Name: Het onderzoeken van Bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer hoe je grote unilamellaire blaasjes (LUVs) produceert om Bcl-2 familie-eiwitinteracties te bestuderen. Deze methode bootst de buitenste mitochondriale membraan na en biedt inzicht in apoptoseregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen alle leden van het Chipuk Laboratory bedanken voor hun collegialiteit en steun. Daarnaast willen wij Tomomi Kuwana en Donald Newmeyer erkennen voor het ontwikkelen van de experimentele basis voor dit werk. Dit werk werd ondersteund door: NIH CA157740 (aan J.E.C.), en een pilotproject van NIH P20AA017067 (aan J.E.C.). Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door Research Grant 5-FY11-74 van de March of Dimes Foundation (aan J.E.C.).

1. Lipiden combineren en een lipidefilm creëren
<ol>
	<li>Voeg in een zuurkast bij minimale verlichting de in chloroform opgeloste lipiden samen in een amberkleurig glazen buisje van 1,5 ml met behulp van een met chloroform gespoelde Hamilton gasdichte glazen spuit. Deze combinatie levert ongeveer 4 mg lipid op (Figuur 1A).
	<ul>
		<li>Cardiolipine 10 mg/ml (CL) - 63 μl</li>
		<li>Fosfatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl</li>
		<li>Fosfatidylethanolamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl</li>
		<li>Fosfatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl</li>
		<li>Fosfatidylserine 10 mg/ml (PS) - 65 μl</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Om het chloroform te verwijderen, wordt een zachte stroom inert gas (bijv. stikstof of argon) in het buisje geleid. Wanneer het mengsel droog is, wat gewoonlijk 2 - 3 uur duurt, wordt er een lipidenfilm zichtbaar op de bodem en wanden van het buisje (Figuur 1A).</li>
</ol>
2. Bereid liposoomoplossing
<ol>
	<li>Bereid in 1,7 ml microcentrifugebuisjes 500 μl van 12,5 mM ANTS in LUV-buffer (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) en 500 μl van 45 mM DPX in LUV-buffer voor (Figuur 1B).</li>
	<li>Meng de ANTS- en DPX-oplossingen, vortex gedurende 1 min en sonicize gedurende 1 min bij kamertemperatuur. De sonicatie wordt uitgevoerd in een ultrasoon waterbad (bijv. Branson 3510MTH, geen instelling, enkel 'aan'). Dit zorgt ervoor dat de oplossingen volledig gesolubiliseerd en homogeen zijn.</li>
	<li>Voeg de ANTS/DPX-oplossing toe aan de lipidefilm en sluit het flacon af met parafilm (Figuur 1B).</li>
	<li>Sonicize de lipidefilm gedurende 5 min in het bovenstaande waterbad. De oplossing zal na sonicatie melkachtig ogen. Zorg dat de lipidefilm volledig is gesolubiliseerd, aangezien kleine lipideaggregaten de volgende stappen negatief zullen beïnvloeden. Controleer daarnaast de zijkanten en de bodem van het flacon om er zeker van te zijn dat er geen lipidefilm achter is gebleven (Figuur 1B).</li>
</ol>
3. Extrusie en zuivering van liposomen
<ol>
	<li>Assembleer de extruder volgens de richtlijnen van de fabrikant en gebruik LUV-buffer om de filtersteunen en het polycarbonaatmembraan te bevochtigen. Draai de behuizing van de unit vast zodat er geen volumeverlies optreedt tijdens de extrusie, maar niet zo strak dat het membraan scheurt. Het is raadzaam om de extruder te testen met LUV-buffer om er zeker van te zijn dat er geen lekken of problemen zijn.</li>
	<li>Begin met de lipidoplossing in de rechterspuit, extrudeer de lipidoplossing 31 keer, waarna de LUV's in de linkerspuit terechtkomen; dit zorgt ervoor dat alle lipiden minstens één keer door het membraan zijn gegaan. De eerste paar keer kan er iets meer druk nodig zijn om door het membraan te dringen. Als de oplossing plotseling snel door het membraan stroomt, controleer het membraan dan op scheuren en vervang het indien nodig (Afbeelding 1C).</li>
