Terugkerende Herpetische Stroma Keratitis in Muizen, een model voor het bestuderen van de Mens HSK

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van recurrente herpes simplex virus- of HSV-infecties. Dit wordt bereikt door muizen eerst zodanig te infecteren dat zij latent geïnfecteerd raken zonder dat er hoornvliesbeschadiging optreedt. Nadat de latentie volledig is gevestigd, is de volgende stap het reactiveren van het virus door blootstelling aan UVB-licht; in de laatste stap wordt de traanfilm verzameld voor de detectie van virale uitscheiding en wordt de muis vervolgens gedurende ten minste vijf weken geobserveerd om het ziekteverloop te monitoren.

Uiteindelijk kan de ernst van de ziekte bij de muizen worden beoordeeld door de ziektegraad van herpesstromale keratitis te bepalen. Dit is een ziekte die wereldwijd veel mensen treft. Deze specifieke ziekte is een van de belangrijkste oorzaken van infectieuze blindheid.

We hebben een model dat we bij muizen gebruiken om deze specifieke ziekte na te bootsen. Er zijn andere modellen die deze ziekte kunnen nabootsen, maar we zijn van mening dat dit de beste representatie is van deze specifieke ziekte. Ik wil graag een paar minuten nemen om de mensen voor te stellen die u in deze video zult zien.

Dit is Chloe, die de afgelopen maanden met mij heeft samengewerkt. Dit is Nippo, een zomerstudent die in het laboratorium werkt. Begin het experiment door HSV-1 gedurende drie tot vier dagen te kweken op Vero-cellen tot een confluentie van 80% in een T150-fles.

Tegen deze tijd zullen de cellen zijn afgerond en kunnen ze eenvoudig worden losgemaakt door tegen de kolf te tikken. Breng de celsuspensie over naar steriele conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten. Gebruik hiervoor 1.510 ×g bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge.

Breng vervolgens het supernatant over in steriele Oak Ridge-buisjes van 50 milliliter en verdeel vervolgens in totaal vijf milliliter medium over elk van de conische buisjes om te resuspenderen. Suspendeer de grote pellets en sonicer de geresuspendeerde pellets gedurende één minuut in bursts van twee 32ste seconden. Na het centrifugeren van het supernatant in een hogesnelheidsvloercentrifuge wordt een klein viraal pellet gevormd.

Gooi het supernatant weg. Combineer de residuen met de kleine virale pellets en soniceren opnieuw gedurende 45 seconden. Centrifugeer de gesoniceerde cellen en virusoplossing vervolgens opnieuw in de benchtop-centrifuge gedurende vijf minuten bij 280 ×g en 4 °C, en verdeel het supernatant daarna in aliquots voor bewaring als virusstock bij -70 °C of voor de titerplaat.

Tienvoudige verdunningen van het virus uit het supernatant van de virusvoorraad, van 10⁰ tot 10⁻⁸, twee keer vanuit twee afzonderlijke verdunningsreeksen van Vero-cellen in steriele 12-well platen. Begin de infectieprocedure door de muis te anesthetiseren. De muis moet gedurende 20 tot 30 minuten volledig onder anesthesie blijven zodat het virus kan worden geabsorbeerd voordat de muis wakker wordt.

Kras vervolgens onder een dissectiemicroscoop met een naald van 30 gauge het hoornvlies van het rechteroog. Nummer het dier nu via een oorpunch. Injecteer de muis daarna met één milliliter gepoold humaan serum om de hoornvliezen te beschermen tegen beschadiging tijdens de primaire infectie.

Gebruik vervolgens een pipet van 20 µL om het gekraste oog te infecteren met 10⁶ plaque-vormende eenheden en breng 5 µL HBSS aan in het andere oog om dit vochtig te houden terwijl het dier onder narcose is om de infectie te bevestigen. Hydrateer een steriele wattenstaaf met 1 mL Vero-medium. Drie dagen na de infectie wordt het geïnfecteerde oog afgenomen met de wattenstaaf, waarna 100 µL van het afgenomen medium wordt overgebracht naar Vero-cellen die zijn gekweekt in 48-wells platen, ten minste vijf weken na de primaire infectie.

Neem een uitstrijkje van het geïnfecteerde oog van een geanestheseerde muis, zoals zojuist is getoond. Markeer het moment van het uitstrijkje als dag nul op het deksel van de 48-wells plaat om te controleren op spontaan knipperen. Plaats de muis vervolgens in een transilluminator die UVB kan uitzenden met een piekgolflengte van 302 nanometer, zodanig dat slechts één oog wordt blootgesteld aan het UVB-licht, en bestraal de muis met 250 millijoule UVB-licht per vierkante centimeter.

Krijg vervolgens dagelijks van dag één tot zeven een uitstrijkje van het oog. Na de UVB-bestraling wordt voor de uitstrijkjes die infectieus virus bevatten de virushoeveelheid bepaald met een standaard plaque-assay met gebruik van 12-wells platen om de muizen op klinische oogziekten te beoordelen. Plaats de muis onder een binoculaire dissectiemicroscoop.

Hoornvliesopaciteit wordt beoordeeld op een schaal van nul tot vier, waarbij nul staat voor een helder stroma en één voor een milde stromale opacificatie. Twee duidt op een matige opaciteit waarbij de iris nog herkenbaar is. Drie duidt op een dichte opaciteit met verlies van gedefinieerde irisdetails, behalve de pupilranden, en vier duidt op totale opaciteit zonder zicht op de posterieure zijde.

Neovascularisatie wordt beoordeeld op een schaal van één tot acht door het hoornvlies te verdelen in vier gelijke kwadranten en de mate van vascularisatie in elk van deze kwadranten te bepalen. In deze eerste figuur werden latent geïnfecteerde muizen gestimuleerd tot reactivatie met UVB-bestraling, waarna de muizen gedurende 35 dagen werden gemonitord op hoornvliesopaciteit. Deze gegevens tonen aan dat mannelijke C 57 black six muizen significant minder hoornvliesopaciteit vertonen dan vrouwelijke C 57 black six muizen, aangezien er op dag 14 tot en met 35 een significant grotere virusgeïnduceerde ziekte was bij vrouwelijke C 57 black six muizen.

Hetzelfde gold wanneer corneale neovascularisatie onder dezelfde experimentele omstandigheden werd geëvalueerd; mannelijke muizen vertoonden significant minder groei van nieuwe vaten in het hoornvlies dan vrouwelijke muizen, en opnieuw is er een significant grotere virus-geïnduceerde ziekte bij de vrouwelijke C 57 black six muizen op dag 14 tot en met 28. Onthoud bij het uitvoeren van deze procedure de muizen volledig te anesthetiseren, zodat ze gedurende 20 tot 30 minuten in slaap zijn. Na het bekijken van deze video hoop ik dat u begrijpt hoe u het muismodel voor recurrente stromale keratitis kunt gebruiken om deze menselijke ziekte te bestuderen.