Name: Terugkerende Herpetische Stroma Keratitis in Muizen, een model voor het bestuderen van de Mens HSK (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer een muismodel voor terugkerende herpetische stromale keratitis met UVB-lichtreactivering. Deze methode helpt onderzoekers om HSV-infecties en hoornvliesziekteprogressie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Jay Pepose bedanken voor het helpen van het onderwijzen van de model voor ons. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) en een onbeperkte subsidie ​​van onderzoek naar blindheid te voorkomen bij Afdeling Oogheelkunde.

Animal Care Note: analgetica niet gebruikt in dit model zijn anti-inflammatoire en zou dus het model ongeldig. 1. Bereiding van Virus <ol><li> HSV-1 groeien op Vero-cellen (80% confluent) met een verdunning start van 0,01 multipliciteit van infectie (in T-150 kolf ongeveer 5 x 10 5 plaque vormende eenheden) gedurende 3-4 dagen totdat alle cellen afgerond-up en zijn gemakkelijk verdreven door het raken van de kolf. </li><li> Verwijder media steriele centrifugebuizen en centrifugeer in Sorvall Legend RT bij 4 ° C en 3500 rpm gedurende 15 minuten. Na verwijdering supernatant (zie 1.3), resuspendeer grote pellet van elk 50 ml buis met 5 ml media totaal. Sonificeer 1 min in twee 30 sec barst. </li><li> Verwijder supernatant en in 50 ml steriele Oak Ridge en centrifugeer bij 9000 rpm, gedurende 1 uur bij 4 ° C in een Beckman J2-21 centrifuge. Dit is om een ​​kleine virale pellet. Verwijder het supernatant. </li><li> Combineer ultrasone trillingen van 1,2 with pellet van 1,3 en ultrasone trillingen weer voor 45 sec. Centrifuge in Sorvall Legend RT bij 1500 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Sla het supernatant. Dit vormt de virus stock die gealiquoteerd en opgeslagen bij -70 ° C. </li><li> Titer virus op Vero-cellen. Ik meestal plaat 10 0 naar 10 -8 verdunning (die elk een 10-voudige verdunning) 2x uit 2 afzonderlijke verdunning sets. Titratie van virus wordt uitgevoerd op 12-well platen steriel. </li></ol> 2. Muis Infectie <ol><li> Injecteer elke muis met 0,1 ml anestheticum cocktail/20 g lichaamsgewicht muis (Ketamine, 60 mg / kg + Xylazine 5 mg / kg die wordt verdund in HBSS). Deze cocktail wordt gebruikt omdat het een van de veiligste anesthesie bij juiste doseringen worden gebruikt en de effecten van dit geneesmiddel zeer korte duur. </li><li> Als muizen verdoofd krassen op het hoornvlies van het rechteroog van een 30 gauge naald met een dissectiemicroscoop dat de cornea niet geperforeerd is. </li><li> Elke muis receIVED een intraperitoneale injectie van 1 ml van samengevoegd menselijk serum (Sigma, Temecula, Californië, anti-HSV reactiviteit met een effectieve dosis voor 50% neutralisatie van virale 1:800) om hoornvliezen beschermen tegen beschadiging tijdens primaire infectie. </li><li> Nummer de muizen met beide oren clips of op het gehoor punch. </li><li> Nadat alle muizen zijn genummerd, met een pipet 20 pi, we infecteren met elk oog 10 6 PFU (5 pi). We infecteren slechts een oog en typisch het rechteroog. Wij plaatsen ook 5 pi HBSS naar het andere oog vochtig te houden terwijl ze verdoofd. 5 ul volstaat om hydratatie van het oog te handhaven, omdat de procedures worden uitgevoerd in minder dan 10 minuten en de dieren gedoseerd met verdoving dienovereenkomstig. Besmetting bevestigd door zwabberen muizen 3 dagen na infectie met een steriele katoenen applicator dat gehydrateerde was in 1 ml van Vero media. Vervolgens werd 100 ul toegevoegd aan Vero-cellen gekweekt in 48-well platen. Deze platen worden dagelijks toezicht op cytopathogeen effect<html> (Cpe). </li></ol> 3. Reactivering van Muizen uit Latency <ol><li> Muizen verdoofd tenminste 5 weken na primaire infectie. Opgemerkt dat we muizen geactiveerd tot een jaar na primaire infectie en niet waargenomen significante verschillen in respons. </li><li> Zodra ze verdoofd geplaatst TM20 chromatografische Vu transilluminator, dat UV-B uitzendt met een piekgolflengte van 302 nm zodanig dat alleen een oog wordt blootgesteld aan UV-B licht. Elke muis wordt blootgesteld aan 250 mJ van UV-B licht cm 2. </li><li> Reactivering wordt bepaald door zwabberen ogen met steriele katoenen applicator die eerst in 1 ml van Vero media geplaatst op dag 0 (vóór UV-B blootstelling te controleren voor spontane shedders) en daarna op dag 1 tot 7 na UV-B straling. Het wattenstaafje materiaal wordt geëvalueerd zoals beschreven in 2.5). Voor die swabs dat besmettelijke virus de hoeveelheid virus wordt giechelde door een standaard plaque assay met 12 putjes. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. Klinische evaluatie <ol><li> Muizen worden geëvalueerd voor klinische oogziekte door een gemaskerde waarnemer met behulp van een binoculaire stereomicroscoop. </li><li> Vertroebeling van het hoornvlies wordt beoordeeld op een schaal van 0 tot 4, waarbij 0 aangeeft duidelijke stroma, 1 milde stromale troebelingen aangeeft, 2 matig dekking geeft met waarneembare iris functies, 3 geeft aan dichte dekking met het verlies van bepaalde iris detail, behalve pupil marge, en 4 betekent totale dekking zonder posterior uitzicht. </li><li> Neovascularisatie beoordeeld op een schaal van 1 tot 8 door het hoornvlies in 4 gelijke kwadranten en bepalen van de mate van vascularisatie in elk van deze kwadranten. </li><li> Blefaritis wordt als volgt gemeten: 0, geen beschadigingen, 1, minimale ooglid zwelling, 2, matige zwelling en knapperig ooguitvloeiing, 3, ernstige zwelling, matige perioculaire haaruitval, en de huid laesies, en 4, ernstige zwelling met de ogen vastgeroeste dicht, ernstige perioculaire haaruitval en huidaandoeningen. </li><li> Bewijs van encefalitis included terug gebogen, gegolfde haar, en voor de hand liggende neurologische afwijkingen. Muizen zijn geëuthanaseerd als ze weer te geven significante symptomen van encefalitis. </li></ol> 5. Representatieve resultaten De terugkerende model dat hierboven beschreven werd eerst door Shimeld, et al.. 1-3. Ze testten en ons laboratorium is met behulp van een aangepaste versie van dit model voor vele manuscripten te publiceren over de jaren 4-15. Het model werd gebruikt om de rol te bepalen dat het cytokine interferon-γ speelt in recidiverende HSV-1 ziekte 10. Zoals getoond in figuur 3, muizen die IFNy weergegeven erger corneaziekten dan heeft wild-type muizen 14. Ook werd met succes gebruikt om de therapeutische waarde van verschillende vaccin-constructen 6,10,11 definiëren. Merk op dat in het ene geval het vaccin getest goed gewerkt profylactisch maar niet blijken te zijn therapeutisch effectief 6. Echterwanneer een replicatie-incompetent viraal vaccin werd getest, was het niet alleen effectief profylactisch, maar ook zeer effectief therapeutisch 10,11, zie figuur 5 in referentie 10. Meer recent hebben we gebruikt dit model om te bepalen of geslachtsgebonden verschillen zijn detecteerbaar in muizen periodieke HSK. Zoals figuur 1 toont, mannelijke C57BL / 6 muizen vertonen aanzienlijk minder dan hoornvlies doen vrouwelijke C57BL / 6 muizen. Ook wanneer corneale neovascularisatie werd geëvalueerd mannelijke muizen vertoonden minder nieuwe vaatgroei in de cornea heeft dan vrouwelijke muizen (figuur 2). Momenteel testen we of dit fenotype stamspecifieke door een soortgelijke analyse in andere muizenstammen. Daarnaast zal ook of het verschil te wijten aan het gebrek aan testosteron of de aanwezigheid van oestrogeen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" /> Figuur 1. Ziekte van het hoornvlies bij mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6 muizenstammen na UV-B geïnduceerde reactivering. Latent geïnfecteerde muizen werden geïnduceerd om opnieuw met UV-B straling en muizen werden gecontroleerd op het hoornvlies gedurende 35 dagen. Het aantal muizen gebruikt voor deze studies waren als volgt: mannen, n = 15; vrouwen, n = 15. Resultaten geven het gemiddelde ± SEM. * Er was significant groter virus-geïnduceerde ziekte in vrouwelijke C57BL / 6 muizen voor dagen 14 tot 35 (P = 0,001 tot 0,01). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" /> Figuur 2. Ziekte van het hoornvlies bij mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6 muizenstammen na UV-B geïnduceerde reactivering. Latent geïnfecteerde muizen werden geïnduceerd om opnieuw met UV-B straling en muizen werden gedurende corneale neovascularisatie gedurende 35 dagen. Het aantal muizen gebruikt voor deze studies waren als volgt: mannetjes, n= 15; vrouwen, n = 15. Resultaten geven het gemiddelde ± SEM. * Er was significant groter virus-geïnduceerde ziekte in vrouwelijke C57BL / 6 muizen voor dagen 14 tot 28 (P = 0,001 tot 0,01).

