Name: Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Leer hoe je Arabidopsis-wortels kweekt en beeldt met de RootChip, een microfluidisch platform voor gecontroleerde groeiomstandigheden. Deze methode maakt langdurige microscopische observatie en snelle manipulatie van het wortelmilieu mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Philipp Denninger voor hulp bij video-voorbereiding en Bhavna Chaudhuri voor het leveren van planten lijnen uitdrukken FRET sensoren. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (MCB 1.021.677), het Ministerie van Energie (DE-FG02-04ER15542) om WBF, de National Institutes of Health, en het Howard Hughes Medical Institute te SRQGG werd ondersteund door een EMBO lange termijn gemeenschap. MM werd gesteund door de Alexander von Humboldt Foundation.

Opmerking: Voer alle stappen die voorbereidende stappen onder steriele omstandigheden. 1. Voorbereiding van kunststof Cones voor kiemende zaden <ol><li> Vul een 10 cm Petrischaal met groeimedium bevattende 1% agar tot een dikte van 5 mm. We gebruiken een halve kracht aangepast Hoagland medium 4, maar medium samenstelling moet worden gekozen om de individuele experimentele eisen. </li><li> Hoewel het medium nog vloeibaar een multi-kanaal pipet 10 pi pipetpunten vullen met 5 pi medium van de petrischaal. </li><li> Bewaar de gevulde tips in de pipetpunt box tot het medium is solide, snijd tot 4 mm lange plastic kegels en plaats rechtop in een petrischaal met een solide groei medium. </li></ol> 2. Zaadkieming en de groei van zaailingen <ol><li> Ondergrond steriliseren zaden in 5% NaOCl gedurende 5 minuten, drie keer wassen met steriel water, plaats dan een enkel zaad op de top van elk van de midden-gevulde kegels. </li><li> Sluit de schotel met Micropore tape (3M) en bewaar bij 4 ° C tot kieming te synchroniseren. </li><li> Na drie dagen, over te dragen de platen tot een groei kast om kieming te starten. Onze groei voorwaarden zijn van 23 ° C bij een 16u hoge light/8h donker cyclus (lichtintensiteit: 100 μE m -2 s -1). </li><li> Tussen 5 en 7 dagen na kieming moet de zaailingen klaar voor overdracht naar de RootChip. Op dit moment moet wortelpuntjes dicht bij de bodem uitlaten van de plastic kegels. Controleer zaailing gezondheid, wortel lengte en, indien van toepassing, de expressie van een fluorescente marker onder een stereomicroscoop. </li><li> Markeer afzonderlijke zaailingen voor de transfer op de chip. Selecteer een tiental zaailingen in het geval een beschadigd tijdens de overdracht. </li></ol> 3. Overdracht van Zaailingen op de RootChip <ol><li> Om de RootChip voor de lange termijn experimenten steriliseren, wikkelhet apparaat in vloeipapier, plaats in een glazen petrischaal en autoclaaf. </li><li> Zodra de RootChip is afgekoeld, dek het af met vloeibaar groeimedium. De RootChip moet volledig worden ondergedompeld, maar de vloeistof mag niet meer dan 3 mm boven het RootChip oppervlak. </li><li> Met een 20 ui pipet, trek medium door de wortel inlaat-en kamer-uitgang aan de observatie kamer te vullen met medium. </li><li> Plug plastic kegels geselecteerd in stap 2.5 in de RootChip inlaten. De kegels moet goed passen in de inlaten. Aangezien de RootChip is gemonteerd op een dunne laag optisch glas, niet te veel druk uit op de chip. </li><li> Incubeer de RootChip een nacht in vloeibaar medium. Om te voorkomen dat zwevende, plaatsen twee glazen dia&#39;s op de chip. Voeg een magnetische roerstaaf en sluit de schotel. </li><li> Breng het samenstel op een magnetische roerder en Schud de medium. </li><li> De RootChip de inhammen snijden de kanalen in een hoek van 30 ° om het apparaat normaal FACIlitate wortelgroei in de kanalen (figuur 1A). Ter ondersteuning groei in de gewenste richting, kantelt de montage door een glasplaatje onder petrischaal aan de zijde van de chip tegenover de uitlaten. </li><li> Om de licht / donker cyclus te behouden, verlichten de zaailingen met een ring lamp (Lichtsterkte: 100 μE m -2 s -1) aangesloten op een timer. </li></ol> 4. Aansluiten van de RootChip aan de Vervoerder <ol><li> De volgende dag, vul een afsluitbaar, pressurizable flesje met vloeibare groeimedium (Figuur 1B). </li><li> Keer de chip drager en plaats deze op een stabiele ondergrond. Verwijder de RootChip van de vloeistof en breng het PDMS kant naar beneden in de onderste opening van de chip-drager. Plaats de chip zodat de zijde met de controle laag inhammen wordt geconfronteerd met de kant van de drukleiding Slangconnectoren in de drager zijwand. </li><li> Droog het dekglas deonderkant van de chip door zachtjes te deppen met vloeipapier. Bevestig de RootChip aan de vervoerder met tape en rechts het geheel. </li><li> Slangconnectoren worden gemaakt door het snijden van flexibele kunststof microbore buis (Tygon, 0,20 &quot;ID x 0.060&quot; OD) in 5 cm lange stukken en verbinden van roestvrij staal microbore buizen (New England Small Tube, 0,025 &quot;OD x 0,013&quot; ID x 0,75 &quot; lang). Vul de slang aansluitingen met water met behulp van een spuit en sluit elke slangen connector in de overeenkomstige bestrijdingsprogramma laag inlaat op de chip. Het water zal later vullen de controle laag kanalen en worden gebruikt om de druk om de micromechanische kleppen te verzenden. </li><li> Steek de andere uiteinden van de lijnen in de media / flesje (s). Oefen druk uit op de oplossing flacon met een spuit lucht. De verhoogde luchtdruk in de flesje dwingt vloeistof in de leidingen. </li></ol> 5. Montage van de RootChip aan de microscoop <ol><li> Plaats de drager op de Microscope podium. Om de mogelijkheid van het samenstel verschuiving gedurende het experiment door trillingen in de kamer te verminderen wordt de drager precies in de uitsparingen van de fase inzetstuk. </li><li> De chip kleppen en de mediumstroom door de chip worden bestuurd door de luchtdruk. Twee lijnen met regelaars afgetakt een hoofd drukleiding - een wordt gebruikt om de mediumstroom door de kanalen controleren en de andere is verbonden met elektro-pneumatische kleppen die de push-up kleppen van de controle laag bedienen. De magneetventielen worden bediend vanuit de computer via de USB-afsluiterbesturing (ontwikkeld door Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Sluit beide drukregelaars voordat u de chip. </li><li> Voeg een paar ml water aan de reservoirs van de drager te houden de luchtvochtigheid hoog in de gemeente. Deze stap moet worden herhaald loop van meer experimenten om de planten niet uitdrogen. Houd het volume laag om t te minimaliserenhij