Name: Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Leer flowcytometrie voor T-celontwikkeling in de thymus met genetisch gemanipuleerde muizen. Deze methode identificeert lymfocytenpopulaties en onthult kritieke genen voor het immuunsysteem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Bing Zhang bedanken voor zijn technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB is een CIHR New Investigator en AHFMR Scholar. QH wordt ondersteund door een CIHR Canada Graduate Scholarship - Doctoral en een AIHS Voltijds studententijd. SAN wordt ondersteund door een Koningin Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS wordt ondersteund door een NSERC Postgraduate Scholarship - Doctoral.

Zie Figuur 1 voor een algemene regeling van het experimentele protocol. 1. Ontleding <ol><li> Plaats steriele stalen gaas scherm in 60 x 15 mm petrischaal. Een eenheid nodig per weefselmonster. </li><li> Voeg 5 ml gebalanceerde zoutoplossing Hank&#39;s (HBSS) bij elk gerecht. Houd gerechten op ijs. </li><li> Euthanaseren muizen met CO 2. </li><li> Secure muis om dissectie oppervlakte, ventrale zijde naar boven. Spray muis met 70% ethanol voor sterilisatie en dat de vacht is gematteerd beneden. </li><li> Met behulp van chirurgische schaar, beginnen dissectie door het maken van een ventrale incisie in de buik huid net boven de genitaliën. Verleng de incisie omhoog naar de kin. </li><li> Vanaf de middellijn, uitbreiding van de incisie langs alle ledematen. Trek de losse huid en speld het vast aan de dissectie oppervlak. </li><li> Oogst de thymus: <ol><li> Til de onderste punt van het borstbeen tot een incisie te maken.</li><li> Het vermijden van de lever, snijd het membraan aan de ribbenkast vervolgens los en snijd de ribbenkast aan elke kant. Snijd de ribbenkast naar boven aan elke kant, zorg ervoor dat de longen en het hart te voorkomen. </li><li> Trek voorzichtig aan de ribbenkast terug met een pincet. De thymus is een witte, bilobed orgel boven het hart. Met de platte rand van de forceps naar de bodem van de lobben bevatten, trek de thymus en plaats het op het gaas. </li></ol></li><li> Oogst de milt: <ol><li> De milt is een rode, surfplank-vormige orgaan in de linkerkant van de abdominale holte muis, onder de lever. </li><li> Maak een insnijding in de buikholte. Trek de milt met een pincet, met behulp van het tweede paar te plagen weg bindweefsel. Plaats de milt op een apart mesh zeef. </li></ol></li></ol> 2. Celpreparaat <ol><li> Met behulp van een zuiger van een 3 ml spuit-, slijp-organen in de maas scherm totdat alleen het bindweefsel en vet resten. Spoel mesh met HBSS van de schaal driemaal. Gebruik een nieuwe zuiger voor elke weefselmonster. <ol><li> Andere opties voor homogeniseren weefsel kan worden gebruikt in plaats van deze methode. </li></ol></li><li> Tellen cellen met een hemocytometer. </li><li> Pellet cellen door centrifugatie bij 335 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer splenocyten in 500 pi ACK lysis buffer (0,15 M NH4CI, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Resuspendeer thymocyten op 20 x 10 6 cellen / ml in FACS buffer (PBS, 1% FCS, 0,02% natriumazide) en vernietigd op ijs. </li><li> Terug splenocyten tot isotoniciteit door toevoeging van 5 ml HBSS. Pellet splenocyten door centrifugeren en resuspendeer in 20 x 10 6 cellen / ml in FACS buffer. Als cellen nodig hebben om te blijven steriel, kunt u gebruik maken steriele RPMI + 10% FCS. </li></ol> 3.Kleurende cellen voor flowcytometrie Het doel van dit protocol is het schetsen strategieën voor de analyse van positieve en negatieve selectie met wildtype (WT) en HY CD4 muizen. Voor algemene overwegingen met betrekking tot flowcytometrie experimenteel ontwerp, de aankoop, en analyse, verwijzen we de lezers om een uitstekende beoordeling door Tung et al. 11. <ol><li> Aliquot 4 x 10 6 thymocyten per flowcytometrie monster aan elk putje van een 96-well plaat, en 1 x 10 6 WT splenocyten per compensatie. Bij gebruik van transgene muizen, moet u een WT muis op te nemen als een controle in uw experiment. </li><li> Fc-receptoren blokkeren door incubatie cellen met anti-CD16/32 (kloon 2.4G2) gedurende 10 min op ijs. </li><li> Spin plaat bij 335 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het deksel en verdrijven vloeistof uit putten door de knop van de plaat een keer, gezicht naar beneden in een gootsteen. Resuspendeer elk putje in 200 ul FACS buffer. Herhaal de was. </li><li> Bereid antilichaam cocktails zoals hieronder vermeld, met de optimale concentratie van elk antilichaam gebaseerd op verdunning in 200 ul FACS buffer per well. De optimale concentratie van elk antilichaam wordt gedefinieerd als de laagste concentratie die nodig