Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen
November 9th, 2012
We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.
Het algemene doel van de volgende methode is om het gedrag van enkele cellen van verschillende gistsoorten onder dezelfde dynamische omstandigheden te beeldhouwen. Dit wordt bereikt door een tweetlaags microfluïdisch apparaat te fabriceren, of de onderste laag zal elke van de verschillende soorten afzonderlijk bevatten, en de bovenste laag zal de dynamische stromingsomstandigheden als tweede stap bieden. Verschillende gistsoorten worden in de putjes geplaatst en het apparaat wordt gesloten, waardoor een enkele kanaal met meerdere gescheiden stammen ontstaat.
Vervolgens beelden we de celreacties op dynamische mediumveranderingen af. Door de stroomsnelheden in de twee ingangen van het Y-kanaal te regelen, tonen de resultaten verschillende stammen die aan dezelfde dynamische omstandigheden zijn onderworpen en geen kruisbesmetting tussen putjes. Dit microfluïdische apparaat heeft verschillende belangrijke voordelen boven andere bestaande systemen. Het maakt het mogelijk om meerdere verschillende stammen onder dezelfde dynamische omstandigheden te beeldhouwen.
Ook, belangrijk, het kan eenvoudig in elke laboratorium worden vervaardigd zonder speciale apparatuur nodig te hebben. De oorsprong van deze methode kwam uit een discussie over hoe de reacties van verschillende wilde Oost-isolaten op hongerpassages te volgen. Start, teken of print de gewenste microkanaal-indeling op schaal.
Bedek vervolgens een glazen plaat met lagen plakband. Om de gewenste hoogte van het kanaal te bereiken, plaats de lay-out op een vlakke ondergrond en lijn de plaat uit over het ontwerppatroon. Knip nu voorzichtig het plakband op de glazen plaat volgens het lay-out. Verwijder het plakband uit alle regio's van de glazen plaat.
Accepteer degenen in de lay-out van het microkanaal. Plaats de plaat gedurende drie minuten in een oven van 65 graden Celsius. Reinig vervolgens voorzichtig met ethanol.
Meng de basis en uithardende componenten van PDMS zoals aanbevolen door de fabrikant. Giet ongeveer 30 milliliter PDMS-mengsel in een petrischaal tot een hoogte van ongeveer 0,5 centimeter. Degas de PDMS in vacuüm indien nodig.
Dompel de glazen plaat in het PDMS met het patroon van het plakband naar boven. Het plaatsen van het patroon na het PDMS voorkomt de vorming van luchtbellen tussen de plaat en de schaal. Cure voor 48 uur bij 65 graden Celsius, zorg ervoor dat de schaal horizontaal is met behulp van een waterpas in een nieuwe 90 millimeter petrischaal. Giet drie milliliter PDMS-mengsel.
Deze stap kan worden uitgevoerd op een spin-codeerder indien beschikbaar. DGAs en cure zoals eerder getoond. Snijd nu voorzichtig de stromingslaag van het microfluïdische apparaat naar de gewenste grootte met een biopsiepons.
Maak gaten voor de ingangen en uitgangen in de stromingslaag. Knip ook een even grote putjeslaag uit de tweede petrischaal en plaats deze op een dikke glasplaat. Schuif over het ontwerplay-out.
Boor vervolgens putjes in uitlijning met de microkanalen op het lay-out met behulp van ethanol, reinig beide PDMS-lagen en een glazen deksel en laat het drogen. Behandel vervolgens het glazen deksel en de putjeslaag PDMS met een standaard plasma-etcher voor niet-omkeerbare binding of een handbediende corona-behandelaar voor omkeerbare binding. Plaats voorzichtig de putjeslaag op het deksel om hechting te veroorzaken.
Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen. Bereid het gewenste medium voor in geschikte spuiten en verbind deze met tigon-slangen die door een spuitpomp worden geleid. Voor celbeeldvorming.
Gebruik sterktes. Ga naar de gewenste fase, vortex de cultuur grondig en breng 300 microliter over in microcentrifugebuisjes. Plaats voorzichtig een microliter con canna A in elk putje van de PDMS-putjeslaag.
Spoel overtollig conna A twee keer uit elk putje door voorzichtig water te pipetteren terwijl het con in A droogt. Was de stammen twee keer met 300 microliter SC-medium zonder glucose. Het wassen van restglucose van de celwanden helpt bij een goede hechting aan de conval.
Na het vortexen, pipet ongeveer 0,5 microliter van de celsuspensie in individuele putjes. Was voorzichtig restcellen weg met rijk medium. De volgende twee stappen moeten snel worden uitgevoerd om te voorkomen dat cellen uitdrogen.
Als optionele stap plasma, behandel de chip en de putjes voorzichtig zonder de putjes direct te raken. Plaats vervolgens onder een stereoscoop de chip voorzichtig op de putjes en let goed op de uitlijning tussen de twee. Druk voorzichtig om de twee PDMS-lagen te hechten.
