Name: 3-Dimensionale kunstharsproducten en beeldvorming van de muis Portal Vein of Intrahepatische Bile Duct System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer een kunstharsgiettechniek voor driedimensionale visualisatie van het portaalvene- of intrahepatische galwegsysteem bij muizen. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van vasculaire architectuur mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) voor SSH (R01-DK078640), van het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) door de HHMI / Vanderbilt University Certificate Program in Molecular Medicine aan TJW (GRDOT56006779), de Vanderbilt Diabetes Research en Training Center (P30-DK020593) en de Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) het verstrekken van Core Services.

1. Bereid canule <ol><li> Verwarm een ​​1-inch lange sectie van PE10 slang met uw vingertoppen en zo uitrekken dat de slang dun wordt. Let op: de grootte van het vat of kanaal te worden voorzien van een canule zal de mate van uitrekken nodig vast te stellen. De canule moet goed gespannen voor galgang werpt, maar kan alleen worden verlangd tot matig worden uitgerekt om te passen binnen het grotere poortader. </li><li> Snijd de gestrekte buis bij een diagonaal een afgeschuinde punt genereren. </li><li> Snijd de andere rand van de slang aan een 5-6 inch segment te maken. </li><li> Plaats een 32 gauge, ½ inch injectienaald in de niet-schuine rand van de buis. </li></ol> 2. Bereid Spuit met PBS <ol><li> Vul een 3 ml spuit met PBS. </li><li> Draai de spuit op de injectienaald met bijgevoegde getrokken PE10 leidingen eerder is bereid. </li><li> Flick spuit en druk zuiger dat PBS zorgen heeft vulde de naald en leidingen ener geen luchtbellen in de spuit. </li><li> Plaats de voorbereide injectiespuit met PBS in een spuit-houder gevormd uit klei. Deze houder zal de spuit stabiel, terwijl de buis wordt ingebracht in het kanaal. </li></ol> 3. Andere Set-up <ol><li> Weeg 0,1 g katalysator in een kleine container, bijvoorbeeld een putje van een plaat met 24 putjes. </li><li> Trek 1 ml hars in een 3 ml spuit. Opmerking: relatieve hoeveelheden katalysator en hars worden aangepast uithardingstijd veranderen. Afnemende hoeveelheid katalysator kan echter verhogen gegoten krimp en leiden tot een minder gewenst gegoten. Let op: bij het ​​hanteren van hars, voorzorgsmaatregelen treffen om contact te vermijden met hars of inademing van de dampen hars. Draag altijd handschoenen en voert u de stappen met hars in een goed geventileerde ruimte, zoals een chemische dampkap </li><li> Snijd een stuk van 5,0 zijden hechtdraad van ongeveer 5 cm worden gebruikt als een ligatuur. </li></ol> 4. Bereid Mouse <ol&gt; <li> Offer volwassen muis. Leg de muis op zijn rug en open de buikholte. </li><li> Leg de muis op het ontleden scope platform. Loodrecht Plaats een 15 ml conische buis onder de muis zichtbaarheid en bereikbaarheid van de lever. </li><li> Bevochtig een wattenstaafje met PBS en gebruik deze om de lever draaien naar boven en weg van u naar de dorsaal aanzicht van de lever, samen met de extrahepatische poortader of galbuis bloot te leggen. </li><li> Voor poortader afgietsels, kunt u voorkomen dat de bloedstolling door het spoelen van de ader met kamertemperatuur PBS. Bevestig een naald aan een 3 ml spuit gevuld met PBS en steek de naald in de extrahepatische poortader zo ver van de lever als je kunt. Duw PBS door in de poortader. Maak een inkeping in de gemeenschappelijke hoofdader om bloed af te tappen. Gebruik een natte wattenstaafje om massage lever, het verbeteren van het bloed drainage. Deze stap is niet aanbevolen voor de galwegen en niet noodzakelijk voor alle vaten. Opmerking: deze stap kan ook perfoEurosysteem bevestigde met 4% paraformaldehyde in plaats van PBS. Gebruik van 4% paraformaldehyde kan toenemen vasculaire integriteit en resulteren in een meer nauwkeurige cast, met name kleinere vasculaire structuren. </li></ol> 5. Canule Extrahepatisch Portal ader of galwegen <ol><li> Gebruik gebogen tang om de chirurgische hechtdraad ligatuur passeren onder de poortader of galwegen, ongeveer ¼ inch uit de lever. </li><li> Bind de hechtdraad in een losse gemeenschappelijke knoop. Draai de knoop. </li><li> Als u werkt met een open systeem, kan het nuttig zijn om te binden en een ligatuur draai aan de andere kant van het systeem. Als u hebt geopend de gemeenschappelijke hoofdader om het bloed afvoer van de poortader, das een ligatuur omheen om de druk te verhogen in de poortader en hars lekkage te voorkomen in de centrale hepatische ader. </li><li> Gebruik de lente schaar om een ​​klein sneetje in de poortader of galwegen, ongeveer ¼ inch onder de hechtdraad knoop te maken. Dit cut moeten dringen niet meer dan halverwege de diameter van de poortader of galgang. </li><li> Met # 5 forceps, houdt de poortader of galgang op de plaats van de snede en steek afgeschuinde uiteinde van de slang in de galwegen. </li><li> Duw tip van buizen langs de pre-gebonden ligatuur en naar de lever. </li><li> Test voor canulatie nauwkeurigheid door het injecteren van PBS door de canule en kijken om te zien of het komt in de poortader of galgang. </li><li> Draai de ligatuur om de canule op zijn plaats. </li></ol> 6. Resin Cast de poortader of Intrahepatische Bile Duct <ol><li> Voeg pre-gemeten 1 ml hars voor uw gemeten 0,1 g katalysator en meng. Vermijd het genereren van luchtbellen. </li><li> Terug te trekken met hars katalysator mengsel in de 3 ml spuit. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig vegen de spuit en het verdrijven van bubbels. Opmerking: voor het gieten kleine structuren, kan het nuttig zijn om een vacuümkamer gebruiken om zeer kleine luchtbellen uit the hars en verbeteren cast kwaliteit. Om de tijd tot deze stap uit te voeren, is het noodzakelijk om de katalysator / hars verhouding van die hierboven voorgestelde om uitharding vertragen hars verlagen. </li><li> Plaats voorzichtig PBS bevattende spuit met hars bevattende spuit, waarbij de 32 gauge naald bevestigd aan de canule. </li><li> Langzaam en duw hars in de poortader of galgang tot weerstand neemt toe en de lever is gevuld. </li><li> Gebruik nat wattenstaafje zachtjes masseren lever en een nog te vullen aan te moedigen. </li><li> Verwijder de canule van de structuur en snel draai de ligatuur aan hars lekkage te voorkomen. </li><li> Laat de muis om plat bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten terwijl de hars uithardt en verwijder lever. </li><li> Ga met ofwel het opruimen of macereren de lever. </li></ol> 7. Clear Lever voor visualisatie in situ <ol><li> Bevestig de lever in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C, rocking. </li><li> Was de leverin PBS gedurende ten minste vier uur, schudden. Op dit punt, kunt u scheiden van de lever lobben indien gewenst. </li><li> Drogen in 50% methanol en vervolgens in 100% methanol gedurende ten minste vier uur elk, schommelen bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de lever in een 1:2 oplossing van benzylalcohol en benzylbenzoaat (BABB) gedurende ten minste 24 uur, schudden. Langere wastijden nodig zijn. Als de lever niet verdwijnt volledig na 2-3 dagen, terug te gaan naar 100% methanol gedurende 24 uur en herhaal BABB clearing. </li><li> Lever onderdompelen in BABB in een glazen petrischaal voor beeldvorming in situ. </li></ol> 8. Macereren leverweefsel <ol><li> Verwijderen lever van muizen en in een 50 ml conische buis met water. Wacht 1 uur voor complete hars uitharden. Afzonderlijke leverlobben indien gewenst. </li><li> Giet water af en zet de lever aan een glazen fles. Dompel in 15% KOH. Reactie overnacht bij kamertemperatuur. Niet rocken. </li><li> Giet af KOH en was gegoten in gedestilleerd water. Let op: de cast is very kwetsbaar en moet worden met uiterste zorg behandeld. Te verstoren de cast bij het toevoegen of verwijderen van vocht uit de buis. </li><li> Wanneer hars gegoten schoon voorzichtig leggen op een Kimwipe drogen en overbrengen in een vat worden opgeslagen. </li></ol> 9. Representatieve resultaten Een succesvolle cast van de poortader of galgang toont een continu netwerk van steeds kleinere vertakkingen zich vanaf de navel naar de lever omtrek. Figuur 1 toont een poortader gegoten als gevisualiseerd in situ na BABB clearing. Figuur 1A de cast van de gehele linker leverkwab en de vorm en grootte van de cast toont. Figuur 1B toont een close-up van dezelfde cast, het aantonen van de penetratie van het hars in de kleinste poortader takken op lever omtrek. Figuur 2 een poortader cast dat reeds KOH maceration. Figuur 2A toont de gehele linker leverkwab en figuur 2B is een close-up van de kleine perifere takken. Deze techniek is ook met succes toegepast op de intrahepatische galwegen en gepubliceerd door zowel de BABB clearing en KOH maceratie technieken 1,2,7. Veel voorkomende problemen zijn incomplete vult, bellen in de hars, overloopt omliggende systemen of weefsels. Figuur 3 toont hoe een incomplete vulling (figuur 3A), bubbles (figuur 3A), en een overloop hars herkennen aan de poortader naar de centrale ader (Figuur 3B). Alle beelden worden genomen met behulp van een Leica MZ 16 FA stereoscoop en QImaging RETIGA 4000R camera. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig1.jpg" /> Figuur 1. BABB-goedgekeurde hars gegoten in de lever linker kwab poortader. A. hars gegoten toont een hiërarchische boomstructuur zich vanaf de navel naar de lever omtrek. Hars gegoten verschijnt in gele kleur in blauw getint leverkwab. B. Een dichte verschijnt dat hars vullen zich uitstrekt tot kleine vestigingen in de lever periferie. Hars is witachtig via gewist lever. Schaal bar = 1 mm. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig2.jpg" /> Figuur 2. Tissue-gemacereerde hars gegoten in de lever linker kwab poortader. A. Resin gieten van hele lever kwab toont vele takken van verschillende grootte. B. Close-up blijkt uit kleinschalige vestigingen in periferie van de lever. Bevedering verschijnen van kleine takken vertegenwoordigt hars vullen van sinusoïdale ruimten en al dan niet zichtbaar op hars zet en zal de schijnbare dichtheid branch toenemen indien aanwezig. Hars is wit van kleur. Schaal bar = 1 mm. Figuur 3. Veel voorkomende problemen met hars afgietsels. A. Een onvolledige vulling van de linker kwab poortader is duidelijk door een aantal of alle gegoten takken niet uit te breiden naar de lever periferie. Dit gegoten geeft ook bellen, zichtbaar als onderbrekingen in de continu gegoten (pijl). B. Vanwege de nabijheid van de poortader en de centrale ader vestigingen in sommige plaatsen, zal de poortader hars vaak voer en vul de centrale ader. Dit kan worden herkend als er twee verschillende hilaire takken (pijlen) en twee vertakkende structuren die verschillende patronen en overlap hebben. Onderscheid te maken tussen technische fouten en echte morfologische veranderingen kan op twee manieren. Ten eerste moet de cast structuur worden vergeleken met de verwachte structuur op basis van 2-dimensionale analyse of andere methoden. Tweede is het belangrijk te voeren meerdere herhalingen, en indien mogelijk gekwantificeerd structUre en statistische analyses om reproduceerbaarheid te bepalen en als er een statistisch significante morfologische veranderingen tussen en binnen verschillende experimentele en controlegroepen.

<ol><li>Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+hepatic+Notch+signaling+result+in+disruption+of+the+communicating+intrahepatic+bile+duct+network+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice.</a> Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).</li>
<li>Vanderpool, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+hepatocyte+nuclear+factor-6+and+notch+signaling+regulate+mouse+intrahepatic+bile+duct+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo.</a> Hepatology. 55, 233-243 (2012).</li>
<li>Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+morphology+and+3D+architecture+of+brain+vasculature+in+a+mouse+model+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).</li>
<li>Van Steenkiste, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+corrosion+casting%3A+analyzing+wall+shear+stress+in+the+portal+vein+and+vascular+abnormalities+in+portal+hypertensive+and+cirrhotic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents.</a> Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).</li>
<li>Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+pulmonary+lymphatics+in+immature+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Deep pulmonary lymphatics in immature lungs.</a> Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).</li>
<li>Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+of+the+pancreas%2C+liver%2C+and+kidney+in+cerulein-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis.</a> Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).</li>
<li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li>
<li>Carlson, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+expression+of+constitutively+active+Notch4+elicits+reversible+arteriovenous+malformations+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).</li>
<li>Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ageing+on+the+murine+venous+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of ageing on the murine venous circulation.</a> Histochem. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Hossler, F. E., Olson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+of+the+nasal+salt+gland+of+the+duckling%2C+Anas+platyrhynchos%3A+quantitative+responses+to+osmotic+adaptation+and+deadaptation+studied+with+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting.</a> J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).</li>
<li>Hossler, F. E., West, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+valve+anatomy+and+morphometry%3A+studies+on+the+duckling+using+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting.</a> Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).</li>
<li>Hossler, F. E., Monson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+blood+supply+of+intrinsic+lymph+nodes+in+the+wall+of+the+rabbit+urinary+bladder--studies+with+light+microscopy%2C+electron+microscopy%2C+and+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting.</a> Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).</li>
<li>Hossler, F. E., Monson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+unique+elastic+sheath+surrounding+the+vesicular+arteries+of+the+rabbit+urinary+bladder--studies+of+the+microvasculature+with+microscopy+and+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting.</a> Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).</li>
<li>Hossler, F. E., Kao, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+of+the+urinary+bladder+of+the+dog%3A+a+study+using+vascular+corrosion+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting.</a> Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).</li>
<li>Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+morphometry+and+branching+angles+of+porcine+coronary+arterial+tree+from+CT+images%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images.</a> Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).</li>
<li>Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+morphometry+of+myocardial+capillaries+studied+with+vascular+corrosion+casting+and+scanning+electron+microscopy%3A+a+method+for+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Scan+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart.</a> Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).</li>
<li>Hossler, F. E., Douglas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Corrosion+Casting%3A+Review+of+Advantages+and+Limitations+in+the+Application+of+Some+Simple+Quantitative+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods.</a> Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).</li>
<li>Mondy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+of+corrosion+casts+for+use+in+the+computer-aided+design+of+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+the+Rat+Intrahepatic+Biliary+System+by+Three-Dimensional+Reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction.</a> The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+Artery+and+Portal+Vein+Remodeling+in+Rat+Liver%3A+Vascular+Response+to+Selective+Cholangiocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation.</a> The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben beschreven specifieke voorbeelden hoe de poortader en intrahepatische galkanaal systemen van de lever kan worden gegoten, maar deze techniek kan worden toegepast op vrijwel elk ander ductaal of vasculaire systeem met kleine aanpassingen. Eerder werk heeft aangetoond dat het mogelijk deze techniek in verschillende soorten, waaronder muis 1,2,7-9, eendje 10,11, 12,13 konijn, hond 14 en varkens 15, en in veel organen, zoals nasale gland 14, hart 16,</sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> PE10 polyethyleen buis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1417012P </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 chirurgische zwart gevlochten zijde </td><td> Roboz Chirurgische </td><td> SUT-15-1 </td><td></td></tr><tr><td> Steriject 32 G x 13 mm naald </td><td> Air-tite </td><td> TSK3213 </td><td></td></tr><tr><td> Lente schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Nummer 5 tangen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 91.150-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mercox II kit </td><td> Ladd Onderzoek </td><td> 21247 </td><td></td></tr><tr><td> Benzylalcohol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1816-04 </td><td> Olleen nodig zijn voor BABB-clearing </td></tr><tr><td> Benzylbenzoaat </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 154839 </td><td> Alleen vereist voor BABB-clearing </td></tr><tr><td> Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boetseerklei </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schaal </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratorium schaar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ml cap polypropyleenbuizen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4% paraformaldahyde </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15% kaliumhydroxide (KOH) </td><td></td><td></td><td> Alleen vereist voor maceratie </td></tr><tr><td> Scheermesje </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100% methanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 ml luer lock spuit </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3-dimensionale kunstharsproducten en beeldvorming van de muis portal vein of intrahepatische bile duct system

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organen de juiste architectuur van vasculaire en ductale structuren onmisbaar voor een goede fysiologische functie en de vorming en instandhouding van deze structuren is een sterk gereguleerd proces. De analyse van deze complexe, 3-dimensionale structuren sterk afhankelijk of 2-dimensionale onderzoek punt of kleurstof injectie studies. Deze technieken zijn echter niet in staat om een ​​volledige en kwantificeerbare weergave van de ductale of vasculaire structuren zij moeten ophelderen verschaffen. Ook de aard van 3-dimensionale kunsthars worpen genereert een permanente snapshot van het systeem en is een nieuwe en zeer bruikbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren van 3-dimensionale structuren en netwerken. Een cruciaal voordeel van het hars gieten systeem is de mogelijkheid om de intacte en aangesloten, of communiceren, structuur van een bloedvat of kanaal te bepalen. De structuur van vasculaire en ductal netwerken zijn cruciaal voor orgaanfunctie en deze techniek heeft de potentie om studie van vasculaire en ductale netwerken steun op verschillende manieren. Hars gieten kan worden gebruikt om normale morfologie en functionaliteit van een luminale structuur analyseren, morfogenetische ontwikkeling veranderingen en ontdekken morfologische verschillen in weefselarchitectuur tussen normale en ziektetoestanden. Eerder werk heeft gebruikt kunstharsproducten te bestuderen, bijvoorbeeld, architectonische en functionele gebreken in de muis intrahepatische galwegen systeem dat niet weerspiegeld in 2-dimensionale analyse van de structuur 1,2, veranderingen in de hersenen vasculatuur van de ziekte van Alzheimer een muismodel 3 , poortader afwijkingen in portaal hypertensieve en cirrose muizen 4, ontwikkelingsstappen in de rat lymfatische rijping tussen onvolwassen en volwassen longen 5, onmiddellijke microvasculaire veranderingen in de rat lever, alvleesklier en nieren onder invloed van de chemische letsel6. Hier presenteren we een methode voor het genereren van een 3-dimensionale hars gegoten van een muis vasculaire of ductaal netwerk, specifiek gericht op de poortader en intrahepatische galwegen. Deze afgietsels kunnen worden gevisualiseerd door het opruimen of macereren het weefsel en kan vervolgens worden geanalyseerd. Deze techniek kan worden toegepast op vrijwel alle vasculaire of ductale systeem en zou rechtstreeks op een studie onderzoek naar de ontwikkeling, functie, onderhoud of letsel van een 3-dimensionaal ductale of vasculaire structuur.

Werkwijze voor visualiseren en kwantificeren van de 3-dimensionale structuur van muis poortader of intrahepatische galgang beschreven. Deze hars gegoten techniek kan ook worden toegepast op andere ductale of vasculaire systemen en staat<em&gt; In situ</em&gt; Visualisatie of kwantificeren van intacte een systeem communiceert architectuur.

3-Dimensionale kunstharsproducten en beeldvorming van de muis Portal Vein of Intrahepatische Bile Duct System

In organen is de correcte architectuur van vasculaire en ductale structuren onontbeerlijk voor een propere fysiologische functie, en de vorming en ...

Het algemene doel van deze procedure is het maken van een driedimensionale afgietsel van een vasculair of ductaal weefsel. Dit wordt bereikt door eerst de doelstructuur, zoals de vena portae, voor te bereiden en te canuleren, waarna de canule wordt vastgezet. Vervolgens wordt hars bereid, in de vena portae geïnjecteerd en gelaten om uit te harden.Vervolgens wordt de lever verwijderd en wordt het weefsel gefixeerd of gemacererd. Ten slotte wordt de lever geklaard en wordt de gegoten structuur gevisualiseerd. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden verkregen.Dit toont veranderingen in de architectuur van de vasculaire of ductale structuur via visuele analyse of kwantificering door micro-CT. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de leverarchitectuur, kan deze ook worden toegepast op de vasculaire of ductale systemen van elk orgaan, waaronder de hersenen, longen, pancreas en nieren.Om de canule voor te bereiden, warmt u een stuk PE 10-slang van ongeveer 2,5 cm lang op met uw vingertoppen en trekt u dit voorzichtig uit zodat het dunner wordt. Snijd de uitgerekte slang diagonaal door. Om een schuin uiteinde te creëren, snijdt u de andere rand van de slang af, zodat een segment van ongeveer 12 tot 15 cm ontstaat.Plaats een hypodermische naald van 32 gauge en een halve inch in de niet-geslepen zijde van de slang. Bereid een spuit van drie milliliter voor door deze eerst te vullen met PBS en schroef de naald met de slang erop. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten en dat de naald gevuld is met PBS door tegen de spuit te tikken en de plunjer in te drukken.Weeg 0,1 gram katalysator af in een klein bakje. Trek vervolgens één milliliter hars op in een spuit van drie milliliter. Knip tot slot een stuk zijden hechtdraad van vijf inch af om als ligatuur te gebruiken.Nadat een volwassen muis is opgeofferd, legt u deze op de rug en opent u de buikholte. Plaats de muis op het plateau van een dissectiemicroscoop en positioneer een conische buis van 15 milliliter loodrecht onder de muis om de zichtbaarheid en toegankelijkheid van de lever te vergroten. Bevochtig een wattenstaafje met PBS en gebruik dit om de lever omhoog en opzij te klappen, zodat de dorsale zijde van de lever samen met de extrahepatische poortader of de gemeenschappelijke galgang zichtbaar wordt.Voorkom bij het maken van portal vein casts bloedstollings door de ader door te spoelen met PBS op kamertemperatuur. Bevestig een naald aan een spuit van 3 mL gevuld met PBS en steek deze zo ver mogelijk van de lever vandaan in de extrahepatische poortader.Duw vervolgens voorzichtig PBS in de vena portae. Maak daarna een inkeping in de vena cardinalis communis om bloed af te voeren indien nodig om de bloedafvoer te verbeteren, en gebruik een nat wattenstaafje om de lever te masseren. Bij het werken met een systeem met een open uiteinde kan het nuttig zijn om aan het andere uiteinde van het systeem een ligatuur te knopen en aan te trekken.Indien de vena cardinalis communis is geopend om bloed uit de vena portae af te voeren, wordt er een ligatuur rond deze laatste gelegd om de druk in de vena portae te verhogen en lekkage van hars naar de centrale vena hepatica te voorkomen. Gebruik gebogen pincetten om de chirurgische hechtdraad onder een van beide structuren door te voeren, ongeveer een kwart inch van de lever. Knoop de hechtdraad in een losse gewone knoop zonder deze aan te trekken.Gebruik vervolgens veerschaartjes om een kleine incisie te maken in de vena portae of de galgang, ongeveer een kwart inch onder de hechtingsknoop. Deze incisie mag niet verder doordringen dan de helft van de diameter van de betreffende structuur. Houd vervolgens de vena portae of de galgang op de plaats van de incisie vast met een pincet nummer vijf en voer het afgeschuinde uiteinde van de slang in.Duw de punt van de slang voorbij de gestroomlijnde ligatuur richting de lever. Controleer de nauwkeurigheid van de canulatie door PBS via de canule te injecteren en te observeren of dit de poortader of de galgang binnengaat. Trek de ligatuur aan om de canule op zijn plaats te houden.Voeg de vooraf afgemeten 1 ml hars toe aan de vooraf afgemeten 0,1 g katalysator en meng dit grondig, waarbij luchtbellen worden vermeden. Trek het mengsel van hars en katalysator terug in de spuit van 3 ml. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig tegen de spuit te tikken en de bellen naar buiten te drukken.Vervang voorzichtig de spuit met PBS door de spuit met hars, waarbij de naald van 32 gauge aan de canule blijft zitten. Duw langzaam en voorzichtig de hars in de poortader of de galgang totdat de weerstand toeneemt en de lever gevuld is. Om een gelijkmatige vulling te bevorderen.Gebruik een nat wattenstaafje om de lever voorzichtig te masseren, verwijder de canule en trek de ligatuur snel opnieuw aan om lekkage van de hars te voorkomen. Laat de muis 20 minuten plat blijven liggen bij kamertemperatuur terwijl de hars uithardt voordat de lever wordt verwijderd voor visualisatie van het binnenste van de lever; fixeer deze vervolgens gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius. Giet de vloeistof de volgende dag af en voeg PBS toe.Was de lever gedurende ten minste vier uur in PBS. De leverlobben kunnen op dit punt worden gescheiden indien gewenst. Dehydrateer het weefsel in 50% methanol en vervolgens in 100% methanol gedurende ten minste vier uur per stap.Schudden bij kamertemperatuur. Maak de lever gedurende ten minste nog 24 uur helder in een oplossing van benzoylalcohol en benzoylbenzoaat in een verhouding van één op twee. Er kunnen extra wasstappen nodig zijn voor in situ beeldvorming.Dompel de lever onder in BABB in een glazen petrischaal als alternatieve methode om het weefsel te macereren. Plaats de lever na verwijdering uit het dier in een conische buis van 50 milliliter met water. Wacht één uur voor volledige uitharding van de hars.Giet het water af en verplaats de lever naar een glazen fles. Dompel deze onder in 15% kaliumhydroxide en laat het geheel zorgvuldig een nacht bij kamertemperatuur staan zonder te schudden. Giet de kaliumhydroxide af en was het preparaat met gedestilleerd water.Voorkom dat het gietsel wordt verstoord bij het toevoegen of verwijderen van vloeistof uit de buis. Wanneer het harsgietsel schoon is, leg het dan voorzichtig op een kim wipe om te drogen en breng het vervolgens over naar een bewaarbak. Deze figuur toont een gietsel van de vena portae zoals gevisualiseerd in situ na BABB-klaring.Hier is het afgietsel van de gehele linker leverkwab en de vorm en grootte van het afgietsel weergegeven. Dit is een detailopname van hetzelfde afgietsel waarop de penetratie van de hars in de kleinste takken van de poortader aan de periferie van de lever te zien is. Hier is een afgietsel van de poortader onderworpen aan maceratie met kaliumhydroxide, waarbij de volledige linkerkwab hier wordt getoond en een detailopname van de kleine perifere takken hier.Veelvoorkomende problemen zijn onder meer onvolledige vullingen, luchtbellen in de hars en overloop naar omliggende systemen of weefsels. Deze figuur laat zien hoe een onvolledige vulling, luchtbellen en een overloop van hars van de poortader naar de centrale ader kunnen worden herkend. Vergeet niet dat het werken met hars extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het altijd dragen van handschoenen en het werken in een goed geventileerde ruimte, moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