<ol><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li>
<li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li>
<li>Keadle, T. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+ameliorates+corneal+disease+in+a+mouse+model+of+recurrent+herpetic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis.</a> Microbial Path. 38, 13-21 (2005).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+IL-1+and+TNF-a+are+required+for+recurrent+herpetic+keratitis+in+NIH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).</li>
<li>Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+cytokine+expression+in+a+murine+model+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunol.+Inflam%22%5BJournal%5D)">Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+and+CD8%2B+cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective%2C+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+vaccination+with+vhs%28-%29+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li>
<li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li>
<li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li>
<li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De recurrente model van herpetische stromale keratitis (HSK) hier beschreven staat stelt de onderzoeker voor de menselijke HSK studeren in een model dat meer in overeenstemming is met hetgeen wordt waargenomen tijdens ziekte bij de mens. Dus het model sterktes die ziekte zich in het kader van een immuunsysteem dat reeds door gestimuleerd tijdens primaire ziekte. Omdat deze muizen al een immuunrespons tegen HSV-1, de factoren die de immuunrespons opnieuw waarschijnlijk verschillend van die oorspronkelijk gegenereerd. Daa...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Humeen serum</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-C1</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>52-21</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>UVP</td><td>95-0452-02</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge-buizen</td><td>Nalgene</td><td>Z 720410</td><td></td></tr><tr><td>Kolfen- 7150</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Platen- 12 wells</td><td>Corning</td><td>CLS 3513</td><td></td></tr><tr><td>Platen- 48 wells</td><td>Corning</td><td>CLS 3548</td><td></td></tr><tr><td>Steriele conische buizen- 30 ml</td><td>Corning</td><td>CLS 430828</td><td></td></tr><tr><td>Steriele wattenstaafjes</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>30G naalden</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>25G naalden</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>10 ml spuit</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>10 ml spuit</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr></tbody></table>

terugkerende herpetische stroma keratitis in muizen, een model voor het bestuderen van de mens hsk

