Name: Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer hoe je een microfluïdische apparaat gebruikt om meerdere giststammen tegelijk te bestuderen onder identieke dynamische omstandigheden zonder kruisbesmetting. Deze methode maakt beeldvorming van enkele cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

YG wordt ondersteund door een beurs van IDB. IN is een Alon kerel en een faculteit fellow van de Edmond J ‭. ‬ Safra Centrum voor Bio-informatica van Tel Aviv University ‭. ‬ Dit onderzoek werd ondersteund door de ISF subsidie ​​1499/10.

1. Het creëren van een Scotch-tape Master 5 <ol><li> Teken of print de gewenste microkanaal lay-out, op schaal, op papier. In ons geval het ontwerp bestaat uit twee Y-vormige kanalen, elk 3 mm breed (figuur 2). </li><li> Bekleed een glazen schuif met lagen plakband. Het aantal lagen bepaalt de hoogte van het kanaal (ongeveer 60 pm per laag). We gebruikten 3 plakband lagen. </li><li> Plaats de lay-out ontwerp op een vlakke ondergrond. Lijn de schuif over het ontwerp patroon. Knip voorzichtig de tape op het glas dia met een scalpel volgens de lay-out. </li><li> Verwijder de Scotch tape van alle gebieden van het objectglaasje uitzondering in de layout van het microkanaal. </li><li> Plaats de dia in een verwarmingsoven bij 65 ° C gedurende 2-3 minuten. Reinig voorzichtig met ethanol. </li></ol> 2. Het vervaardigen van een PDMS microfluïdische apparaat <ol><li> Meng de base en de katalysator componenten van PDMS zoals aanbevolen door de fabrikant. We maken gebruik van een 10:1verhouding base tot verharder. Giet ongeveer 30 ml van PDMS mengsel in een petrischaal op een hoogte van 0,5 cm ~. Ontgas de PDMS in vacuum indien nodig. Dompel het glas dia in de PDMS met de patroon Scotch tape naar boven. Het plaatsen van de patroon na de PDMS voorkomt de vorming van luchtbellen tussen de dia en schotel bodem. Uitharden gedurende 48 uur bij 65 ° C, zonder dat de horizontale schaal is met een waterpas. </li><li> In een nieuwe 90 mm petrischaal pour 3 ml van PDMS mix resulteert in een laag van ongeveer 0,5 mm diep. (Als een spin coater beschikbaar is, kan worden gebruikt voor deze fase). </li><li> Degas en genezen als in 2.1. </li><li> Voorzichtig uitgesneden de microfluïdische apparaat op de gewenste grootte met een scalpel. Deze laag wordt aangeduid als de &quot;flow laag&quot;. </li><li> Knip een even groot stuk dunne laag PDMS van de tweede petrischaal. Dit wordt aangeduid als de &quot;putten laag&quot;. </li><li> Gebruik een geschikte grootte biopsie puncher (We gebruiken 1,2 mm ID) om punch gaten voor de in-en uitgangen in de stroom laag. </li&gt; <li> Plaats de putjes laag op een dikke glasplaatje de ontwerpopmaak en punch uit putten, met 2 mm ID biopsie puncher, in lijn met de microkanalen op de baan. </li><li> Reinig zowel PDMS lagen en een 24 mm x 60 mm glas dekglaasje met ethanol. Air-droog en schoon te houden. </li><li> Plasma behandelen zowel het glas dekglaasje en de putten laag PDMS gebruik van standaard-plasma etser (voor niet-omkeerbare binding) of een hand-held corona treater 6 voor omkeerbare binding. Plaats de wells laag bovenop het dekglaasje om de hechting