	<li>Stel een Sepharose S-500 zwaartekrachtstroomkolom van 10 ml op (1,0 cm x 20 cm, 10 ml bead-volume). Was met 3 kolomvolumes LUV-buffer, laat de kolomstroom stoppen en sluit af met een dop. Aangezien deze stap enige tijd in beslag neemt, verdient het de voorkeur om met het wassen te beginnen wanneer de lipiden worden samengevoegd om te drogen. Houd de kolom simpelweg afgedekt tot u deze wilt gebruiken.</li>
	<li>Voeg de geëxtrudeerde LUV's in één stap toe aan de kolom en voorkom dat de interface van de beads wordt verstoord. Laat de buffer uit de kolom lopen totdat de stroom stopt en plaats een dop. Vul de kolom voorzichtig met LUV-buffer. Wees opnieuw voorzichtig bij het toevoegen van de buffer zodat de beads niet worden verstoord (Afbeelding 1C).</li>
	<li>Verwijder de dop en verzamel 6 x 1 ml fracties. De LUV's elueren normaal gesproken in fracties 3 en 4 en kunnen worden geïdentificeerd aan hun troebele uiterlijk. Zodra de fracties zijn verzameld, wast u de kolom met 5 volumes water en 2 volumes 20% ethanol. Bewaar de kolom bij 4 °C (Afbeelding 1C).</li>
	<li>Bewaar de fracties bij 4 °C in het donker totdat ze worden getest.</li>
</ol>
4. Test de kolomfracties
<ol>
	<li>De kolomfracties worden nu getest op fluorescentie door LUV-buffer te vergelijken met LUV-buffer aangevuld met 0,5% CHAPS. Fracties waarvan de fluorescentie toeneemt door de aanwezigheid van CHAPS bevatten LUV's. Pipetteer telkens 100 μl LUV-buffer of LUV-buffer + 0,5% CHAPS in zes putjes en voeg 5 μl van de betreffende fractie toe, daarna mengen. Gebruik voor alle LUV-studies ondoorzichtige, zwarte, onbehandelde 96-wells platen (Figuur 1D).</li>
	<li>Lees de plaat af bij 37 °C met de volgende parameters: Excitatiegolflengte: 355 nm; Emissiegolflengte: 520 nm; Gain (voltage): 125; Optische positie: Top; Leeshoogte: 5,5 mm. Deze instellingen zijn voor de BioTek H1 Synergy met gebruik van Gen 5 2.0 software (Figuur 1D).</li>
	<li>Fracties 3 en 4 vertonen over het algemeen een 5- tot 10-voudige toename in fluorescentie. Combineer na analyse de LUV-bevattende fracties en bewaar deze bij 4 °C in het donker; er zal ongeveer 2 ml van ~ 2 mM lipid worden gezuiverd (Figuur 1D).</li>
</ol>
5. BCL-2-familieonderzoeken met behulp van LUV's
<ol>
	<li>BCL-2-eiwitten worden getest op hun vermogen om direct LUV-permeabilisatie te induceren, en op de regulatie van deze permeabilisatieactiviteit. LUV-assays worden gewoonlijk uitgevoerd in volumes van 100 μl, bij 37 °C, en kunnen worden geanalyseerd als één enkel tijdspunt na 30 - 60 min (Figuren 2A-C, 3A-B), of via kinetische studies elke 1 - 2 min gedurende maximaal 1 uur (Figuur 2D). Een representatief assay-ontwerp waarin de componenten, stock/eindconcentraties en de volgorde van toevoeging worden beschreven, is bijgevoegd (Tabel 1). Het is bovendien raadzaam om de microplaatlezer de plaat voorzichtig te laten schudden vóór elke meting. De eerste paar minuten geven vaak sporadische metingen (waarschijnlijk door temperatuurveranderingen, menging, etc...), dus we houden over het algemeen rekening met datapunten na 2 - 3 metingen in een kinetische studie. Het is ook niet ongebruikelijk dat er grote foutenbalken ontstaan voor sommige condities vanwege variabiliteit in LUV-batches en de efficiëntie van eiwitinteracties bij grensconcentraties van activatie of inhibitie.</li>
