Het onderzoeken van Bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes

Dit biochemisch gedefinieerde modelsysteem van grote unilamellaire vesicles imiteert het buitenste mitochondriale membraan om de functie van BCL2-eiwitten in vitro te observeren. Combineer eerst de lipiden en vorm een lipidenfilm in een afgesloten vial. Bereid vervolgens een verse LUV-oplossing en solubiliseer de lipidenfilm.

Extrude vervolgens de lipide-oplossing en zuiver de grote LUV's via gelfiltratie. De laatste stap is het analyseren van de LUV's op een door detergent geïnduceerde toename van de fluorescentie. Uiteindelijk wordt het LUV-modelsysteem gebruikt om de functie en regulatie van membraanpermeabele eiwitten, zoals recombinante BCL2-eiwitten, te evalueren.

Deze benadering met gebruik van grote unilamellaire blaasjes biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande systemen zoals mitochondriën. Omdat ze worden gegenereerd met gezuiverde lipiden in afwezigheid van eiwitten, zijn ze biochemisch gedefinieerd wat betreft zowel compositie als grootte.

Dit maakt een duidelijke interpretatie van de resultaten mogelijk, aangezien de enige eiwitten in uw onderzoek de eiwitten zijn die u zelf toevoegt. Deze methode kan mechanistische inzichten verschaffen in het vermogen van de BCL2-familie om de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan te reguleren. Het kan ook worden toegepast op andere systemen die membraanremodellering en permeabiliteitsactiviteit onderzoeken.

Dit zou mitochondriale dynamische machinery of bacterieel gevormde toxines omvatten. Werk in een zuurkast met minimale verlichting. Spoel een glazen spuit van het type Hamilton Gast met chloroform.

Combine vervolgens de 4 mg chloroform-gesolubiliseerde lipiden in een glazen vial van 1,5 ml. Om het chloroform te verwijderen, wordt een zachte stroom van een inert gas zoals stikstof of argon toegepast. Verifieer na twee tot drie uur de aanwezigheid van een droge lipidelaag op de bodem en wanden van de vial in LUV-buffer.

Bereid oplossingen van 500 µL van de polyanion-kleurstof en de CAS-ionische quencher voor en meng deze door middel van vortexen. Combineer vervolgens de NTS- en DPX-oplossingen, vortex deze gedurende één minuut en sonicat ze in een ultrasoon waterbad om te waarborgen dat de oplossingen volledig zijn opgelost en homogeen zijn.

Voeg nu de A-N-T-S-D-P-X-oplossing toe aan de lipidefilm en sluit het flacon af met parafilm. Sonicate de lipidefilm gedurende vijf minuten; de oplossing zal na sonicatie melkachtig worden. Zorg ervoor dat de oplossing volledig is gesolubiliseerd, aangezien kleine lipideaggregaten de volgende stappen negatief zullen beïnvloeden. Controleer daarnaast de bodem en de zijkanten van het flacon om er zeker van te zijn dat er geen lipidefilm is achtergebleven.

Stel de extruder samen volgens de richtlijnen van de fabrikant, waarbij LUV-buffer wordt gebruikt om de filtersteunen en het polycarbonaatmembraan te bevochtigen. Draai de behuizing van de unit vast zodat er geen volumeverlies optreedt tijdens de extrusie, maar niet té strak om het membraan niet te beschadigen. Test de extruder met LUV-buffer om er zeker van te zijn dat er geen lekken of problemen zijn. Vul nu de rechterspuit met de lipide-oplossing en extrudeer 31 keer, zodat de grote ELLA-vesikels minstens één keer door het membraan passeren en worden opgevangen in de linkerspuit. De eerste paar extrusies kunnen iets meer druk vereisen als de oplossing plotseling snel door het membraan stroomt.

Controleer het membraan op scheuren en vervang dit indien nodig. Voeg in één stap toe aan de kolom. Vermijd verstoring van de grensvlak van de kralen.