veroorzaakt (figuur 3). Voorzichtig wrijf eventuele luchtbellen weg (indien nodig). </li></ol> 3. Cell Imaging Experiment <ol><li> Zorg ervoor dat u de gewenste media klaar in de juiste spuiten aangesloten op flexibele kunststof buizen met een inwendige diameter van 0,02 &quot;(Tygon) in de injectiepomp. </li><li> Grow S. cerevisiae stammen met de gewenste fase in vloeibare YPD. Vortex grondig en plaats 300 μl van elke stam in een microcentrifugebuis. </li><li> Plaats voorzichtig 1 pl concanavaline A (Sigma) 2 mg / ml in elk putje. Spoel de overtollige Concanavaline A uit elk putje twee keer door voorzichtig pipetteren water. </li><li> Terwijl de Concanavaline A droogt, tweemaal wassen stammen met 300 pl SC medium zonder glucose. Wassen resterende glucose uit de celwanden helpt een goede naleving van de Concanavaline A. </li><li> Vortex cellen grondig. Pipetteer 0,75 ul of minder van elke celsuspensie in zijn eigen bron (figuur 3). Voorzichtig wassen van resterende cellen met rijk medium. De volgende twee stappen snel moeten worden uitgevoerd om cellen te voorkomen uitdroogt. </li><li> Plasma behandelen de chip en de putten grondig met de hand-held corona treater, zorg dat u direct druk op de putten. Plaats de chip op de putten, met veel aandacht voor de afstemming tussen de twee (deze stap kan worden gedaan onder een stereoscoop). Druk voorzichtig op de twee lagen van de PD houdenMS. Langzaam volledig vullen van het apparaat met ongeveer 50 ul rijk medium, zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven in het kanaal. </li><li> Sluit het apparaat, het plaatsen van de buizen in de juiste ingangen en start media stromen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingevoerd in het apparaat als deze kan lastig te verwijderen, dit kan worden bereikt door het loskoppelen van een inlaat of uitlaat en zachtjes te tikken op het apparaat waar de bubbels zijn, zorg dat u het glas dekglaasje breken. </li><li> Plaats onder microscoop en passende imaging punten in elk putje. </li><li> Houd de cellen onder rijk medium-stroom voor 1 uur of langer naar herstel toe indien nodig. </li><li> Het experiment: we constante stroom van beide spuitpompen om terugstroming van de media te voorkomen veranderende relatieve stroomsnelheden zoals gewenst. Een pomp instelling tot 0,8 ml / uur en pomp B tot 0,2 ml / uur resulteert in medium A stroomt dan 80% van de breedte van het kanaal (figuur 4). Dit kan dynamisch worden copgehangen door het veranderen van de twee stromen. De nieuwe voorwaarden stabiliseren in seconden over de gehele lengte van het kanaal 2. </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit artikel presenteren we een eenvoudige benchtop methode voor het maken van een microfluïdische apparaat dat volgende verschillende giststammen tegelijkertijd laat onder dynamische omstandigheden. Na verscheidene stammen in een kanaal biedt een betrouwbaar instrument voor het vergelijken van de dynamiek van enkele cel responsen in multiple stammen. Een voordeel van onze aanpak is de mogelijkheid om de inrichting te fabriceren met eenvoudige technieken zonder een clean room. In feite hebben we ook uitgevoerd het pro...