hoeveelheid vloeistof kunnen worden gemorst de microscoop. Voor de lange termijn experimenten, kan de uitstroom uit de chip verkooppunten worden geleid in de reservoirs van de drager door het aansluiten van de chip verkooppunten aan de reservoirs met microbore buis (zie stap 4.4). Alternatief kan de uitstroom dat zich op de chip oppervlak verzameld pipetteren. </li><li> Bereid vierkante vellen doorzichtig plastic vel van beschermers (C-Line). Bevestig de doorzichtige plastic aan de vervoerder door de dubbelzijdige tape om een ​​hoge luchtvochtigheid in de vergadering te houden. </li><li> Plaats de ring licht over de chip en onderhouden van de licht / donker cyclus. De ring licht dient te worden uitgeschakeld voor de start van een experiment dat fluorescerende merkers gebruikt, omdat de directe verlichting zal interfereren met foto collectie. </li></ol> 6. Bediening van de RootChip het gebruik van de LabView-interface De RootChip controller interface voor de LabView software platform kanworden gedownload van onze website <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> De kleppen op de chip zijn gesloten door druk op de controle laag, in dit geval door de elektro-pneumatische kleppen. De controller interface maakt de bediening van de kleppen door te klikken op de knop onder de klep nummer. Heldergroene geeft van druk en sluiten van een klep chip (Figuur 2B). Activeer alle drie de oplossingsgerichte inlaatkleppen in de controller-interface voor het openen van de drukregelaars. Opmerking: De controller interface heeft een feedback-lus, die de controle van de status van het systeem mogelijk maakt. Deze functie kan worden geactiveerd door te klikken op de &quot;readback&quot; knop in de controller interface. </li><li> Open de drukregelaar voor de controle op laag en in eerste instantie ingesteld op 15 psi, open dan de regulator voor de stroom laag en in eerste instantie ingesteld op 5 psi. Afhankelijk van het gewenste debiet, kan de druk later worden aangepast. </li><li> Open de inlaatklep voor de groei medium bij uitstek om de kamers spoelen met medium. </li><li> Controleer afgifte paden onder de microscoop. Gewoonlijk wordt lucht in de stromingskanalen en moet worden verwijderd. Bovendien is de kanalen van de controle laag bevatten nog lucht die moet worden gedwongen en vervangen door het water uit de buis connectors (doodlopende vulling). Beide taken worden bereikt door spoelen elk van de acht kamers aantal (5 psi) tot alle lucht wordt uit de kanalen in de PDMS (&quot;ontgassen&quot;). Opmerking: De controller interface kan geprogrammeerd worden om experimenten te automatiseren. Dergelijke routines kunnen ook worden gebruikt om ontgas de chip. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Het belangrijkste doel van de RootChip is om een ​​imaging platform en een perfusie-systeem in een enkel apparaat te combineren met een hoge mate van integratie. Om de manipulatie aan te tonenvan de micro-omgeving van de wortels gespoeld we de kamers met donkere kleurstof (1:4 verdunning in hydrocultuur medium) en gemeten de uitwisseling van vocht in de kamers. Bij de aanbevolen druk van 5 psi we gemeten volledige uitwisseling binnen 10 seconden bij een berekende debiet van ongeveer 1,5 pl / min (figuur 3). Ook waargenomen wortelgroei zaailingen, in dit geval gekweekt in het donker en voorzien 10 mM glucose als externe energiebron (figuur 4). Afhankelijk van de groeicondities zoals licht en samenstelling van het medium, kunnen planten worden waargenomen in de RootChip tot drie dagen. De RootChip is gebruikt om intracellulaire glucose en galactose niveaus wortels expressie genetisch gecodeerd nanosensoren, gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 5-7 volgen. Wortels in de chip werden geperfuseerd met vierkante pulsen van glucose of galactose-oplossing ( <strong&gt; Figuur 5). De intracellulaire niveau van suikers werden gecontroleerd en hier uitgedrukt als een verhouding van de intensiteit van de acceptor fluorofoor Citrine de intensiteit van de donor ECFP. De stijging van de ratio geeft ophoping van suiker. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. RootChip principe. <ol class="ualpha"><li> De RootChip beschikt over acht observatie kamers voor de groei en de beeldvorming van wortels. De zaden eerst ontkiemen in een plastic kegels - vervaardigd uit plastic pipet tips - die gevuld zijn met een vast medium. De wortel tip groeit door het medium en bereikt de kamer waar een continue stroom van vloeibaar medium houdt de voorwaarden in de kamer constant. Micromechanische kleppen (rood) de stroom. De chip is aangebracht op een optische dekglas. Tekening niet op schaal. (Aangepast met toestemming van Grossmann et al.., 2011 Plant Cell.) </li><li> SchEME van een pressurizable flesje met membraan (rood). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Aansluiten en monteren RootChip. <ol class="ualpha"><li> Bovenaanzicht van de volledig verbonden RootChip en drager gemonteerd op een omgekeerde microscoop. </li><li> Schema illustreren de kleppensysteem en de controller interface. Een voorbeeld van een klep instellen van de fluïdumstroming leiden naar een kamer wordt. Hoewel kleppen 4 tot 8 fungeren als een, kleppen 0 tot 3 handeling groepen. Met dit systeem een ​​afzonderlijke ruimte kunnen worden aangepakt door het activeren van een combinatie van kleppen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Uitwisseling van oplossingen in de observatie lAmbers. Visualisatie van de uitwisseling van vocht in een observatie-kamer met behulp van kleurstof oplossing. Het beeld is een overlay van helderveld en valse kleuren intensiteit van de kleurstof signaal. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. On-chip wortelgroei. Observatie van een groeiende wortel uiting van een fluorescerende FRET nanosensor voor glucose / galactose in de loop van 20u. Tijd formaat: uu: mm, schaal bar: 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Het meten van intracellulaire suiker niveaus met behulp van FRET nanosensoren. <ol class="ualpha"><li> De hoeveelheid sensor wordt als citrien intensiteit in de wortelpuntje (links). De reactie van de intracellulaire FRET nanosensor de toepassing van glucose of galactose oplossing wordt als ratiometrische beelden. (Aangepast met toestemming van Grossmann et al.., 2011 Plant Cell) Schaal bar:. 100 micrometer. </li><li> Volgen FRET verhouding verandert als reactie op drie herhaalde vierkante pulsen van glucose (groen) en galactose (rood). </li></ol>