is om de grootste scheiding van positieve en negatieve populaties geven. Als er geen negatieve populatie van een bepaald antilichaam moet een isotype antilichaam worden opgenomen. Het totale volume per goed kan omlaag geschaald worden (bijv. 100 ul per putje) indien gewenst. <ol><li> WT thymus: anti-TcR, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 of anti-CD5, anti-CD24 </li><li> HY CD4 thymus: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 of anti-CD5, anti-CD24 Betere scheiding van CD69 en CD69 hi lo populaties in thymocyten verkrijgen, wordt aanbevolen dat een gebiotinyleerd anti-CD69 primair antilichaam gebruikt, gevolgd door een secundaire kleuring met fluorochroom-geconjugeerde streptavidine. We Ùse dezelfde strategie voor CD5 kleuring. </li></ol></li><li> Incubeer cellen met 200 pi antilichaam cocktail in FACS buffer gedurende 30 min op ijs in het donker. </li><li> Gelijktijdig met antilichaam cocktail vlekken, vlek elk compensatieregeling, met een enkele fluorochroom-geconjugeerd antilichaam. Idealiter compensatie kleuring omvat dezelfde antilichamen in de antilichaam cocktail. Echter kan kleuring voor elk antigen niet haalbaar voor grotere experimenten bij vele antigenen worden getest. Daarom wordt kleuring voor zowel anti-CD4 of anti-CD8 vanwege de hoge expressie van deze antigenen, of het gebruik van compensatie kralen aanbevolen. Vlek in FACS buffer gedurende 30 min op ijs in het donker. Laat een compensatieregeling, ongekleurd. </li><li> Was tweemaal cellen met FACS buffer. </li><li> Resuspendeer cellen in FACS buffer en transfer naar FACS buizen. </li><li> Acquire monsters op flowcytometer. Inclusief aankoop van FSC-A en FSC-W om eenlg voor doublet discriminatie. </li></ol> 4. Analyse van Flowcytometrie gegevens - Niet-TCR transgene muizen We gebruiken FlowJo voor flowcytometrie analyse. Zie Figuur 2A de gating strategie voor niet-TCR transgene muizen. <ol><li> Met behulp van FSC-A door het SSC, elektronisch hek aan de &quot;lymfocyt &#39;bevolking. </li><li> Binnen de &quot;lymfocyt&quot; bevolking, gebruik FSC-A door FSC-W om elektronisch hek van de FSC-W lo bevolking naar cel wambuizen en aggregaten van het uit te sluiten. Dit is de &quot;singlet&quot; gate. </li><li> Met behulp van de gebeurtenissen in de &quot;singlet&quot; gate, plot CD8 door CD4. Teken poorten voor DN, DP saai, DP heldere, CD4 + CD8 lo, CD4SP en CD8SP populaties zoals weergegeven in figuur 2B. </li><li> Onder de CD4SP en CD8SP poorten, maakt u TcR door CD24 percelen. Gebruik het kwadrant gating tool om poorten te trekken zoals afgebeeld in figuur 2C. </li><li> Maak een new plot van de &quot;singlet&quot; gate: TcR door CD69. Tekenen poorten A, B, C, D zoals in figuur 2D. </li><li> Maak nog een plot van de &quot;singlet&quot; gate: TcR door CD5. Tekenen poorten i, ii, iii, iv zoals in figuur 2E. Dit is een andere strategie voor de behandeling van positieve selectie. </li><li> Breng DN, DP saai, DP heldere, CD4 int, CD4SP en CD8SP poorten onder &quot;singlet&quot; om poorten i, ii, iii, iv, A, B, C, D (figuur 2D, E). </li><li> Bereken het aantal cellen in een bepaalde subset door vermenigvuldiging orgel cellulariteit door de frequentie van elke volgende poort totdat u uw doelgroep. Bijvoorbeeld het aantal TcR hi-CD69 CD8SP thymocyten wordt bepaald door thymus cellulariteit x% TCR BHI-CD69 (fractie D) x% CD8SP. <ol><li> Tellen wordt reeds rekening gehouden met de levende en dode cellen dus niet de &quot;lymphocyte &quot;poort in uw berekeningen. </li></ol></li></ol> 5. Analyse van Flowcytometrie gegevens - TCR transgene muizen Zie figuur 3A de gating strategie voor TCR transgene muizen. <ol><li> Volg de stappen 4.1 en 4.2 zoals in de vorige paragraaf. </li><li> Onder de &quot;singlet&quot; poort, maakt u een T3.70 door SSC plot en hek aan de T3.70 + celpopulatie om antigeen-specifieke T-cellen (Figuur 3B) te analyseren. In sommige gevallen kan het van belang zijn deze populatie vergelijken met de non-specifieke antigen (T3.70-) T celpopulatie. </li><li> Binnen de T3.70 + bevolking, tekenen DN, DP, CD4SP en CD8SP poorten (Figuur 3C). <ol><li> Voor WT controlemonsters, trekken deze poorten onder de &quot;singlet&quot; gate of maak een T3.70-poort omdat er maar weinig T3.70 + cellen. </li></ol></li><li> Onder de CD8SP poort, maakt u eenT3.70 door CD24 plot. Gebruik het kwadrant gating tool om cellen te verdelen in vier populaties (Figuur 3F). </li><li> Een overlay histogram dat CD69 expressie in de DP compartiment van WT muizen en T3.70 + DP compartiment van HY cd4 muizen (Figuur 4A). Herhaal dit om CD5-expressie (Figuur 4B) te onderzoeken. </li><li> Bereken het absolute aantal cellen in elke subset plaats als in 4.8. </li></ol>