3-dimensional-resin-casting-imaging-mouse-portal-vein-or-intrahepatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In dit artikel presenteren we een eenvoudige, praktische techniek voor cerebrovasculaire gieten, dat is eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt om het imago van de vasculaire boom van de volwassen hersenen van muizen.

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

This video describes the procedure for biliary system resin casting, for understanding 3D biliary architecture. This technique provides insights into the internal diameter and network connectivity of the biliary system, which could be used for liver regeneration analysis.

Biliary System Resin Casting: A Technique for Analyzing 3D Architecture of Biliary System in Murine Model Using Radiopaque Resin Injection

Hulpmiddelen die worden gebruikt voor het visualiseren van vasculaire regeneratie vereisen methoden voor het contrasteren van de vasculaire bomen. Deze film toonde een delicate injectietechniek die werd gebruikt om een optimaal contrast van de vasculaire bomen te bereiken en illustreerde de potentiële voordelen die resulteren uit een gedetailleerde analyse van het resulterende specimen met behulp van µCT en histologische seriële secties.

Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

Er werd een chirurgische procedure ontwikkeld om mamma-tumorcellen via injectie in de poortader in de muizenlever af te leveren. Dit model maakt onderzoek naar late stadia van levermetastase mogelijk bij een volledig immuuncompetente gastheer, inclusief extravasatie van tumorcellen, zaaien, overleven en metastatische uitgroei in de lever.

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Het doel van deze techniek is ex vivo visualisatie van longslagaderlijke netwerken van vroege postnatale en volwassen muizen door middel van longinflatie en injectie van een radio-ondoorzichtige polymeer-gebaseerde verbinding via de longslagader. Mogelijke toepassingen voor gegoten weefsels worden ook besproken.

Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming

Portale ader injectie van colorectale kanker (CRC) organoïden genereert stroma-rijke levermetastase. Dit muismodel van CRC-levermetastase vertegenwoordigt een nuttig hulpmiddel om tumor-stroma-interacties te bestuderen en nieuwe stroma-gerichte therapieën te ontwikkelen, zoals adeno-geassocieerde virus-gemedieerde gentherapieën.

Portale ader injectie van colorectale kanker organoïden om de levermetastase stroma te bestuderen

Dubbelharsgieten micro-computertomografie, of DUCT, maakt visualisatie, digitalisering en segmentatie van twee buisvormige systemen tegelijkertijd mogelijk om 3D-analyse van orgelarchitectuur te vergemakkelijken. DUCT combineert ex vivo injectie van twee radiopaqueharsen gevolgd door micro-computertomografiescanning en segmentatie van de tomografische gegevens.

DUCT: Double Resin Casting gevolgd door Micro-Computed Tomography voor 3D Leveranalyse

Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.

3D-beeldvorming van de extracellulaire levermatrix in een muismodel van niet-alcoholische steatohepatitis

We hebben een muismodel van chronische leverfibrose opgesteld, dat een geschikt diermodel biedt voor de virus-geïnduceerde leverfibrose mechanistische studie van galatresie (BA) en een platform voor toekomstige BA-behandelingen.

Een muismodel van chronische leverfibrose voor de studie van galatresie

In dit protocol bespreken we de implementatie van een model van succesvolle orthotope levertransplantatie (OLT) bij muizen. Daarnaast worden ook adjuvantia besproken om de doorgankelijkheid van het transplantaat verder te analyseren na succesvolle OLT in een muis, met name met behulp van microcomputertomografie (microCT)-scans.

Succesvolle orthotope levertransplantatie bij muizen met behulp van microcomputertomografie-angiografie

Dit protocol introduceert een geavanceerd, herbruikbaar hepatisch beeldvormingshulpmiddel (RHIT) voor intravitale microscopie (IVM) van levende muizen, wat de weefselstabiliteit verbetert voor snelle en acute experimenten. Het 3D-geprinte ontwerp van de RHIT biedt kosteneffectieve productie, schaalbaarheid en veelzijdigheid, waardoor langdurige observatie van metabole processen bij muizen van verschillende groottes mogelijk is.

Herbruikbaar leverbeeldvormingsapparaat: een herbruikbaar 3D-geprinte hulpmiddel voor leverintravitale microscopie

Leer een kunstharsgiettechniek voor driedimensionale visualisatie van het portaalvene- of intrahepatische galwegsysteem bij muizen. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van vasculaire architectuur mogelijk.

3-Dimensionale kunstharsproducten en beeldvorming van de muis Portal Vein of Intrahepatische Bile Duct System

Meer video's verkennen