Name: Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor weefselengineering van de dunne darm in muizen met behulp van een organoïde-eenheden-op-scaffold-benadering. Dit protocol biedt een basis voor toekomstig onderzoek naar gastro-intestinale ziekten en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, en Frederic G. Sala worden ondersteund door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM), subsidie ​​nummers RN2-00946-1 (TCG) en TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer is een Vereniging van de Universiteit Chirurgen Ethicon geleerde. Yashuhiro Torashima wordt gefinancierd door een Children&#39;s Hospital Los Angeles Saban Instituut Onderzoek Career Development Fellowship.

1. Organoid Eenheden Voorbereiding <ol><li> Instrumenten die geschikt is voor de muis dissectie (schaar en pincet) moet worden gesteriliseerd door autoclaaf. </li><li> Humaan euthanaseren de donor muis volgens de lokale IACUC protocollen. Zorg ervoor dat het dier dood is voordat u verder gaat. </li><li> Een incisie om toegang tot de buikholte krijgen. Huidplooien worden gereflecteerd als nodig om de belichting. </li><li> Eviscerate de dunne darm en verdeel het net distaal van het ligament van Treitz. Scheid de dunne darm van de mesenterium met behulp van scherpe en zachte stompe dissectie. Identificeer de Bauhin knooppunt en verdeel de dunne darm 5 mm proximaal van deze. </li><li> Met een schaar lengte opent de darm langs de rand antimesenteric in een petrischaal met 10 ml 4 ° C, steriele zoutoplossing Hanks &#39;(HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotica antifungale (Anti-Anti, Invitrogen) oplossing. Wis fecale materie uit de geopende darm metzachtjes schudden vervolgens over geopend darm aan een 15 ml centrifugebuis met 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti. </li><li> Was de darm geopend driemaal in 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti in een reageerbuis. Elke wassing kan worden uitgevoerd met mild schudden van de 15 ml buis gedurende 30 sec. Na het schudden het darmweefsel zinkt naar de bodem van de buis. Ontdoen drijvend materiaal dat mesenchymale vuil. Verwijder voorzichtig het wassen oplossing met een pipet. </li><li> Hak de gewassen darm in een petrischaal met 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti minder dan 1 mm vierkante stukken met een schaar. Verzamel de gehakte materiaal met een automatische pipet en plaats deze in een reageerbuis. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 500 rpm gedurende 8 min. Verwijder het supernatant, dat vet bevat en mesenchym. </li><li> Digereren van het gehakt, gewassen materiaal met 10 ml steriel HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml dispase (Invitrogen) en 800 eenheden / ml collagenase type 1 (Worthington, Lakewood NJ). Aan 40 ml van de spijsvertering oplossing te bereiden afgewogen 5 mg dispase, 142 mg collagenase en voeg steriele HBSS tot een volume van 40 ml. Bereid deze oplossing vers telkens organoid eenheden bereid en houden bij 4 ° C tot gebruik. Voeg de digestieoplossing direct naar de pellet uit stap 1.8. </li><li> Incubeer het buisje met het gehakt, gewassen materiaal bij de vertering oplossing bij 37 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Haal de reageerbuis en verder de verteerde weefsel kan verstoren door fijnwrijven met een 10 ml pipet. Herhalen tussen 20 tot 50 keer totdat een uniform uiterlijk wordt verkregen. </li><li> Centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 800 rpm. Verwijder het supernatant, dat enkele cellen. </li><li> Stop de digestie reactie met 10 ml 4 ° C, steriele Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% v / v hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS, Invitrogen). Resuspendeer de pellet en schud de buis. </li><li> Centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 800 rpm. Verwijder voorzichtig het supernatant met een automatische pipet tot de laatste paar druppels. Gebruik een wegwerp plastic pipet voor de laatste paar druppels te voorkomen resuspenderen de pellet. </li></ol> 2. Laden van polyglycolzuur Steiger <ol><li> Form 2 mm lang en 5 mm buitendiameter cilindrische scaffolds van nonwoven polyglycolzuur (2-mm plaatdikte, 60 mg cm-3 stortgewicht; porositeit&gt; 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) zoals beschreven in Ref. 4. </li><li> Knip de distale 2 mm van een wegwerp 1000 microliter pipet tip met een schaar bereid met 70% ethanol in gedestilleerd water. </li><li> Plaats de steiger in een 4-well cultuur plaat. Plaats de organoid eenheden op de scaffold met 1000 microliter pipet, eerst in het lumen en op het buitenoppervlak. Gebruik een tang om coating van het lumen te verzekeren. Niet verstoren of open te breken de cilindrische vorm van het polymeer. </li&gt; </ol> 3. Implantatie in Host Mouse <ol><li> Gebruik een syngene gastheer muis op dezelfde achtergrond als de donor indien beschikbaar. Anders, gebruik een immunogecompromitteerde nonobese diabetische / ernstige gecombineerde immunodeficiëntie of NOD / SCID-dier (Jackson Laboratories, Sacramento CA). </li><li> Laten algemene anesthesie met isofluraan. Scheren, prep en drapeer de muis buik. </li><li> Maak een 5 mm middellijn incisie om toegang tot de peritoneale holte te krijgen. Identificeer en zorgvuldig uithalen de grotere omentum. Plaats het geladen polymeer op het omentum en wikkel met het weefsel. Niet scheuren het omentum. </li><li> Bevestig de polymeer aan het omentum met een 5-0 hechting monocryl. Voorzichtig vervangen omentum de verpakte polymeer in de anatomische positie. </li><li> Sluit de abdominale incisie in lagen met 4-0 vicryl hechtingen. Voer de spier sluiting en let op dat de buikorganen onder de incisie verwonden. Gebruik onderbroken hechtingen voor de huid. </li><li> Dien postoperatieve analgesie met 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in steriel water als subcutane wheal naast de insnijding. Proefdieren moeten dagelijks worden geëvalueerd en indien het dier te tonen tekenen van pijn of ongemak, een bijkomende dosis van ketoprofen kunnen worden toegediend op post-operatieve dag 2. Door de derde postoperatieve dag, moet het dier volledig worden hersteld zonder bewijs van pijn of ongemak. Als pijn of angst gaat verder op post-operatieve dag 3, wordt dit beschouwd als abnormaal en moet worden behandeld in overeenstemming met de IACUC en verzorging van dieren faciliteit protocollen. </li><li> Laat de muis om te herstellen en het weefsel vervaardigde darm te groeien gedurende vier weken. Geef het dier ad libitum toegang tot knaagdier chow (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis, MO) en water met Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) bij 1:100 verdunning. </li></ol> 4. Oogst <ol><li> HumaNely euthanaseren de host dier vier weken na de implantatie. </li><li> Open de oorspronkelijke incisie en geven de huid craniale toegang tot de buikholte vergemakkelijken. </li><li> Open de spierlaag en identificeren van de tissue-engineering construct zoals een bol van weefsel. </li><li> Take down verklevingen aan het construct van intra-abdominale ingewanden met behulp van scherpe dissectie. </li><li> Bevestig het construct in formaline voor later paraffine montage of gebruik het weefsel vers voor biochemische assays, zoals real-time PCR of eiwit isolatie. </li></ol>