<ol><li>Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire+regulates+negative+selection+of+organ-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire regulates negative selection of organ-specific T cells.</a> Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).</li>
<li>Liston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage--limiting+role+of+Aire+in+thymic+expression%2C+clonal+deletion%2C+and+organ-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).</li>
<li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+learning+self-control+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).</li>
<li>Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+association+of+partial+T-cell+immunodeficiency+and+immune+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+what+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: what have we learned from mice.</a> Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).</li>
<li>Zhan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Without+peripheral+interference%2C+thymic+deletion+is+mediated+in+a+cohort+of+double-positive+cells+without+classical+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).</li>
<li>Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+apoptosis+induced+by+T+cell+activation+is+mediated+by+glucocorticoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo.</a> J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).</li>
<li>Martin, S., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+and+nonspecific+deletion+of+immature+cortical+thymocytes+caused+by+antigen+injection%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection.</a> European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).</li>
<li>Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+TCR+alpha+expression+critically+influences+T+cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection.</a> J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).</li>
<li>Tung, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+laboratory+medicine%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).</li>
<li>Aliahmad, P., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+all+CD4+T+lineages+requires+nuclear+factor+TOX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX.</a> J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).</li>
<li>Kastner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11b+represses+a+mature+T-cell+gene+expression+program+in+immature+CD4%28%2B%29CD8%28%2B%29+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes.</a> Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).</li>
<li>Albu, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL11B+is+required+for+positive+selection+and+survival+of+double-positive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes.</a> J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).</li>
<li>Van De Wiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytes+between+the+beta-selection+and+positive+selection+checkpoints+are+nonresponsive+to+IL-7+as+assessed+by+STAT-5+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation.</a> J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).</li>
<li>Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+signals+are+essential+for+cortex-medulla+migration+of+developing+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes.</a> J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).</li>
<li>Saini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science signaling. 3, ra23(2010).</li>
<li>Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bim-mediated+apoptosis+is+not+necessary+for+thymic+negative+selection+to+ubiquitous+self-antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens.</a> J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).</li>
<li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4%2B8%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).</li>
<li>Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7-mediated+migration+of+developing+thymocytes+to+the+medulla+is+essential+for+negative+selection+to+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).</li>
<li>Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+negative+selection+on+the+T+cell+repertoire+reactive+to+a+self-peptide%3A+a+large+fraction+of+T+cell+clones+escapes+clonal+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion.</a> Immunity. 13, 829-840 (2000).</li>
<li>Gallegos, A. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance+to+tissue-specific+antigens+mediated+by+direct+and+indirect+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation.</a> J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Bouillet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+Bcl-2+family+member+Bim+is+required+for+apoptosis+of+autoreactive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes.</a> Nature. 415, 922-926 (2002).</li>
<li>Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+protein+Bim+is+differentially+required+during+thymic+clonal+deletion+to+ubiquitous+versus+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+orphan+steroid+receptor+Nur77+in+apoptosis+accompanying+antigen-induced+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection.</a> Immunity. 3, 273-282 (1995).</li>
<li>Zhou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Nur77%2FNurr1+leads+to+inefficient+clonal+deletion+of+self-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells.</a> J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).</li>
<li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie in niet-transgene en TCR TCR transgene muizen onderzocht. Dit protocol beschrijft de kleuring van oppervlakte-antigenen. Voor verdere analyse van moleculaire mechanismen, is het vaak noodzakelijk om intracellulaire kleuring uitgevoerd. We maken gebruik van de BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit voor de meeste intracellulaire eiwitten en de BD Biosciences Foxp3 Staining Kit voor transcriptiefactoren. We meestal verkrijgen onze monste...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Gebalanceerde zout HyClone Hank&#39;s oplossing </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Metalen gaas schermen </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen (60 x 15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> Spuiten (3 ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> Conische buizen (15 ml) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Zeiss - Primo Star </td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> HausserWetenschappelijk </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well plaat </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> Meerkanaalspipet </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalfsserum </td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> IT Baker Chemical Co </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FcR blokkerend reagens </td><td></td><td></td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-muis HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-JJ * </td><td> Clone T3.70 </td></tr><tr><td> Anti-muis CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-JJ * </td><td> Kloon RM4-5 </td></tr><tr><td> Eennti-muis CD8a </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-JJ * </td><td> Clone 53-6,7 </td></tr><tr><td> Anti-muis CD24 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-JJ * </td><td> Clone M1/69 </td></tr><tr><td> Anti-muis TcR </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-JJ * </td><td> Clone H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-muis CD69 Gebiotinyleerd </td><td> eBioscience </td><td> 13 tot 0691-JJ * </td><td> Clone H1.2F3 </td></tr><tr><td> Anti-muis CD5 Gebiotinyleerd </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-JJ * </td><td> Clone 53-7,3 </td></tr><tr><td> Streptavidine </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-JJ * </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Biosciences - FACS Canto </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS buisjes </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometrieanalyse software </td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * XX is afhankelijk van het fluorochroom en YY verschilt per flacon grootte. </td></tr></tbody></table>

onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Een gezond immuunsysteem vereist dat T-cellen reageren op vreemde antigenen, terwijl de resterende tolerant voor zelf-antigenen. Willekeurige herschikking van de T cel receptor (TCR) α en β loci genereert een T cel repertoire met enorme diversiteit in antigeenspecificiteit, zowel zelf als buitenlandse. Selectie van het repertoire tijdens de ontwikkeling in de thymus is cruciaal voor het genereren veilige en nuttige T-cellen. Defecten in thymus selectie bijdragen tot de ontwikkeling van auto-en immunodeficiëntie aandoeningen 1-4. T cel voorlopers voer de thymus als dubbele negatieve (DN) thymocyten die geen expressie CD4 of CD8 coreceptoren. Expressie van het αβTCR en beide co-receptoren optreedt bij de dubbele positieve (DP) podium. Interactie van de αβTCR met zelf-peptide-MHC (pMHC) door thymus cellen bepaalt het lot van de DP thymocyten. Hoge affiniteit interacties leiden tot negatieve selectie en opheffingtie van zelfontledende thymocyten. Lage affiniteit interacties resulteren in positieve selectie en ontwikkeling van CD4 of CD8 enkele positieve (SP) T-cellen herkent vreemde antigenen gepresenteerd door zelf-MHC 5. Positieve selectie kan worden onderzocht in muizen met een polyklonaal (wildtype) TCR repertoire door het observeren van de generatie van rijpe T-cellen. Zij zijn echter niet geschikt voor de studie van negatieve selectie, die kleine deletie van antigeen-specifieke populaties omvat. Veel modelsystemen zijn gebruikt om negatieve selectie bestuderen maar in hun vermogen om vatten fysiologische gebeurtenissen 6 verschillen. Bijvoorbeeld, in vitro stimulatie van thymocyten mist de thymus omgeving die nauw betrokken is bij selectie, terwijl toediening van exogeen antigen kan leiden tot niet-specifieke deletie van thymocyten 7-9. Op dit moment, de beste tools voor het bestuderen van in vivo negatieve selectie zijn muizen die een transg drukkenENIC TCR specifiek voor endogene zelf-antigeen. Echter, veel klassieke TCR transgene modellen gekenmerkt door premature expressie van het transgene TCRα ketting aan de DN, resulterend in premature negatieve selectie. Ons laboratorium ontwikkelde de HY cd4 model, waarbij de transgene HY TCRα voorwaardelijk wordt aan het DP stadium, waardoor negatieve selectie in de DP optreden SP overgang zoals bij wildtype muizen 10. Hier beschrijven we een flowcytometrie-based protocol thymus positieve en negatieve selectie onderzoeken de HY cd4 muismodel. Terwijl negatieve selectie in HY CD4 muizen zeer fysiologische Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere TCR transgene modellen. We brengen u ook algemene strategieën voor het analyseren van positieve selectie in een polyklonaal repertoire van toepassing op alle genetisch gemanipuleerde muizen.