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetische oogziekte, genoemd herpetische keratitis stromale (HSK), is een potentieel verblindende infectie van de cornea die resulteert in meer dan 300.000 klinische bezoeken per jaar voor behandeling. Tussen 1 en 2 procent van de patiënten met klinische ziekte ervaart verlies van het gezichtsvermogen van de geïnfecteerde hoornvlies. De overgrote meerderheid van deze gevallen zijn het resultaat van reactivering van een latente infectie door herpes simplex virus type I en niet door acute ziekte. Interessant is dat de acute infectie is de meest gebruikte model om deze ziekte te bestuderen. Er werd echter van mening dat een steeds terugkerend model van HSK zou meer een afspiegeling is van wat er gebeurt tijdens de klinische ziekte. De recurrente diermodellen voor HSK hebben gebruikt zowel konijnen en muizen. Het voordeel van konijnen is dat ze ervaren reactivering van latentie bij gebrek aan een bekende stimulus. Dat gezegd hebbende, is het moeilijk om te verkennen de rol die vele immunologische factoren spelen in terugkerende HSK, omdat het konijn model heeft niet de Immunsche en genetische hulpbronnen die de muis heeft. We kozen voor het muismodel voor terugkerende HSK gebruiken omdat het heeft het voordeel dat er veel middelen beschikbaar en ook wij weten wanneer reactivering zal optreden omdat reactivering wordt veroorzaakt door blootstelling aan UV-B licht. Tot nu toe heeft dit model mag deze laboratoria te gebruiken om een ​​aantal immunologische factoren die belangrijk zijn voor deze ziekte te definiëren. Het is ook toegestaan ​​om zowel therapeutische als werkzaamheid van het vaccin te testen.

De meeste studies van de herpes ziekte van het hoornvlies gebruik maken van een primaire infectie model. Echter, primaire infectie met HSV-1 gewoonlijk niet tot menselijke ziekte. Hier beschrijven we een terugkerende herpes model van ziekte van het hoornvlies, die beter nabootst menselijke ziekte.

Terugkerende Herpetische Stroma Keratitis in Muizen, een model voor het bestuderen van de Mens HSK

Herpetische oogziekte, aangeduid als herpetische stromale keratitis (HSK), is een potentieel blindmakende infectie van het hoornvlies die resulteert in meer dan 300.000 klinische ...