<ol><li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors%3A+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li>
<li>Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li>
<li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li>
<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li>
<li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li>
<li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-in-chip%3A+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De belangrijkste voordelen van de RootChip groei ten opzichte van conventionele methoden zijn de minimaal invasieve voorbereiding voor microscopie, de mogelijkheid om reversibel en herhaaldelijk af aan het wortelmilieu, en de capaciteit voor continue observatie van ontwikkelingsgebied bevoegde en fysiologisch gezond weefsel gedurende een periode van meerdere dagen. Vroeger werden zaailingen verticaal gegroeid op gegeleerde media en overgebracht naar een perfusiesysteem onmiddellijk vóór de proef, waardoor alleen het meten een wortel tegelijk 8. Microfluïdische middelen zijn gebruikt Arabidopsis, maar op een laag niveau integratie 9 of zonder perfusie regelaar 10. De RootChip combineert een hoge mate van integratie met de mogelijkheid om experimenten te automatiseren door middel van een zeer nauwkeurige begeleiding. Een ander voordeel van dit platform kenmerk van microfluïdische apparaten 11, dat slechts minimale hoeveelheden vloeistof moeten de wortel voorzien van de nodige moerRients, zelfs voor experimenten verspreid over meerdere dagen. De RootChip is momenteel ontworpen als een gebruiksvriendelijk apparaat, maar aangezien de productiekosten van chips zijn laag, de kleine hoeveelheden van de verbruikte reagentia maakt de chip nog steeds zeer rendabel. Er zijn enkele kritische stappen worden genomen om de gezondheid van de zaailingen waarborgen: Het volume in de kunststof kegels slechts 3-4 pi, die beginnen te drogen bij blootstelling aan lucht. Daarom is het essentieel dat de kegels worden overgebracht snel op de chip en de luchtvochtigheid is hoog gehouden tot aan de wortels hebben bereikt de observatie kamers, die hen zal voorzien van voldoende water. Stappen 4,2 tot 4,5 dient snel en zonder onderbreking het drogen van de zaailingen voorkomen worden. Stappen 3,5 tot 3,8 beschrijven de incubatie van de chip in vloeibare media waarin de wortels groeien in de waarneming kamers. Deze stap kan worden overgeslagen montage van de chip in de carrier onmiddellijk en het starten van een constante perfusie met groeimedium. Toch raden wij onderdompelen in groeimedium &#39;s nachts, want het heeft een aantal voordelen: 1) het creëert een vochtige omgeving, zodat de zaailingen minder snel gedroogd als ze groeien in de observatie kamer, 2) de chip wordt geweekt in vloeistof, zodat ontgassing (stap 6.4) zal sneller zijn. Het is belangrijk media met lage concentraties opgeloste stof. Meer geconcentreerde oplossingen kan neerslaan en verstoppen de kanalen, vooral als de chip wordt gedurende meerdere dagen. Wanneer het apparaat is verbonden met de luchtdruk lijn wordt mediumstroom geregeld door het veranderen hydraulische druk in de kleppen. Om te garanderen goede sluiting van de microbladveren kleppen is belangrijk om een ​​stuurdruk die ongeveer driemaal hoger dan de waterdruk. De waterdruk niet meer dan 15 psi de vloeistof wordt geduwd van de wortel inlaten. Hogere drukken may ook leiden delaminatie van de chip, die de chip onbruikbaar maakt. Een beperking van de RootChip dat PDMS is poreus en hydrofoob. Hoewel het materiaal nagenoeg inert aan waterige oplossingen, kan absorberen organische verbindingen 12. Dit kan interfereren met een snelle uitwisseling van oplossingen organische verbindingen kunnen lekken van het materiaal zelfs wanneer de toevoer van deze verbinding is gestopt bij de inlaat. Door de porositeit kan met organische oplosmiddelen opzwellen van de PDMS 12. Wij blijven de RootChip optimaliseren en het nut verlengen, bijvoorbeeld met wortels van gewassen. Wij geloven dat door het verbeteren van de toegang tot de wortel voor behandelingen en observatie, microfluïdische tools zoals de RootChip zal leiden tot nieuwe dimensies van wortel onderzoek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Items </td><td> Bron </td><td> Informatie </td></tr><tr><td> Chip carrier, software en andere informatie. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> CAD en CNC bestanden voor carrier fabricage, controller software en verdere informatie zijn te downloaden vanaf de website <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> Carriers kunnen ook worden besteld via deze website. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Gieterij </td><td> Masker ontwerpen en de fabricage protocollen zijn beschikbaar op aanvraag. Kant-en-klare RootChips kunnen worden besteld bij <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip-controller </td><td> -Home ingebouwde</td><td> Het geautomatiseerde afsluiterbesturing systeem is oorspronkelijk ontwikkeld door Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab. Een gedetailleerde instructies hoe je je eigen bediende klep controller te bouwen is te vinden op <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescentie beeldvorming van arabidopsis wortelgroei met rapid manipulatie van het wortelmilieu het gebruik van de rootchip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