	<li>Voorraden van BCL-2-familie-eiwitten moeten worden verdund in LUV-buffer tot een concentratie van 100x, en de benodigde titraties van BAX, BID en alle andere eiwitten worden uitgevoerd om de laagste concentraties te bepalen die nodig zijn om minimale BAX-afhankelijke LUV-permeabilisatie te detecteren in afwezigheid van BID, en significante synergie tussen BAX en BID. Bovendien zijn voor alle andere eiwitten titraties vereist om eiwitverspilling te beperken en de concentraties van daaropvolgende eiwittoevoegingen te minimaliseren.</li>
</ol>
6. Representatieve resultaten
Er zijn talloze opties om de BCL-2-familie-afhankelijke regulatie van LUV-permeabilisatie waar te nemen en te onderzoeken. Om een positieve controle voor LUV-permeabilisatie te genereren, gebruiken we detergent-geactiveerd BAX12. Het detergent, n-octyl-β-D-glucoside (OG), triggert kunstmatig de activatie van BAX (voor 100 μl van 2,3 μM OG-BAX: 5 μg BAX + 0,7% OG in LUV-buffer, incuberen gedurende 60 min bij 4 °C, aliquoteren en bewaren bij -80 °C), waardoor OG-BAX (10 - 100 nM) als een betrouwbare positieve controle kan worden gebruikt. Merk op dat OG-concentraties onder de 0,025% de LUV-permeabilisatie niet direct beïnvloeden. Een behandeling met 0,5% CHAPS wordt gebruikt om de maximale hoeveelheid LUV-fluorescentie per assay te bepalen, en deze waarde stelt de 100%-waarde vast. Alle behandelingen moeten in triplikaat worden opgezet. Een voorbeeld van de opzet van een LUV-controleassay is weergegeven in Tabel 1, en de bijbehorende gegevens worden gepresenteerd in Figuur 2A.
Een noodzakelijk startpunt voor het bestuderen van de permeabilisatie van LUV met BCL-2-familie-eiwitten is het vaststellen van de concentraties BAX en BID die een optimale release bevorderen. Aangezien individuele eiwitpreparaten verschillende achtergrondactiviteiten voor permeabilisatie zullen vertonen, is het raadzaam om te titreren voordat complexere analyses worden opgezet. BAX (50 - 200 nM) en BID (0 - 10 nM) moeten worden getitreerd voor een minimale achtergrondrelease en optimale synergie, zoals respectievelijk weergegeven in Figuren 2B-C. Diverse vormen van het BID-eiwit kunnen worden gekocht bij R&amp;D Systems; alternatief is het BID BH3-domeinpeptide verkrijgbaar bij Anaspec. Er is geen commerciële vorm van BAX die geschikt is voor LUV-assays, daarom moet dit worden tot expressie gebracht en gezuiverd met behulp van gepubliceerde methoden3,13.
Zodra de concentraties en synergie van BAX en BID zijn vastgesteld, is een gebruikelijke assay het bepalen van de invloed van anti-apoptotische eiwitten op de BAX- en BID-afhankelijke permeabilisatie van LUVs. BCL-xL is een commercieel verkrijgbaar anti-apoptotisch BCL-2-lid dat, op een dosisafhankelijke manier, de activiteit van BAX en BID remt, gewoonlijk in het bereik van een 5 - 10 voudig molair overschot ten opzichte van BAX of BID (Figuur 3A). Dit remmende effect kan worden opgeheven door de toevoeging van daaropvolgende BH3-only-eiwitten (2 - 5 voudig molair overschot ten opzichte van BCL-xL) of BH3-domeinpeptiden (5 - 10 voudig molair overschot ten opzichte van BCL-xL), die aan BCL-xL binden, waardoor BAX en BID kunnen synergiseren en de LUVs kunnen permeabiliseren (Figuur 3B). In Figuur 3B tonen we het effect van full-length recombinant humaan PUMAβ; het PUMA BH3-domeinpeptide is functioneel vergelijkbaar (gegevens niet getoond)8. Dit experiment wordt gewoonlijk aangeduid als een 'de-repressie-assay', aangezien het PUMA-eiwit het remmende effect van BCL-xL op BAX en BID opheft. Idealiter moet de toevoeging van het de-represserende BH3-only-eiwit/peptide een minimaal effect hebben op de BAX-activatie14.