Cellen worden voortdurend reageren op een dynamisch veranderende omgeving, door hun metabolisme transcriptionele profiel en celfuncties. Om deze fenomenen te bestuderen, zijn methoden die kunnen kwantificeren dergelijke veranderingen nodig zijn. Een soort uitlezing voor deze reacties is de verandering in de lokalisatie van stress gerelateerde transcriptiefactoren in reactie op voeding stress. Microfluïdische inrichtingen 1 zijn gebruikt om dynamisch omgevingsomstandigheden manipuleren om cellen 2-4. Ze vertonen vele voordelen voor beeldvorming van levende cellen: de omgeving van de cellen nauwkeurig worden gecontroleerd en dynamisch veranderd; cellen live-belichte te allen tijde, ook tijdens manipulatie van externe omstandigheden en minimale reagensvolumes vereist. Een zeer eenvoudige ontwerp voor een microfluïdische apparaat, waardoor afwisseling twee voorwaarden is een Y-vormige inrichting 2. We routinematig gebruik Y-vormige microfluïdische inrichtingen dietoepassing van dynamische veranderingen van de cellen in het kanaal. Wij gebruiken dit apparaat aan localisatie veranderingen van fluorescent gelabeld stress gerelateerde transcriptiefactoren in gistcellen te volgen. We volgen deze veranderingen onder veranderende nutritionele omstandigheden. Zo kunnen wij een puls (of pulstrein) van glucose-bevattend medium binnen no-glucose medium op een zeer fijne tijdsresolutie. Vaak in dergelijke experimenten is men geïnteresseerd in het vergelijken van de reacties van verschillende cellijnen (bijvoorbeeld verschillende mutanten, of verschillende wild isolaten). De Y-vormige goot is beperkt tot een stam in elk kanaal - indien meer dan een stam wordt gebruikt, is er geen eenvoudige manier om onderscheid te maken tussen de stammen. Om dit te ondervangen kunnen verschillende kanalen worden gebruikt. Als we willen dezelfde dynamiek voorwaarden gelden voor meerdere stammen, willen we de Y-kanalen in combinatie met meerdere kanalen. Er zijn twee uitdagingen in de uitvoering van deze oplossing: Het kan moeilijk zijn om t toe te passenhij dezelfde voorwaarden tegelijkertijd alle kanalen, en er is een geometrische beperking van het aantal Y-kanalen worden aangebracht in een apparaat. We waren dan ook op zoek naar een manier voor het bekijken van verschillende stammen in een kanaal onder dynamische omstandigheden. Hier beschrijven we een tweelaags microfluïdische apparaat voor beeldvorming meerdere stammen in een kanaal onder dezelfde dynamische omstandigheden. De onderste laag bestaat uit dunne PDMS met een rij gaten. Deze laag is aangebracht op de glazen dekglaasje maken putten waarin plaatsen wij de verschillende stammen, hechten ze met Concanavaline A het glas. De tweede laag is een Y-vormige microfluïdische apparaat gemaakt met de plakband methode 5. Nadat de stammen in de putjes de tweede laag snel uitgelijnd en bevestigd aan de eerste, waardoor een kanaal met meerdere putjes die de verschillende stammen bevatten. Deze laatste apparaat maakt na verscheidene stammen in een kanaal, waar allestammen aan dezelfde omstandigheden op hetzelfde moment. Het gehele ontwerp en productieproces kan de stationaire, met eenvoudige middelen, zonder zachte lithografie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> PDMS-Sylgard 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td></td></tr><tr><td> Vacuümexsiccator </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> Biopsie punchers </td><td> Ted Pella Inc </td><td> Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15.074 (1,2 mm) </td></tr><tr><td> Spuitenpompen </td><td> Chemyx </td><td> Fusion 200 </td></tr><tr><td> Corona treater </td><td> Electro-techniek producten </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tygon slangen </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Concanavaline-A </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> Plakband </td><td> 3M Scotch </td><td> Transparante Tape 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

De studie van cel responsen op de omgeving vormt vele experimentele problemen: cellen moeten worden afgebeeld onder wisselende omstandigheden, vaak als vergelijkend onderzoek. Putjes en worden routinematig gebruikt om vele verschillende stammen of cellijnen vergelijken, maar laat beperkte controle over de omgeving dynamiek. Microfluïdische apparaten, anderzijds, kunnen uitstekende dynamische controle over de omgevingsomstandigheden, maar het is moeilijk om te onderscheiden afbeelding en meer dan een paar stammen in hen. Hier beschrijven we een methode om gemakkelijk en snel produceren een microfluïdische inrichting kan toepassen dynamisch veranderende omstandigheden meerdere verschillende giststammen in een kanaal. De inrichting is ontworpen en vervaardigd door eenvoudige middelen zonder zachte lithografie. Het bestaat uit een Y-vormige stromingskanaal aan een tweede laag herbergt microwells. De stammen in aparte microwells, en afgebeeld onder exact dezelfde dynamische omstandigheden. We demonstrate het gebruik van de inrichting voor het meten van eiwit lokalisatie reacties op impulsen van voedingsstoffen veranderingen in verschillende giststammen.

Om de scheiding tussen de verschillende stammen demonstreren we twee onderscheidbare giststammen afgebeeld in alternatieve bronnen. Imaging volledige putjes vertoont geen lekkage tussen cell wells (Figuur 5a, b). Beide stammen hebben de transcriptiefactor MSN2 getagd met YFP. Om de gelijktijdige effect van dynamisch veranderende omstandigheden te testen, het debiet ingeschakeld in de twee ingangskanalen, waardoor een stap van no-glucose medium, die lokalisatie van MSN2-YFP geleid naar de kern (f...

We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

De studie naar celresponsen op veranderingen in de omgeving brengt veel experimentele uitdagingen met zich mee: cellen moeten worden gevisualiseerd onder veranderende omstandigheden, vaak in een ...

Het algemene doel van de volgende methode is om het gedrag van individuele cellen van verschillende giststammen onder dezelfde dynamische omstandigheden in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door het vervaardigen van een microfluïdisch apparaat met twee lagen, waarbij de onderste laag elke verschillende stam afzonderlijk bevat en de bovenste laag in een tweede stap de dynamische stroomcondities verzorgt. Verschillende giststammen worden in de putjes geplaatst en het apparaat wordt gesloten, waardoor een enkel kanaal met meerdere gescheiden stammen ontstaat.Vervolgens beelden we de cellulaire respons op dynamische mediumwijzigingen in. Door de stroomsnelheden in de twee ingangen van het Y-kanaal te regelen, tonen de resultaten verschillende stammen die aan dezelfde dynamische condities zijn blootgesteld, zonder kruiscontaminatie tussen de putjes. Dit microfluïdische apparaat biedt verschillende belangrijke voordelen ten opzichte van andere bestaande systemen. Het maakt het mogelijk om meerdere verschillende stammen onder dezelfde dynamische condities in beeld te brengen.Bovendien kan het eenvoudig in elk laboratorium worden geproduceerd zonder dat speciale apparatuur nodig is. Deze

a-microfluidic-device-for-studying-multiple-distinct-strains

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Source: Cabeen, M. T., et al. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates the use of a microfluidic device to observe bacterial growth at the single-cell level. It showcases how non-motile bacterial cells, confined within micro-scale trenches, are continuously nourished and imaged under a fluorescence microscope. The setup enables real-time visualization of cell division and lineage tracking across multiple generations.

Tracking Bacterial Growth at Single-Cell Resolution in a Microfluidic System

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Presenteren we een methode voor de analyse van de microfluidic van afzonderlijke bacteriële cel lineages met behulp van Bacillus subtilis als voorbeeld. De methode overwint tekortkomingen van de traditionele analysemethoden in microbiologie doordat observatie van honderden cel generaties strak controleerbaar en uniforme groei omstandigheden.

Eencellige Microfluidic analyse van Bacillus subtilis

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

We presenteren een protocol voor het millifluidische continue kweekapparaat (MCCD), waarmee bacteriële populaties onder constante omstandigheden met weinig nutriënten (tot honderden nanomolaire concentraties) of temporele nutriëntenfluctuaties op een minimale tijdschaal kunnen worden gekweekt.

Een continu kweek millifluidisch apparaat voor de studie van Escherichia coli onder lage en fluctuerende voedingsomstandigheden

Leer hoe je een microfluïdische apparaat gebruikt om meerdere giststammen tegelijk te bestuderen onder identieke dynamische omstandigheden zonder kruisbesmetting. Deze methode maakt beeldvorming van enkele cellen mogelijk.

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

Meer video's verkennen