De wortel fungeert als fysische anker van de plant en het orgaan verantwoordelijk voor opname van water en minerale nutriënten zoals stikstof, fosfor, sulfaat en sporenelementen installaties meten van de grond. Willen we een duurzame aanpak te ontwikkelen voor het produceren van hoge gewasopbrengst, moeten we beter begrijpen hoe de wortel ontwikkelt, neemt een breed spectrum van voedingsstoffen en interactie met symbiotische en pathogene organismen. Om deze doelen te bereiken, moeten we in staat zijn om wortels in microscopisch detail te onderzoeken na verloop van tijd een periode variërend van minuten tot dagen. We hebben de RootChip, een polydimethylsiloxaan (PDMS) - op basis van microfluïdische apparaat, die ons in staat om te groeien en beeld wortels van Arabidopsis zaailingen zonder dat dit fysieke stress naar de roots van tijdens de voorbereiding van beeldvorming 1 (figuur 1). Het apparaat bevat een gespleten kanaal structuur met micromechanische kleppen om de vloeistofstroom te begeleidenuit de oplossing inlaten elk van de acht waarneming kamers 2. Dit perfusie systeem maakt het mogelijk de wortel micro-omgeving te worden gecontroleerd en aangepast met precisie en snelheid. Het volume van de kamers is ongeveer 400 nl, waarvoor derhalve slechts minimale hoeveelheden meetoplossing. Hier bieden wij u een gedetailleerd protocol voor het bestuderen van wortel biologie op de RootChip met behulp van imaging-gebaseerde benaderingen met real-time resolutie. Roots kan worden geanalyseerd over een aantal dagen met behulp van time-lapse microscopie. Wortels kunnen worden geperfuseerd met voedingsoplossingen of remmers, en tot acht zaailingen kunnen worden geanalyseerd in parallel. Dit systeem heeft het potentieel voor een breed scala aan toepassingen, waaronder de analyse van wortelgroei in de aanwezigheid of afwezigheid van chemicaliën, fluorescentie-gebaseerde analyse van genexpressie, en de analyse van biosensoren, bijvoorbeeld FRET nanosensoren 3.

