëren