Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de ontwikkeling bij muizen te onderzoeken door middel van flowcytometrie. Dit wordt bereikt door single-cel suspensies te bereiden uit de muis, thymus en milt. Als tweede stap worden de thymocyten en cellen gekleurd met een cocktail van antilichamen voor de identificatie van specifieke thy-populaties.

Uiteindelijk kunnen de frequentie en het aantal verschillende lymfocytpopulaties worden geëvalueerd door flowcytometrische analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over de ontwikkeling van T-cellen, zoals welke genen en paden belangrijk zijn voor het genereren van een functioneel maar celtolerant T-celrepertoire. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontwikkeling van T-cellen in de thymus, kan deze ook worden toegepast bij de onderzoek van de ontwikkeling van andere immuuncellen.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen met het ontwerpen van hun antilichaamcocktails voor flowcytometrie. Voordat u met de dissectie begint, plaatst u een steriel stalen gaasscherm in een 60 bij 15 millimeter petrischaal. Voeg vervolgens vijf milliliter HBSS toe aan de schaal en bewaar de schaal op ijs om de thymus te oogsten.

Gebruik eerst een tang om de onderkant van het borstbeen op te tillen en het middenrif te onthullen. Vervolgens, terwijl u de lever vermijdt, snijdt u het middenrif om het ribbenkast los te maken en snijdt u het ribbenkast vervolgens in een opwaartse richting aan beide zijden. Wees voorzichtig om de longen en het hart te vermijden.

Gebruik nu de tang om voorzichtig het ribbenkast naar achteren te trekken. De thymus is een wit, tweelobied orgaan dat zich boven het hart bevindt. Gebruik de platte rand van de tang om de onderkant van de lobben vast te grijpen.

Trek vervolgens voorzichtig de thymus eruit en plaats het op een van de eerder bereide gaasschermen. Om de milt te oogsten, maakt u een insnijding door het buikvlies om de buikholte bloot te leggen. De milt is een rood, surfboardvormig orgaan dat zich aan de linkerkant van de buikholte van de muis bevindt, onder de lever.

Gebruik vervolgens een tang om de milt eruit te trekken en een ander om het bindweefsel weg te scheuren. Plaats vervolgens de ontlede milt op een apart gaasscherm. Gebruik nu de zuiger van een drie milliliter spuit om elk orgaan in het gaasscherm te malen tot alleen bindweefsel en vet overblijven. Pipetteer de cellen en HBSS in een 15 milliliter kegelbuis.

Spoel vervolgens elk gaas drie keer met vers HBS. Pel de cellen vervolgens vijf minuten bij 335 keer G en vier graden Celsius. Na het afzuipen van de supernatant resus, suspendeert u de cyten in 500 microliter van een CK-lysebuffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur terwijl de splenische rode bloedcellen worden geleid Resus.

Suspendeer de thymocyten bij 20 keer 10 tot zes cellen per milliliter in faxbuffer en zet ze opzij op ijs. Voeg nu vijf milliliter HBSS toe om de cyten weer terug te brengen in isotonie na het weer naar beneden draaien van de cellen, resus suspendeert u het RBC-vrije pellet bij 20 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in faxbuffer. Begin deze stap door Ali Watting.

Vier keer 10 tot zes van de gereserveerde THYMOCYTEN per flowcytometriemonster in elk putje van een 96-wellsplaat. Voeg vervolgens cyten toe aan de putjes van een 96-wellsplaat voor compensatiecontroles. Blokkeer vervolgens de FC-receptoren in elk van de celmonsters door incubatie met anti-CD 1632 gedurende 10 minuten op ijs.

Spin vervolgens de plaat naar beneden en verwijder het vocht uit de putjes door de plaat eenmaal met de achterkant naar beneden in een spoelbak te slaan, en suspendeer vervolgens elk putje in 200 microliter faxbuffer en herhaal de wassing. Incubeer vervolgens de experimentele monsters met 200 microliter antilichaamcocktail of enkele fluorochroomgeconjugeerde antilichamen voor de compensatiecontroles. Alles in faxbuffer op ijs in het donker.

Na 30 minuten, was de cellen twee keer met faxbuffer en breng de monsters vervolgens naar faxbuizen in fysiologische TCR-transgene modellen en wild-type muizen. Positieve selectie begint in de dubbelpositieve heldere fase voordat deze overgaat in de dubbelpositieve doffe fase. Na de aanraking met antigeen gaan de dubbelpositieve doffe thymocyten over in een overgangs-CD vier positieve CD acht lage fase voordat ze CD vier worden.

Een positieve of CD acht enkele positieve thymocyten volwassen enkele positieve thymocyten worden gekenmerkt door hun hoge TCR-expressie en verlies van CD 24. Terwijl het CD acht door CD vier-profiel defecten in positieve selectie kan onthullen, kan het onderzoek van TCR beta door CD 69 of CD vijf verdere inzicht geven in waar het defect ligt. Zowel CD 69 als CD vijf worden opgereguleerd na TCR-stimulatie met sterkere interacties die een hogere expressie van deze markers aandrijven.

In dit TCR beta door CD 69-plot in een wild-type muis vertegenwoordigt de TCR R beta lage CD 69 negatieve gang een populatie van preselectie dubbelpositieve thymocyten. Terwijl deze TCR beta tussenliggende CD 69 positieve gang een overgangspopulatie direct na TCR-betrokkenheid vertegenwoordigt en bestaat uit dubbelpositief helder met enkele dubbelpositieve doffe en CD vier positieve CD acht lage cellen. Hier illustreert de TCR R beta hoge CD 69 positieve gang de populatie cellen direct na positieve selectie, die bestaat uit dubbelpositieve doffe CD vier positieve, CD acht lage en CD vier enkele positieve cellen.

Ten slotte toont deze TCR beta hoge CD 69 negatieve gang een meer volwassen populatie cellen die voornamelijk bestaat uit CD vier en CD acht enkele positieve cellen. Het ontbreken van de TCR R beta tussenliggende CD 69 positieve en TCR R beta hoge CD 69 positieve populaties kan wijzen op verminderde positieve selectie veranderingen in de verhouding van de CD vier enkele positieve tot CD acht. Enkele positieve cellen binnen de TCR beta hoge CD 69 negatieve populatie kunnen wijzen op veranderingen in lijncommissie.

Het verlies van de TCR beta