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

De wortel fungeert als de fysieke verankering van de plant en is het orgaan dat verantwoordelijk is voor de opname van water en minerale voedingsstoffen zoals stikstof, ...

Om maximale opbrengsten te verkrijgen, moeten planten worden voorzien van een reeks nutriënten; nutriëntentekorten, stressfactoren zoals koude of extreme hitte, droogte of pathogenen veroorzaken elk jaar enorme verliezen in de gewasopbrengst. De oorsprong van veel van deze problemen ligt vaak ondergronds. De wortel is het fysieke anker van de plant, maar het is ook het orgaan dat verantwoordelijk is voor de wateropname en voor de opname van minerale nutriënten zoals stikstof, fosfaatsulfaat en vele sporenelementen.Als we duurzame benaderingen willen ontwikkelen om een hoge gewasopbrengst te realiseren, moeten we beter begrijpen hoe de wortels zich ontwikkelen, hoe zij dit brede spectrum aan voedingsstoffen opnemen en hoe zij interageren met symbiotische en pathogene organismen. Om dit te kunnen doen, moeten we in staat zijn om wortels op microscopisch niveau te onderzoeken, om voor de hand liggende redenen. De biologie van wortels bestuderen is altijd uitdagender geweest dan de studie van de bovengrondse delen van de plant.Aangezien wortels gewoonlijk ondergronds verborgen zijn, zijn ze niet gemakkelijk toegankelijk voor microscopische studies. Verwijdering uit de bodem veroorzaakt ernstige schade aan het wortelstelsel en is daarom geen goede manier om hun gedrag te bestuderen. Een oplossing om wortels toegankelijker te maken is om ze te kweken op, zoals in dit voorbeeld getoond wordt, in hydroponische media.Het kweken van planten in gegelede media of in hydroponische media is met veel succes toegepast in talrijke wortelstudies, maar met deze methoden blijft het zeer moeilijk om wortels in microscopisch detail en over langere perioden te bestuderen. Om zo dicht mogelijk bij de groeiende wortel te kunnen komen en elke fysieke stress door de voorbereiding op beeldvorming te vermijden, hebben we een platform gebouwd waarmee we wortels kunnen kweken en afbeelden, en dat tegelijkertijd in staat stelt om de micro-omgeving van de wortels met zeer hoge precisie en snelheid te controleren en te modificeren. Dit platform noemen we de root chip. De root chip is een microfluïdisch apparaat gefabriceerd uit PDMS, een organisch polymeer op basis van siliconen.De chip is voorzien van observatiekamers voor de groei en beeldvorming van wortels van zaailingen van rabbit opsis. De zaden kiemen eerst in plastic kegels die zijn gemaakt van plastic pipetpuntjes, welke we vullen met vast medium. De wortelpunt groeit vervolgens door het medium en bereikt de kamer, waar deze wordt blootgesteld aan een continue stroom van vloeibaar medium, waardoor de condities in de kamer worden gehandhaafd.Constante micromechanische kleppen ontwikkeld door het lab van Steve Quake aan de Stanford University worden hier in rood getoond. Omdat de chip is gemonteerd op een transparant dekglas zoals gewoonlijk wordt gebruikt voor microscopie, kunnen alle processen in de observatiekamer worden gemonitord met een omgekeerde microscoop. De vertakte kanaalstructuur die de vloeistofstroom geleidt, is onder de microscoop zichtbaar.De wortelchip bestaat uit twee lagen: een controllaag met de kleppen en een stroomlaag met de kanalen waarlangs groeimedia en testoplossingen naar de observatiekamers stromen. Het volume van deze kamers is ongeveer 400 nanoliters. Dit betekent dat er slechts zeer kleine hoeveelheden oplossing nodig zijn en dat condities zeer snel gewijzigd kunnen worden.Dit protocol beschrijft hoe levende wortels van acht Arabidopsis-zaailingen worden voorbereid voor parallelle microscopische beeldvorming op de wortelchip en gedurende maximaal drie dagen worden geobserveerd. Begin met het vullen van een Petri-schaal van 10 millimeter met groeimedium dat 1% agar bevat, terwijl het medium nog vloeibaar is. Vul pipetteertips van 10 µL met 5 µL medium uit de Petri-schaal met behulp van een meerkanaalpipet. De gevulde tips worden bewaard in de pipetteertipdoos totdat het medium gestold is.Snijd vervolgens plastic kegels van vier millimeter lang en plaats deze rechtop in een Petrischaal met vast groeimedium. Na oppervlaktestabilisatie worden individuele zaden bovenop de met medium gevulde kegels geplaatst. De schaal wordt vervolgens afgedicht met micropore-tape en de plaat wordt bij vier graden bewaard om de kieming te synchroniseren.Na drie dagen worden de platen overgebracht naar een groeikast om de kieming te starten. Onze groeiomstandigheden in dit experiment zijn 23 °C. Bij een cyclus van 16 uur licht en 8 uur donker, vijf tot zeven dagen na de kieming, zouden de zaailingen klaar moeten zijn voor overdracht naar de wortelchip; de gezondheid van de zaailing en de wortellengte moeten worden gecontroleerd en, indien van toepassing, moet de expressie van een fluorescente marker onder een dissectiemicroscoop worden gecontroleerd.Zodra de worteltoppen van de kiemplanten de onderste uitlaat van de plastic kegel bereiken, worden individuele kiemplanten gemarkeerd voor overdracht naar de chip. Er moeten ongeveer 10 kiemplanten worden geselecteerd voor het geval er één beschadigd raakt tijdens de overdracht om de wortelchip te steriliseren. Voor langetermijnexperimenten wordt het apparaat in weefsel gewikkeld, in een glazen petrischaal geplaatst en geautoclaveerd.Deze chip is zojuist geautoclaveerd. Na het afkoelen van de chip wordt deze bedekt met vloeibaar groeimedium. De chip moet volledig bedekt zijn, maar het vloeistofniveau mag niet hoger zijn dan drie millimeter boven het chipoppervlak.Een pipet van 20 µL wordt gebruikt om medium door de wortelinlaat en de uitlaat van de kamer te trekken. Hiermee wordt de observatiekamer gevuld. Met het medium geselecteerde plastic kegeltjes worden nu in de wortelchip geplaatst.De kegel moet nauw aansluiten op de inlaatopeningen. Aangezien de root-chip is gemonteerd op een dunne laag optisch glas, moet men voorzichtig zijn om niet te veel druk op de chip uit te oefenen. Na deze stap is de chip gereed voor een incubatie van één nacht in het vloeibare medium om te voorkomen dat de chip gaat drijven.Twee glazen objectglazen, waarvan één doormidden is gesneden, worden op de chip geplaatst. Een magnetische roerstaaf wordt toegevoegd en de schaal wordt gesloten. De assemblage wordt nu overgeplaatst naar een magnetische roerder, die het medium voorzichtig zal agiteren om de wortelgroei naar de uitlaten te faciliteren.De inlaatopeningen van de root-chip zijn onder een hoek geponst om de groei in de gewenste richting verder te ondersteunen. Kantel de assemblage lichtjes door de zijde van de chip tegenover de uitlaatopeningen op te tillen.De chip wordt verlicht met een ringlamp die is aangesloten op een tijdschakelaar om het licht-donkerritme te handhaven. Na de overnachtincubatie wordt vloeibaar groeimedium voorbereid in een afsluitbaar, drukbestendig flacon. De volgende stappen moeten snel en zonder onderbreking worden uitgevoerd om uitdroging van de zaailingen te voorkomen.De chip wordt nu uit het vloeibare medium gehaald en ondersteboven in de onderste opening van de chiphouder geplaatst, die ook is omgekeerd. De chip moet zodanig georiënteerd worden dat de zijde met de inlaatopeningen van de controllaag naar de zijde van de drukleiding is gericht. Twee grote connectoren bevinden zich in de zijwand van de houder.Het dekglas aan de onderkant van de chip wordt gedroogd door voorzichtig te droogdeppen met vloeipapier en vervolgens aan de houder te bevestigen. Met tape wordt het geheel daarna omgekeerd. De slangconnectoren worden met een spuit gevuld met water en elke slangconnector wordt in de overeenkomstige inlaat geplugd.Op de chip. De slangetjes zijn aangesloten op het medium en de oplossing. Flessen en lucht worden vervolgens uit de lijnen verwijderd door druk uit te oefenen op de oplossingfles met een spuit met lucht; de drager is bedekt met transparant plastic.Om een hoge luchtvochtigheid in de assemblage te behouden, wordt de houder op de objecttafel van de microscoop geplaatst. Deze dient precies in de inkepingen van de tafel te passen. De chipkleppen, alsook de doorstroming van medium door de chip, worden geregeld via luchtdruk.Twee lijnen met regelaars zijn afgetakt van een hoofddruklijn. Eén wordt gebruikt om de vloeistofstroom te regelen en de andere is verbonden met magneetventielen. Deze ventielen worden via de USB-ventielcontroller vanuit de computer bediend en zijn verantwoordelijk voor het aansturen van de ventielen op de chip.Beide drukregelaars moeten gesloten zijn voordat de chip wordt aangesloten. Slangen, connectoren en oplossingsflesjes worden nu bevestigd aan de overeenkomstige druklijnen. Enkele milliliters water worden toegevoegd aan de reservoirs van de houder.Deze stap moet mogelijk herhaald worden tijdens langere experimenten. Om de luchtvochtigheid hoog te houden, dient het volume beperkt te blijven om de potentiële hoeveelheid vloeistof die op de microscoop kan morsen te minimaliseren. De ringlamp wordt in positie boven de chip geplaatst om de licht-donkercyclus te handhaven tot het experiment begint.Kleppen op de chip worden gesloten door druk uit te oefenen, in dit geval door de solenoïde luchtkleppen te openen. De LabVIEW-interface maakt het mogelijk de kleppen te bedienen door op de knop onder het klepnummer te klikken. Felgroen geeft aan dat er druk wordt uitgeoefend en dat een chipklep is gesloten.Dit schema illustreert de organisatie van het kleppensysteem, waarbij kleppen vier tot en met acht als enkele kleppen fungeren en kleppen nul tot en met drie in groepen werken. Met dit systeem kan een individuele kamer worden aangestuurd door een combinatie van kleppen te activeren; om de vloeistofstroom bijvoorbeeld uitsluitend naar de derde kamer van bovenaf te leiden, moeten kleppen nul, drie en vier worden gesloten. Daarnaast bepalen klep zes, zeven en acht welke oplossing wordt gebruikt voor het spoelen van de inlaatopeningen A, B en C; activeer nu alle drie de oplossingsinlaatkleppen om deze te sluiten.De interface van de controller beschikt over een feedbackloop, waardoor de status van het systeem kan worden gemonitord. Deze functie kan worden geactiveerd door op de read back-knop te klikken. De drukregelaar voor de controllaag wordt eerst geopend en ingesteld op 15 PSI.Open vervolgens de drukregelaar voor de stroomlaag en stel deze in op vijf PSI. De inlaatklep voor het gekozen groeimedium wordt geopend en de kamers worden gespoeld met medium; de stroompaden moeten onder de microscoop worden gecontroleerd. In de meeste gevallen is er lucht ingesloten in de kanalen die verwijderd moet worden.Daarnaast bevatten de kanalen van de controlelucht nog lucht die eruit geperst en vervangen moet worden door het water uit de slangkoppelingen. Dit proces wordt dead end filling genoemd. Beide taken worden uitgevoerd door elk van de acht kamers meerdere keren door te spoelen totdat alle lucht uit de kanalen in de PDMS is geperst.Het systeem kan worden geprogrammeerd om experimenten te automatiseren. Dergelijke routines kunnen ook worden gebruikt om de chip te ontgassen. Het hoofddoel van de root-chip is om een imagingplatform en een perfusiesysteem in één enkel apparaat te combineren.Om de manipulatie van de wortelmiromgeving aan te tonen, hebben we de kamers gespoeld met kleurstof en de uitwisseling van vloeistof binnen de kamers gemeten. Bij de aanbevolen druk van vijf PSI maten we een volledige uitwisseling binnen 10 seconden bij een berekende stroomsnelheid van ongeveer 1,5 microliters per minute. We hebben daarnaast de wortelgroei waargenomen van zaailingen die in dit geval in het donker zijn gekweekt en voorzien van 10 millimolar glucose als externe energiebron.Afhankelijk van de groeicondities, zoals licht en de samenstelling van het medium, kunnen de planten tot drie dagen in de root chip worden geobserveerd. Dit systeem is gebruikt om intracellulaire glucose- en galactosegehaltes te monitoren in wortels die genetisch gecodeerde nanosensoren tot expressie brengen. Deze sensoren, gebaseerd op Förster-resonantie-energietransfer of FRET, zijn ontwikkeld in het Frommer-lab.Voor dit experiment werden de wortels in de chip geperfuseerd met vierkante pulsen van een glucose- of galactoseoplossing. De intracellulaire suikerniveaus werden gemonitord en worden hier weergegeven, uitgedrukt als de ratio van de intensiteit van de acceptor fluoro four citrine ten opzichte van de intensiteit van de donor ECFP aan de linkerzijde. In het midden observeren we de hoeveelheid citrine-sensoren in het ratiometrische beeld van de wortelpunt, en rechts volgen we de hoeveelheid suiker als reactie op drie opeenvolgende vierkante pulsen van glucose in het groen en galactose in het rood.De stijging in de ratio duidt op een ophoping van suiker. De belangrijkste voordelen van de wortelchip ten opzichte van conventionele kweekmethoden zijn de minimaal invasieve preparatie voor microscopie, de mogelijkheid om de wortelomgeving reversibel en herhaaldelijk te wijzigen en de capaciteit voor continue observatie van ontwikkelingscompetent en fysiologisch gezond weefsel over een periode van meerdere dagen. Een ander zeer belangrijk voordeel is dat er slechts minimale hoeveelheden vloeistof nodig zijn om de wortels gedurende een langere periode van alle benodigde voedingsstoffen te voorzien.Dit maakt de root chip zeer kosteneffectief, vooral wanneer er dure reagentia worden gebruikt. We blijven de root chip optimaliseren en de bruikbaarheid ervan uitbreiden, omdat we geloven dat het toegankelijker maken van dit belangrijke orgaan voor behandelingen en observaties ervoor kan zorgen dat microfluïdische instrumenten zoals de root chip nieuwe dimensies in het plantonderzoek ontsluiten. Meer informatie over het bouwen van een root chip-systeem is te vinden op onze website.Chips kunnen worden besteld bij de Stanford Foundry.

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor snelle verzameling afbeeldingen van Arabidopsis zaailingen reageren op een stimulus zwaartekracht met behulp van commercieel verkrijgbare flatbed scanners. De methode maakt het mogelijk voor goedkope, high-volume vastleggen van beelden met hoge resolutie vatbaar voor downstream analyse algoritmen.

Met behulp van flatbed scanners om High-resolution-Time vervallen Beelden van de Arabidopsis wortel gravitropic Response Collect

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Dit protocol toont een methode voor de bereiding van plantenmonsters voor lichtbladmicroscopie. De opstelling wordt gekenmerkt door het verticaal monteren van de plant op het oppervlak van een gel en het laten groeien in gecontroleerde lichte omstandigheden. Dit maakt langdurige observatie van de ontwikkeling van plantenorganen mogelijk in gestandaardiseerde omstandigheden.

Lichtwaaier fluorescentiemicroscopie van plantenwortels Kweken op het oppervlak van een gel

Hier wordt een simpele techniek voor de confocal time-lapse beeldvorming van wortel- en hypocotyloplossing met hoge resolutie voor maximaal 3 dagen gegeven met behulp van hoge numerieke diafragma-doelstellingen en perfluorodecaline als onderdompelingsmedium.

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Dit artikel laat zien hoe cultuur Arabidopsis thaliana zaailingen in een twee-laag microfluidic platform dat de belangrijkste wortel en root haren op een interne optische vlak beperkt. Dit platform kan worden gebruikt voor real-time optische beeldvorming van fijne wortel morfologie alsook wat betreft hoge resolutie beeldvorming door andere middelen.

Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel

Leer hoe je Arabidopsis-wortels kweekt en beeldt met de RootChip, een microfluidisch platform voor gecontroleerde groeiomstandigheden. Deze methode maakt langdurige microscopische observatie en snelle manipulatie van het wortelmilieu mogelijk.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip (Video) | JoVE Journal

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

Meer video's verkennen