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van recurrente herpes simplex virus- of HSV-infecties. Dit wordt bereikt door muizen eerst zodanig te infecteren dat zij latent geïnfecteerd raken zonder dat er hoornvliesbeschadiging optreedt. Nadat de latentie volledig is gevestigd, is de volgende stap het reactiveren van het virus door blootstelling aan UVB-licht; in de laatste stap wordt de traanfilm verzameld voor de detectie van virale uitscheiding en wordt de muis vervolgens gedurende ten minste vijf weken geobserveerd om het ziekteverloop te monitoren.Uiteindelijk kan de ernst van de ziekte bij de muizen worden beoordeeld door de ziektegraad van herpesstromale keratitis te bepalen. Dit is een ziekte die wereldwijd veel mensen treft. Deze specifieke ziekte is een van de belangrijkste oorzaken van infectieuze blindheid.We hebben een model dat we bij muizen gebruiken om deze specifieke ziekte na te bootsen. Er zijn andere modellen die deze ziekte kunnen nabootsen, maar we zijn van mening dat dit de beste representatie is van deze specifieke ziekte. Ik wil graag een paar minuten nemen om de mensen voor te stellen die u in deze video zult zien.Dit is Chloe, die de afgelopen maanden met mij heeft samengewerkt. Dit is Nippo, een zomerstudent die in het laboratorium werkt. Begin het experiment door HSV-1 gedurende drie tot vier dagen te kweken op Vero-cellen tot een confluentie van 80% in een T150-fles.Tegen deze tijd zullen de cellen zijn afgerond en kunnen ze eenvoudig worden losgemaakt door tegen de kolf te tikken. Breng de celsuspensie over naar steriele conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten. Gebruik hiervoor 1.510 ×g bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge.Breng vervolgens het supernatant over in steriele Oak Ridge-buisjes van 50 milliliter en verdeel vervolgens in totaal vijf milliliter medium over elk van de conische buisjes om te resuspenderen. Suspendeer de grote pellets en sonicer de geresuspendeerde pellets gedurende één minuut in bursts van twee 32ste seconden. Na het centrifugeren van het supernatant in een hogesnelheidsvloercentrifuge wordt een klein viraal pellet gevormd.Gooi het supernatant weg. Combineer de residuen met de kleine virale pellets en soniceren opnieuw gedurende 45 seconden. Centrifugeer de gesoniceerde cellen en virusoplossing vervolgens opnieuw in de benchtop-centrifuge gedurende vijf minuten bij 280 ×g en 4 °C, en verdeel het supernatant daarna in aliquots voor bewaring als virusstock bij -70 °C of voor de titerplaat.Tienvoudige verdunningen van het virus uit het supernatant van de virusvoorraad, van 10⁰ tot 10⁻⁸, twee keer vanuit twee afzonderlijke verdunningsreeksen van Vero-cellen in steriele 12-well platen. Begin de infectieprocedure door de muis te anesthetiseren. De muis moet gedurende 20 tot 30 minuten volledig onder anesthesie blijven zodat het virus kan worden geabsorbeerd voordat de muis wakker wordt.Kras vervolgens onder een dissectiemicroscoop met een naald van 30 gauge het hoornvlies van het rechteroog. Nummer het dier nu via een oorpunch. Injecteer de muis daarna met één milliliter gepoold humaan serum om de hoornvliezen te beschermen tegen beschadiging tijdens de primaire infectie.Gebruik vervolgens een pipet van 20 µL om het gekraste oog te infecteren met 10⁶ plaque-vormende eenheden en breng 5 µL HBSS aan in het andere oog om dit vochtig te houden terwijl het dier onder narcose is om de infectie te bevestigen. Hydrateer een steriele wattenstaaf met 1 mL Vero-medium. Drie dagen na de infectie wordt het geïnfecteerde oog afgenomen met de wattenstaaf, waarna 100 µL van het afgenomen medium wordt overgebracht naar Vero-cellen die zijn gekweekt in 48-wells platen, ten minste vijf weken na de primaire infectie.Neem een uitstrijkje van het geïnfecteerde oog van een geanestheseerde muis, zoals zojuist is getoond. Markeer het moment van het uitstrijkje als dag nul op het deksel van de 48-wells plaat om te controleren op spontaan knipperen. Plaats de muis vervolgens in een transilluminator die UVB kan uitzenden met een piekgolflengte van 302 nanometer, zodanig dat slechts één oog wordt blootgesteld aan het UVB-licht, en bestraal de muis met 250 millijoule UVB-licht per vierkante centimeter.Krijg vervolgens dagelijks van dag één tot zeven een uitstrijkje van het oog. Na de UVB-bestraling wordt voor de uitstrijkjes die infectieus virus bevatten de virushoeveelheid bepaald met een standaard plaque-assay met gebruik van 12-wells platen om de muizen op klinische oogziekten te beoordelen. Plaats de muis onder een binoculaire dissectiemicroscoop.Hoornvliesopaciteit wordt beoordeeld op een schaal van nul tot vier, waarbij nul staat voor een helder stroma en één voor een milde stromale opacificatie. Twee duidt op een matige opaciteit waarbij de iris nog herkenbaar is. Drie duidt op een dichte opaciteit met verlies van gedefinieerde irisdetails, behalve de pupilranden, en vier duidt op totale opaciteit zonder zicht op de posterieure zijde.Neovascularisatie wordt beoordeeld op een schaal van één tot acht door het hoornvlies te verdelen in vier gelijke kwadranten en de mate van vascularisatie in elk van deze kwadranten te bepalen. In deze eerste figuur werden latent geïnfecteerde muizen gestimuleerd tot reactivatie met UVB-bestraling, waarna de muizen gedurende 35 dagen werden gemonitord op hoornvliesopaciteit. Deze gegevens tonen aan dat mannelijke C 57 black six muizen significant minder hoornvliesopaciteit vertonen dan vrouwelijke C 57 black six muizen, aangezien er op dag 14 tot en met 35 een significant grotere virusgeïnduceerde ziekte was bij vrouwelijke C 57 black six muizen.Hetzelfde gold wanneer corneale neovascularisatie onder dezelfde experimentele omstandigheden werd geëvalueerd; mannelijke muizen vertoonden significant minder groei van nieuwe vaten in het hoornvlies dan vrouwelijke muizen, en opnieuw is er een significant grotere virus-geïnduceerde ziekte bij de vrouwelijke C 57 black six muizen op dag 14 tot en met 28. Onthoud bij het uitvoeren van deze procedure de muizen volledig te anesthetiseren, zodat ze gedurende 20 tot 30 minuten in slaap zijn. Na het bekijken van deze video hoop ik dat u begrijpt hoe u het muismodel voor recurrente stromale keratitis kunt gebruiken om deze menselijke ziekte te bestuderen.