In fysiologische TCR transgene modellen en WT muizen, positieve selectie begint bij de DP heldere stadium vóór het verplaatsen in de DP saaie fase na antigen tegenkomen. DP dof thymocyten voer vervolgens een overgangsperiode CD4 + CD8 lo fase voordat hij CD4SP of CD8SP thymocyten (Figuur 2B). Rijpe thymocyten SP worden gekenmerkt door hoge TCR expressie en verlies van CD24 (Figuur 2C). Terwijl de CD8 door CD4 profiel kan defecten op...

We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling onderzocht<em&gt; In vivo</em&gt; Behulp van genetisch gemanipuleerde muizen op een wildtype of T-celreceptor transgene achtergrond.

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

Een gezond immuunsysteem vereist dat T-cellen reageren op vreemde antigenen, terwijl ze tolerant blijven voor eigen antigenen. Willekeurige herschikking van de T-cel...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de ontwikkeling van de thymus bij muizen te onderzoeken middels flowcytometrie. Dit wordt bereikt door enkelcellussies voor te bereiden uit de thymus en milt van de muis. Als tweede stap worden de thymocyten en splenocyten gekleurd met een cocktail van antilichamen voor de identificatie van specifieke thymuspopulaties.Uiteindelijk kunnen de frequentie en het aantal van diverse lymfocytenpopulaties worden geëvalueerd via flowcytometrische analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de T-celontwikkeling, zoals welke genen en signaalpaden belangrijk zijn voor het genereren van een functioneel maar celtolerant T-celrepertoire. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de T-celontwikkeling in de thymus, kan ze ook worden toegepast bij het onderzoek naar de ontwikkeling van andere immuuncellen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het ontwerp van hun antilichaamcocktails voor flowcytometrie. Plaats voor aanvang van de dissectie een steriel stalen gaaszeefje in een Petrischaal van 60 bij 15 millimeter. Voeg vervolgens vijf milliliters HBSS aan de schaal toe en be

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a flow cytometry-based technique using two fluorochromes to identify CD4+ and CD8+ T cells, γδ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and monocytes in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Upon incubating the cells with fluorochrome-conjugated antibodies against the surface markers, the cell subsets are identified using an optimal flow cytometric gating strategy.

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Het blootgestelde normale oculaire oppervlak bestaat uit hoornvlies en conjunctiva. Epitheliale cellen, spekcellen en immuuncellen zijn aanwezig in de conjunctiva. Hier wordt een niet-invasieve techniek van impressie cytologie beschreven met behulp van een impressie cytologie apparaat en flow cytometrie om immuuncellen in de conjunctiva te analyseren.

Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

Hier, een protocol voor de isolatie en de karakterisering van CD4+ T-cel subsets van menselijke perifeer bloed wordt beschreven. CD4 gezuiverd+ T-cellen worden geanalyseerd door stroom cytometry om te bepalen van de verhoudingen van T-folliculaire helper cel subsets.

Isolatie van CD4+ T-cellen en analyse van de circulerende T-folliculaire Helper (cTfh) cel Subsets van 6-kleur met behulp van perifere bloed stroom Cytometry

Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.

Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie van dubbelnegatieve thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuursysteem (OP9-DL4) voor verdere functionele analyse.

Co-cultuur en transductie van murine thymocyten op delta-achtige 4-tot expressie brengende stromale cellen om oncogenen in T-cel leukemie te bestuderen

We beschrijven protocollen voor de voorbereiding van een enkele cel suspensie van epitheliale cellen uit de thymus van muizen en de kleuring van intracellulaire moleculen voor flowcytometrische analyse.

Bereiding van een enkele cel suspensie van epitheliale cellen uit de thymus van muizen en kleuring van intracellulaire moleculen voor analyse met flowcytometrie

Leer flowcytometrie voor T-celontwikkeling in de thymus met genetisch gemanipuleerde muizen. Deze methode identificeert lymfocytenpopulaties en onthult kritieke genen voor het immuunsysteem.

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

Meer video's verkennen