<img alt="Diagram van het proces van lipidsynthese en -zuivering; chromatografie- en fractieanalyse-stappen gedetailleerd." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. (A) In chloroform opgeloste lipiden worden samengevoegd, gedroogd om een lipidfilm te vormen en afgesloten. (B) ANTS- en DPX-oplossingen worden bereid, samengevoegd en gesoneerd om volledige solubilisatie en homogenisatie te waarborgen. De oplossing wordt toegevoegd aan de lipidfilm, het vial wordt afgesloten met parafilm en 5 min gesoneerd in een waterbad. De oplossing zal nu melkachtig verschijnen. (C) De gesoneerde lipidoplossing wordt in de mini-extruder geladen, 31 keer verwerkt en toegevoegd aan een geprepareerde Sepharose S-500 kolom voor daaropvolgende zuivering. (D) Fracties verkregen na grootte-uitsluitingschromatografie worden geanalyseerd door de relatieve fluorescentie-eenheden (RFUs) in LUV-buffer en LUV-buffer + 0,5% CHAPS te vergelijken. De "LUV-buffer" meting geeft de achtergrondfluorescentie aan met intacte LUVs; de conditie "LUV-buffer + 0,5% CHAPS" zal een door lysis geïnduceerde toename van fluorescentie vertonen, wat indicatief is voor LUVs. Fracties 3 en 4 bevatten gewoonlijk de LUVs en worden na analyse samengevoegd. Fracties 5 en 6 bevatten niet-ingebouwd ANTS (d.w.z. niet in de LUVs na extrusie), die een hoge fluorescentie vertonen onafhankelijk van CHAPS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4291/4291fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om de grotere figuur te bekijken</a>.
<img alt="Staafdiagrammen van LUV-permeabilisatie die de effecten van BAX- en BID-titraties tonen; grafiek van fluorescentie-intensiteit over de tijd." fo:content-width="5.45in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Controle-experimenten van de BCL-2-familie en BAX/BID-titraties met gebruik van LUVs. (A) Controle-experimenten. LUVs werden behandeld met enkel LUV-buffer, 0,025% octylglucoside "OG", 50 nM BAX, of 50 nM OG-BAX. LUVs werden 60 min geïncubeerd bij 37 °C. Het percentage (%) permeabilisatie wordt bepaald door de fluorescentie in de bufferbehandeling van alle monsters af te trekken; 100% permeabilisatie wordt bepaald door een monster gesolubiliseerd met 0,5% CHAPS; deel de experimentele waarden door de CHAPS-waarde om de % LUV-permeabilisatie te verkrijgen. OG-BAX is detergent-geactiveerd BAX, wat een betrouwbare positieve controle is voor LUV-permeabilisatie. (B) Bepaling van de optimale BAX-concentratie. LUVs werden behandeld met toenemende concentraties BAX (50 - 200 nM) in de aanwezigheid van 10 nM C8-BID "BID", of enkel buffer. (C) Bepaling van de optimale BID-concentratie. LUVs werden behandeld met toenemende concentraties BID (0 - 10 nM) in de aanwezigheid van 100 nM BAX. (D) Een voorbeeld van een kinetische dataset van LUV-permeabilisatie. LUVs werden behandeld met BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Metingen werden elke twee min uitgevoerd gedurende 30 min, waarbij voorafgaand aan elke meting twee seconden mild werd geschud. De eerste drie metingen (0, 2 &amp; 4 min) zijn niet opgenomen in de grafiek. De minimale en maximale relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) werden bepaald zoals beschreven in sectie 4.3. De foutenbalken in Figuren 2A-C vertegenwoordigen de standaarddeviatie van triplicaat data. De data in 2D vertegenwoordigen een duplicaat assay.