Vul het apparaat langzaam volledig met ongeveer 50 microliter rijk medium, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het kanaal achterblijven. Verbind nu het apparaat door de buizen in de juiste ingangen te steken en start de mediastroom. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slangen ontstaan, omdat deze vast kunnen komen te zitten in het apparaat en de stroming kunnen verstoren.
Plaats het apparaat vervolgens onder een microscoop en zoek geschikte beeldvormingspunten in elk. Houd de cellen gedurende een uur of langer onder rijk mediumstroom, indien nodig. Om herstel mogelijk te maken.
Start het experiment met een constante stromingsinstellng. Pomp A naar 0,8 milliliter per uur en pomp B naar 0,2 milliliter per uur. Voor een medium dat over 80% van de breedte van het kanaal stroomt.
We kunnen de omstandigheden in het apparaat dynamisch veranderen door de relatieve stroomsnelheden te veranderen. De nieuwe omstandigheden stabiliseren binnen enkele seconden over de hele kanaal. Om de scheiding tussen verschillende stammen aan te tonen. Twee onderscheidbare gistsoorten worden in afwisselende putjes afgebeeld.
Merk op dat er in dit experiment geen cellek is tussen de putjes. Beide stammen hebben de transcriptiefactor MSN twee getagd met YFP om het gelijktijdige effect van dynamisch veranderende omstandigheden te testen. De stroomsnelheden in de twee ingangskanalen werden gewijzigd om een stap van geen glucosemedium te creëren
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het beeldvormen van het gedrag van enkele gistcellen van verschillende stammen onder identieke dynamische omstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat. Het apparaat is ontworpen om kruisbesmetting te voorkomen terwijl het de observatie van meerdere stammen tegelijkertijd mogelijk maakt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluïdica
- Celbeeldvorming
- Gistbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van celgedrag onder dynamische omstandigheden is cruciaal voor verschillende biologische studies.
- Traditionele methoden vereisen vaak schone omgevingen en complexe fabricagetechnieken.
- Deze studie heeft tot doel het proces te vereenvoudigen terwijl de experimentele integriteit wordt gehandhaafd.
- Microfluïdische apparaten bieden nauwkeurige controle over de omgevingsomstandigheden voor celstudies.
Doel van studie
- Om een microfluïdisch apparaat te ontwikkelen dat beeldvorming van meerdere gistachtige stammen tegelijkertijd mogelijk maakt.
- Om dynamische stromingsomstandigheden toe te passen op verschillende stammen zonder kruisbesmetting.
- Om het begrip van gistachtige celresponsen op omgevingsveranderingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een tweedelige microfluïdisch apparaat.
- Plaatsing van verschillende gistachtige stammen in afzonderlijke putjes van het apparaat.
- Toepassing van dynamische stromingsomstandigheden door middel van gecontroleerde stromingssnelheden.
- Beeldvorming van celresponsen op mediumveranderingen.
Belangrijkste resultaten
- Het apparaat handhaafde met succes de scheiding tussen verschillende gistachtige stammen.
- Beeldvorming onthulde verschillende responsen van gistachtige stammen op dezelfde dynamische omstandigheden.
- De methode toonde voordelen ten opzichte van bestaande systemen in termen van eenvoud en effectiviteit.
- Er werd geen kruisbesmetting waargenomen tussen de putjes tijdens experimenten.
Conclusies
- Dit microfluïdische apparaat biedt een nieuwe aanpak voor het bestuderen van meerdere gistachtige stammen.
- De methode maakt gecontroleerde experimenten mogelijk zonder de noodzaak van complexe setups.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken naar andere celtypen en experimentele omstandigheden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Comparative analysis of multiple cell strains under identical dynamic conditions is critical for early discovery and target validation in biopharma R&D. This microfluidic device enables simultaneous, contamination-free imaging of distinct yeast strains, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking. Its accessible fabrication and dynamic control streamline workflows at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of cellular responses across multiple strains under controlled environmental shifts.
- Supports functional target validation by isolating strain-specific phenotypes in a shared dynamic context.
- Facilitates mechanistic de-risking by eliminating environmental variability as a confounder.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, contamination-free biological systems for downstream quantitative assays.
- Standardizes environmental exposure, enhancing reproducibility and assay reliability.
- Enables high-content imaging and multiplexed readouts for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental conditions for translational biomarker discovery when using disease-relevant yeast models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent dynamic perturbations.
- Reduces risk of false positives by ensuring environmental uniformity across strains.
Pipeline & Workflow Integration
This device integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling parallel, quantitative analysis of multiple strains under synchronized dynamic conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by controlling environmental variables across strains.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity when relevant to yeast-based disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, easily manufactured platform adaptable to diverse strain panels and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in comparative studies.
- Operational Value: Simplifies device fabrication and standardizes experimental setup across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling direct, quantitative strain comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying strain-specific responses under uniform conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic assembly and quantitative cell imaging.
- Needs access to basic PDMS fabrication tools and standard microscopy infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of environmental flow parameters.
- Adaptable to other model systems with similar size and adherence properties.
- Practical limitations include throughput constraints and manual alignment steps.