Laat de buffer uit de kolom lopen. Wanneer de stroom stopt, sluit u de kolom af en vult u deze voorzichtig met LUV-buffer, waarbij u erop let dat de beads niet worden verstoord. Verwijder vervolgens de stop en verzamel zes fracties van één milliliter.

De AUV's elueren normaal gesproken in fractie drie en vier en kunnen worden geïdentificeerd aan hun troebele uiterlijk; recycle de kolomspoeling en bewaar deze bij vier graden Celsius. De UUV's in de kolomfractie worden gedetecteerd door een toename in fluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van chaps. Vergeet niet om voor alle LUV-studies zwarte, ondoorzichtige 96-wells platen te gebruiken.

Pipetteer 100 µL LUV-buffer of LUV plus 0,5% chaps in zes wells. Voeg aan elke well vijf µL van de betreffende fractie toe en meng voor de biotech H one synergie. Open de gen five 2.0-software en stel een excitatiegolflengte van 355 nm en een emissiegolflengte van 520 nm in.

Stel de gain-spanning in op 125 optiekpositie bovenaan en verhoog de leeshoogte met 5,5 millimeters. Lees nu de plaat uit bij 37 graden Celsius en identificeer de fracties die LUV bevatten. Neem de fracties van gezuiverde LUV af.

Deze assays zijn ontworpen om het vermogen van BCL2-proteïnen om direct LUV-permeatie te induceren te meten, evenals voor de regulatie van de permeatieactiviteit. Combineer de assaycomponenten in de volgorde van toevoeging. Gedetailleerde informatie over de titraties van BS- en bid-proteïnen is beschikbaar in het bijbehorende manuscript.

Incubeer de reacties bij 37 °C voor de tijdspunten van de assay. Plaats de plaat in de microplate reader, die de plaat zal schudden en de fluorescentie zal meten zoals eerder getoond. In dit experiment worden met OG-detergens geactiveerde backs gebruikt om een positieve controle voor LUV-permeatie te genereren.

Het is opmerkelijk dat OG-concentraties onder 0,025% hier geen directe invloed hebben op de permeatie van LUV. Een behandeling met 0,5% chaps wordt ook gebruikt om de maximale hoeveelheid LUV-fluorescentie per assay te bepalen. Een noodzakelijk startpunt voor het bestuderen van LUV-permeatie met BCL-2-familie-eiwitten is het vaststellen van de concentraties Bax en Bid om een optimale release te bevorderen.

Deze titratiecurves van backs en bid tonen de minimale achtergrondvrijgave en optimale synergie. Alternatief kan de LUV-permeatie kinetisch worden gemeten. Deze metingen werden elke twee minuten gedurende 30 minuten uitgevoerd, met voorafgaand aan elke meting twee seconden licht schudden van de plaat.

Dit experiment bepaalt de invloed van een anti-apoptose-eiwit op BAX- en BID-afhankelijke LUV-permeatie. BCL-XL remt de activiteit van BAX en BID op een dosisafhankelijke manier. In een D-repressie-assay kan het remmende effect worden omgekeerd door de toevoeging van daaropvolgende BH3-only-eiwitten.

Bijvoorbeeld, puma beta bindt aan BCL xl, waardoor backs en bid kunnen synergeren en permeabiliseren. De grote ELLA-vesikels. Zodra deze techniek voor het genereren van groteculaire vesikels onder de knie is, maakt dit een efficiënte en snelle analyse van BCL-2-familie-eiwitten, peptiden en kleine moleculen mogelijk in een biochemisch gedefinieerde omgeving die vergelijkbaar is met het buitenste mitochondriale membraan. Belangrijk is dat deze assay de snelle analyse van honderden condities mogelijk maakt met behulp van zowel eindpunt- als kinetische parameters.

Vergeet niet dat zowel UUVs als BCL two-eiwitten zeer gevoelig zijn voor artefacten geïnduceerd door detergentia. Gebruik schone, detergentvrije apparatuur om reproduceerbare resultaten te garanderen.