<img alt="Staafdiagrammen van LUV-permeabilisatie; invloed van BID/BAX/BCL-xL en PUMA; experimentele analyse." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. Voorbeelden van veel voorkomende BCL-2-familie-interacties onderzocht met behulp van LUVs. (A) BAX- en BID-gemedieerde LUV-permeabilisatie wordt geremd door BCL-xL. LUVs werden geïncubeerd met 100 nM BAX, 10 nM BID en toenemende concentraties BCL-xL (0 - 500 nM). LUVs werden 60 min geïncubeerd bij 37 °C. (B) PUMA heft de repressie van BCL-xL op om de functie van BAX en BID te bevorderen. LUVs werden 60 min bij 37 °C geïncubeerd met combinaties van 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL en (0 - 2,5 μM) PUMA. PUMA werd in een concentratie van 2,5 μM gebruikt met enkel BAX. De foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van gegevens uit triplicaten.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Volgorde van toevoeging:</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONDITIES</td>
			<td>LUV 
			Buffer</td>
			<td>OG 
			(0.7%)</td>
			<td>BAX 
			(2.3 μM)</td>
			<td>OG-BAX 
			(2.3 μM)</td>
			<td>CHAPS 
			(10%)</td>
			<td>LUV's 
			(2 mM)</td>
			<td>TOTAAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>95 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG (0,015%)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAX (50 nM)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td>-</td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG-BAX (50 nM)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS (0,5%)</td>
			<td>90 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1. Een voorbeeld van een controle-assay om het effect van OG-BAX op LUV-permeabilisatie te bepalen.

<ol><li>Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCL-2+family+reunion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The BCL-2 family reunion.</a> Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+ten+minutes+to+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: ten minutes to dead.</a> Cell. 121, 671-674 (2005).</li>
<li>Gavathiotis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAX+activation+is+initiated+at+a+novel+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAX activation is initiated at a novel interaction site.</a> Nature. 455, 1076-1081 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+trigger+apoptosis%2C+Bak+exposes+its+BH3+domain+and+homodimerizes+via+BH3%3Agroove+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions.</a> Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bak+activation+for+apoptosis+involves+oligomerization+of+dimers+via+their+alpha6+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices.</a> Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).</li>
<li>Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-triggered+structural+reorganization+drives+the+activation+of+proapoptotic+BAX%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX.</a> Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+apoptosis+induction+by+inhibition+of+the+anti-apoptotic+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).</li>
<li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+BH3+domains+either+sensitize+or+activate+mitochondrial+apoptosis%2C+serving+as+prototype+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipids+cooperate+to+form+supramolecular+openings+in+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane.</a> Cell. 111, 331-342 (2002).</li>
<li>Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+by+tBid+initiates+an+ordered+series+of+events+culminating+in+membrane+permeabilization+by+Bax%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax.</a> Cell. 135, 1074-1084 (2008).</li>
<li>Hsu, Y. T., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonionic+detergents+induce+dimerization+among+members+of+the+Bcl-2+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family.</a> J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bax%3A+coregulation+of+dimer+formation+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization.</a> Cell. 103, 645-654 (2000).</li>
<li>Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+other+than+Bim+and+Bid+can+directly+activate+Bax%2FBak%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak.</a> J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengeling gemeld.

De beschreven methode voor het genereren van LUV's biedt een snelle en efficiënte manier om de functie van diverse BCL-2-familie-eiwitten, peptiden en gerelateerde reagentia te testen in een biochemisch gedefinieerde membraanomgeving die vergelijkbaar is met de OMM. Bij het gebruik van eindpuntwaarden om LUV-permeabilisatie te bepalen, kunnen meerdere platen worden opgezet om honderden condities binnen één dag te analyseren. We stellen vast dat de beperkende reagentia in deze assays doorgaans de kwaliteit en kwantiteit v...