<ol><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).</li>
<li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).</li>
<li>Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+method+for+the+preparation+of+rat+intestinal+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures.</a> J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicellular+approach+forms+a+significant+amount+of+tissue-engineered+small+intestine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse.</a> Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).</li>
<li>Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tissue-engineered+stomach+demonstrates+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation.</a> J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).</li>
<li>Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cell+proliferation+is+dependent+on+the+site+of+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection.</a> Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).</li>
<li>Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+corrective+pullthrough+surgery+in+a+mouse+model+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease.</a> J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).</li>
<li>Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).</li>
<li>Shew, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+concerns+in+malrotation+and+midgut+volvulus%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus.</a> Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).</li>
<li>Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+long-term+results+and+prognostic+factors+after+conservative+surgery+for+small+bowel+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).</li>
<li>Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+after+surgery+for+acute+mesenteric+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia.</a> Surgery. , 121-239 (1997).</li>
<li>Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+biopsy-proven+parenteral+nutrition-associated+liver+fibrosis+and+biochemical+cholestasis+in+children+with+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome.</a> J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).</li>
<li>Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+short+bowel+syndrome%3A+the+cost+of+comprehensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care.</a> Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).</li>
<li>Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+and+multivisceral+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Intestinal and multivisceral transplantation in children.</a> Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).</li>
<li>Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+intestinal+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Current status of intestinal transplantation in children.</a> J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We presenteren een protocol voor het produceren van tissue-engineered darm in de muis met behulp van een organoid eenheden-op-steiger aanpak. De belangrijkste stappen zijn die van de organoid eenheden preparaat. Zorg moet worden genomen om adequaat te reinigen en mechanisch verwerken van het weefsel, maar evenveel zorg moeten worden genomen om geen overdigest of overtriturate de organoid eenheden na de spijsvertering wordt uitgevoerd (stap 1.11). Als dit gebeurt, de organoid eenheden worden gereduceerd tot enkele cellen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 114170-112 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotica-Antimycoticum 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Gibco </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Type 1 </td><td> Worthington </td><td> LS004194 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM High Glucose 1X </td><td> Gibco </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Hitte geïnactiveerd FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td></td></tr><tr><td> Biofelt 100% PGA </td><td> Concordia Medical </td><td> FELT01-1005 </td><td> Voor polymeerbereiding als in Ref.4 </td></tr><tr><td> Poly-L-melkzuur </td><td> Durect </td><td> B6002-1 </td><td> Voor polymeerbereiding als in Ref. 4 </td></tr><tr><td> Type I collageen, rattenstaart </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3867-1vl </td><td> Voor polymeerbereiding als in Ref. 4 </td></tr><tr><td> Ketoprofen 100 mg / ml </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> 71-keto-100-50 </td><td></td></tr><tr><td> LabDiet 5001 knaagdier chow </td><td> LabDiet </td><td> 5001 </td><td></td></tr><tr><td> Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP </td><td> Hi-Tech Pharmacal </td><td> 50383-824-16 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluraan, USP </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-507-06 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering van de darm in een muizenmodel