recurrent-herpetic-stromal-keratitis-mice-model-for-studying-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video artikel beschrijven we het gebruik van een...

Ex Vivo Organotypische Corneal model van acute Epitheliale Herpes Simplex Virus Type I infectie

This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

Chronische oculaire hypertensie wordt opgewekt met behulp van laserfotocoagulatie van de trabekelnetwerk in muis ogen. De intraoculaire druk (IOP) wordt verhoogd tot verscheidene maanden na laserbehandeling. De daling van de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid proefdieren worden gecontroleerd met behulp van de optomotor-test.

Een laser-induced Mouse Model van chronische oculaire hypertensie aan Visual Gebreken karakteriseren

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

De huid is een doelwitweefsel van het humane pathogeen herpes simplex-virus type 1 (HSV-1). Om de invasieroute van HSV-1 in weefsel te onderzoeken, hebben we een ex vivo infectiemodel opgezet van muis-epidermale vellen die de buitenste laag van de huid vertegenwoordigen.

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Hier beschreven zijn drie experimentele benaderingen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie in gehumaniseerde muizen. De eerste maakt de studie van chronische infectie gebeurtenissen, terwijl de twee laatsten voor de studie van acute gebeurtenissen na primaire infectie of virale reactivatie.

Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen

Het voetpad inentingsmodel is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van virale geïnduceerde neuro-inducerende reacties in vivo. Het biedt met name een duidelijke beoordeling van virale kinetiek en bijbehorende immunopathologische processen die in het perifere zenuwstelsel worden geïnitieerd.

Mouse Footpad Inenting Model om virale geïnduceerde neuro-ontstekingsreacties te bestuderen

We beschrijven het gebruik van een varkenshoornvlies om de antivirale werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen te testen.

Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen

Contactovergevoeligheid (CHS) is een muizenexperimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD). CHS is gebaseerd op sensibilisatie met reactieve hapten door de geschoren huid van de borst en buik te schilderen, met een daaropvolgende oorhuiduitdaging met een verdunde hapten, waardoor een zwellingsreactie ontstaat die op verschillende manieren wordt beoordeeld.

Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis

Dit protocol legt uit hoe een hypertrofisch littekenmodel van muizen kan worden opgezet dat de mechanotransductiesignalering verhoogt om mensachtige littekens te simuleren. Deze methode omvat het verhogen van de mechanische spanning over een genezende incisie in een muis en het gebruik van een gespecialiseerd apparaat om reproduceerbaar, overmatig littekenweefsel te creëren voor gedetailleerde histologische en bio-informaticaanalyses.

Een muismodel van mechanotransductie-aangedreven, mensachtige hypertrofische littekens

Leer een muismodel voor terugkerende herpetische stromale keratitis met UVB-lichtreactivering. Deze methode helpt onderzoekers om HSV-infecties en hoornvliesziekteprogressie te bestuderen.

Terugkerende Herpetische Stroma Keratitis in Muizen, een model voor het bestuderen van de Mens HSK

Meer video's verkennen