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Weefselmanipulatieproducten dunne darm (TESI) is met succes gebruikt om Lewis ratten redden na massale dunne darm resectie, waardoor terugkeer naar preoperatieve gewicht binnen 40 dagen. 1 in mensen, massieve dunne darm resectie kan resulteren in korte darmsyndroom, functionele malabsorptieve stellen dat significante morbiditeit, mortaliteit en zorgkosten zoals parenterale voeding afhankelijkheid leverfalen en cirrose, en de noodzaak multiviscerale orgaantransplantatie. 2 In dit document geeft beschrijven en documenteren ons protocol voor het maken weefselmanipulatieproducten darm in een muismodel met een meercellige organoid eenheden-op-steiger aanpak. Organoid units zijn meercellige aggregaten afgeleid van de darm dat zowel mucosale en mesenchymale elementen bevatten, 3 de relatie tussen die behoudt de intestinale stamcellen niche. 4 In lopend en toekomstig onderzoek, de overgang van onze techniek in demuis zal voor onderzoek van de processen in TESI vorming door gebruikmaking van de transgeen materiaal in deze soort. 5 De beschikbaarheid van immuungecompromitteerde muizenstammen laat tevens ons de techniek toepassing humane intestinale weefsel en de vorming van menselijke TESI optimaliseren als muis xenograft vóór de overgang naar de mens. Onze methode maakt gebruik van Good Manufacturing Practice (GMP) reagentia en materialen die al zijn goedgekeurd voor gebruik in menselijke patiënten, en biedt daarom een ​​belangrijk voordeel ten opzichte van benaderingen die steunen op gedecellulariseerde dierlijke weefsels. Het uiteindelijke doel van deze methode is de vertaling naar de mens als regeneratieve geneeskunde therapeutische strategie voor short bowel syndrome.

Figuur 1 een algemeen schema voor de hier beschreven protocol. Het eindresultaat van dit protocol is een wereldbol of bolvormige structuur van weefsel gemanipuleerde muizen darm met een lumen, mucosa, submucosa, muscularis en omliggende. Figuur 2A toont een typische bol in vergelijking met een uitgangspolymeer scaffold. Figuur 2B geeft hetzelfde construct tweekleppig sterk zijn lumen onthullen. Figuur 3 toont een hematoxyline / eosine gekleurde paraffin...

Dit artikel en de bijbehorende video presenteren ons protocol voor het genereren van weefsel-engineered darm in muizen, waarbij een organoid units-on-scaffold benadering.

Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

Weefseltechnologisch engineered dunne darm (TESI) is met succes gebruikt om Lewis-ratten te redden na een massale resectie van de dunne darm, wat resulteerde in een terugkeer naar ...

In deze video demonstreren we onze techniek voor het genereren van weefseltechnisch geproduceerde dunne darm bij de muis met behulp van een benadering waarbij organoïde-eenheden op een steiger worden geplaatst. In dit experiment zijn de dieren behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele commissie voor dierzorg en -gebruik en de Animal Care Facility van het Savon Research Institute van het Children's Hospital, Los Angeles. De eerste stap is het verkrijgen van de volledige muisdarm.De menselijk geëuthanaseerde muis en de instrumenten worden geprepareerd met 70% ethanol in water, waarna een midline-incisie wordt gemaakt om toegang te krijgen tot de peritoneumholte. De dunne darm wordt geëviscereerd en doorgesneden net distaal van het ligament van Treitz. Vervolgens wordt deze scherp en stomp gedisseceerd van het mesenterium en de bijbehorende vaten.Ten slotte is het ileum doorgesneden op vijf millimeter proximaal van de ileocecale klep. De geoogste dunne darm wordt hier op schaal weergegeven. Vervolgens openen we de darm in de lengterichting langs de antimesenteriële rand in een Hank's gebufferde zoutoplossing met een 1X antibioticum-antischimmeloplossing.Vervolgens wordt de darm in het schaaltje vrijgemaakt van ontlastingsmateriaal, gevolgd door drie herhaalde wasbeurten met HBSS in een reageerbuis. Het darmweefsel zinkt naar de bodem van de buis; drijvend materiaal betreft mesenchymaal debris en kan worden weggegooid. De wasoplossing wordt voorzichtig met een pipet verwijderd.De darm wordt vervolgens met een schaar fijngehakt in stukjes van minder dan één vierkante millimeter. Het fijngehakte materiaal wordt opgezogen met een automatische pipet. Het gewassen, fijngehakte materiaal is nu klaar voor digestie.De digestiesolutie bevat DASE 0,125 mg/ml en collagenase 800 U/ml in HBSS met antibioticum-antischimmelmiddelen. Let op de bruinachtige kleur van de digestiesolutie in vergelijking met de HBSS met antibioticum-antischimmelmiddelen. Deze wordt vers bereid en er worden 10 ml aan het gemalen materiaal toegevoegd.Dit wordt 20 minuten bij 37 °C geïncubeerd op een rotator. Het weefsel wordt verder gedisrumpeerd door herhaaldelijk te pipetteren, zoals hier wordt getoond. Dit wordt 20 tot 50 keer herhaald totdat een uniform uiterlijk is verkregen.De 10 milliliter pipettepunt heeft de optimale maat. Hiervoor wordt de reactie gestopt met drie milliliter DMEM van vier graden met 10% foetaal runderserum. Het materiaal wordt 10 minuten gecentrifugeerd.Bij 500 RPM wordt het supernatant weggegooid en wordt het pellet resuspendeerd in een wasbeurt van 10 milliliters vier graden DMEM met 10% foetaal runderserum. Vervolgens wordt dit vijf minuten gecentrifugeerd bij 800 RPM om al het weefsel terug te winnen, behalve de enkelvoudige cellen, die in het supernatant achterblijven en worden weggegooid. Het pellet bevat de organoïde-eenheden, het lichtere materiaal aan de bovenkant, aangegeven door de pincet, en afvalmateriaal.Onder deze laag wordt het DMEM met serum met een pipette verwijderd. Er moet erop worden gelet dat het pellet niet door de pipette wordt opgesuspendeerd. De laatste druppels kunnen veiliger worden verwijderd met de wegwerpplastic pipette.Hier wordt het polyglycolzuur- of PGA-polymeersteiger getoond dat in onze experimenten wordt gebruikt. De distale twee millimeter van een wegwerppipetpunt van 1000 µL worden afgeknipt met steriele scharen. We laden het polymeer met organoïde-eenheden in cultuurplaten met vier wanden om verspreiding van het materiaal weg van het polymeer te minimaliseren.De organoïde-eenheden worden met de pipet op het steunstructuur geladen, eerst in het lumen en vervolgens op het buitenste oppervlak. Een tweede pincet wordt gebruikt om een adequate coating van het lumen te waarborgen; hierbij moet er zorgvuldig worden gewerkt om de cilindrische vorm van het polymeer niet te verstoren. De gastmuis die wordt gebruikt in het geval van een transgene donor is een immuungecompromitteerde non-obese diabetische muis.Zwaar gecombineerd immuundeficiënt gamma-ketting-deficiënt of NSG-dier. Anders kunnen syngene gastheren worden gebruikt voor implantatie. Nadat de algemene anesthesie is geïnduceerd, wordt de buik geschoren, voorbereid en afgedekt.Er wordt een mediane incisie van 0,5 centimeter gemaakt. Het omentum majus wordt geïdentificeerd en zorgvuldig geëviscereerd. Het geladen polymeer wordt in het omentum gewikkeld en vastgezet met een 5-0 Monocryl-hechting.Het is van cruciaal belang dat het omentum niet scheurt, anders kunnen de cellen in het peritoneum lekken. Het geladen polymeer waarmee het omentum is vastgezet, wordt teruggeplaatst in de buikholte, die in lagen wordt gesloten. Er wordt een onderbroken hechting met 4-0 Vicryl gebruikt voor de sluiting.Eerst de spierlaag en daarna de huid voor postoperatieve analgesie, twee milligram per kilogram. Ketoprofen in steriel water wordt subcutaan geïnjecteerd in een wielvormig patroon nabij de incisie. Vier weken na implantatie wordt het gastdier humaan geëuthanaseerd en wordt de oorspronkelijke incisie opnieuw geopend. Het tissue-engineered construct wordt geïdentificeerd als een bolvormige structuur en kan adherent zijn aan de maag en de intra-abdominale viscera.De adhesies worden scherp weggenomen en een steroid van weefselengineered darm wordt teruggewonnen. Hier wordt het geoogste steroid getoond in directe vergelijking met het startpolymeer. Op deze afbeelding is het lumen van de engineered darm scherp geopend om het binnenste zichtbaar te maken.Het weefsel kan worden gefixeerd voor histologische analyse of vers worden gebruikt voor diverse moleculair-biologische assays, zoals we hebben aangetoond in andere publicaties. Hier wordt een microfoto met lage vergroting getoond van een typisch succesvol tissue-engineered construct van de dunne darm, gekleurd met hematoxyline en eosine. De linkerpijl geeft het lumen aan dat is bekleed met darmslijmvlies, en de rechterpijl toont de pancreas van de gastheer.Dat is gehecht aan het construct.

tissue-engineering-of-the-intestine-in-a-murine-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the detailed protocol for intestinal resection in a murine model. This technique provides insights into ileectomy-induced bile malabsorption, overaccumulation, and toxicity in the mouse intestine.

Murine Ileal Resection Model: Studying Ileectomy-Induced Bile Metabolism in Murine Model

This video demonstrates the generation of an ileal loop model to study intestinal permeability in a mouse model. This method provides a live model to understand the epithelial barrier function and consequent immune response.

Mouse Ileal Loop Model: A Surgical Model to Study Intestinal Permeability in the Mouse

Het artikel beschrijft een methode voor de productie van een acellulair matrix rat darm. De afleiding van intestinale steigers is belangrijk voor toekomstige toepassingen in tissue engineering, stamcel biologie en drugstesten.

Een Decellularisatie Methode voor de productie van een natuurlijke Acellular Intestinale Matrix

Klein dier beeldvormende technieken laten seriële diagnostische onderzoeken en therapeutische interventies in vivo. Onlangs heeft de reikwijdte van de toepassingen aanzienlijk verbreed en omvat momenteel de beoordeling van het colon tumor ontwikkeling, wondgenezing en de monitoring van de ontsteking. Dit protocol illustreert deze diverse mogelijke toepassingen van muizen endoscopie.

Muizen Endoscopie voor In Vivo Multimodal Imaging van Carcinogenese en Evaluatie van intestinale wondgenezing en ontsteking

Intestinale epitheliale stamcellen (ISC) worden vermengd met Paneth cellen. Deze cellen zijn gedifferentieerd nageslacht van de ISC, die ISC ondersteunen en antibacteriële bescherming. Hier laten we zien hoe we gebruikten conditionele transgene muismodellen aangetoond dat Paneth cellen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de intestinale epitheel.

Protocollen voor het analyseren van de rol van Paneth Cellen in het regenereren van de muizen darm met behulp van voorwaardelijke<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Modellen

Hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale ischemie-reperfusie bij muizen waardoor reproduceerbaar letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in het veld bevorderen. Dit model van intestinale ischemie-reperfusieschade kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.

Muizenmodel van Intestinale ischemie-reperfusie schade

Intestinale obstakels zijn een gedeeltelijke of volledige verstopping van de darm die leiden ernstige buikpijn, misselijkheid tot kan, braken, en het voorkomen van de passage van ontlasting. Deze procedure voor het maken van intestinale gedeeltelijke obsructions in muizen is betrouwbaar in het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische celgroei en dood in de darm.

Een muismodel van intestinale gedeeltelijke obstructie

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

We beschrijven een muizenmodel van postoperatieve ileus gegenereerd via darmmanipulatie. De gastro-intestinale transitfunctie, pathologische veranderingen en activering van immuuncellen werden 24 uur na de operatie beoordeeld.

Postoperatief Ileus muizenmodel

Leer een betrouwbare methode voor weefselengineering van de dunne darm in muizen met behulp van een organoïde-eenheden-op-scaffold-benadering. Dit protocol biedt een basis voor toekomstig onderzoek naar gastro-intestinale ziekten en regeneratieve geneeskunde.

Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

Meer video's verkennen