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph&amp;#8211;thanolamine &quot;PE&quot;</td><td>Avanti</td><td>850725C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidylcholine (ei, kip) &quot;PC&quot;</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidylinositol (lever, rund) &quot;PI&quot;</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidylserine (hersenen, varken) &quot;PS&quot;</td><td>Avanti</td><td>8400320</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipine (hart, rund - natriumzout) &quot;CL&quot;</td><td>Avanti</td><td>840012C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extruder set</td><td>Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>PC-membraan 0,2 mM</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Costar zwarte 96-wells plaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-8 gesplitst humaan BID</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>882-B8-050</td><td></td></tr><tr><td>Humaan BCL-xL (zonder C-terminus)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>894-BX-050</td><td></td></tr><tr><td>BID/PUMA BH3-domeinpeptiden</td><td>Anaspec</td><td>61711/62404</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 hybride multi-mode microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Geen</td><td></td></tr></tbody></table>

het onderzoeken van bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

De BCL-2 (B-cel CLL/lymfoom) familie bestaat uit ongeveer twintig eiwitten die samenwerken om ofwel de celoverleving te handhaven of apoptose te initiëren1. Na cellulaire stress (bijv. DNA-schade) worden de pro-apoptotische effectoren van de BCL-2 familie, BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) en/of BAX (BCL-2 associated X protein), geactiveerd en tasten zij de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan (OMM) aan, via het proces dat bekendstaat als mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. Nadat MOMP heeft plaatsgevonden, krijgen pro-apoptotische eiwitten (bijv. cytochroom c) toegang tot het cytoplasma, stimuleren zij de caspase-activatie en volgt er snel apoptose2.
Om MOMP te kunnen induceren, hebben BAK/BAX kortstondige interacties nodig met leden van een andere pro-apoptotische subset van de BCL-2-familie, de BCL-2-homologiedomein 3 (BH3)-only-eiwitten, zoals BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotische BCL-2-familie-eiwitten (bijv. BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) reguleren het cellulaire overleven door de interacties tussen BAK/BAX en de BH3-only-eiwitten die in staat zijn BAK/BAX-activatie direct te induceren, nauwkeurig te controleren7,8. Daarnaast wordt de beschikbaarheid van anti-apoptotische BCL-2-eiwitten ook bepaald door sensitizer/de-repressor BH3-only-eiwitten, zoals BAD (BCL-2 antagonist of cell death) of PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), die anti-apoptotische leden binden en remmen7,9. Aangezien het grootste deel van het anti-apoptotische BCL-2-repertoire gelokaliseerd is in het OMM, wordt de cellulaire beslissing om overleving te handhaven of MOMP te induceren bepaald door meerdere BCL-2-familie-interacties aan dit membraan.
Grote unilamellaire vesicles (LUV's) vormen een biochemisch model om de relaties tussen interacties van de BCL-2-familie en membraanpermeabilisering te onderzoeken10. LUV's bestaan uit gedefinieerde lipiden die zijn samengesteld in verhoudingen die zijn vastgesteld in studies naar de lipidencompositie van met oplosmiddel geëxtraheerde mitochondria van Xenopus (46,5% fosfatidylcholine, 28,5% fosfatidylethanolamine, 9% fosfatidylinositol, 9% fosfatidylserine en 7% cardiolipine)10. Dit is een handig modelsysteem om de functie van de BCL-2-familie direct te onderzoeken, omdat de eiwit- en lipidencomponenten volledig gedefinieerd en beheersbaar zijn, wat bij primaire mitochondria niet altijd het geval is. Hoewel cardiolipine in het OMM gewoonlijk niet in zulke hoge concentraties voorkomt, bootst dit model het OMM getrouw na om de functie van de BCL-2-familie te bevorderen. Bovendien maakt een recentere aanpassing van het bovenstaande protocol kinetische analyses van eiwitinteracties en real-time metingen van membraanpermeabilisering mogelijk, gebaseerd op LUV's die een polyanionische kleurstof (ANTS: 8-aminonaftaleen-1,3,6-trisulfonzuur) en een kationische quencher (DPX: p-xyleen-bis-pyridiniumbromide) bevatten11. Naarmate de LUV's permeabiliseren, diffunderen ANTS en DPX van elkaar weg, waardoor een toename in fluorescentie wordt gedetecteerd. Hier worden veelgebruikte combinaties van recombinante BCL-2-familie-eiwitten en controles beschreven met gebruik van LUV's die ANTS/DPX bevatten.

Biochemisch gedefinieerde grote unilamellaire vesicles (LUV's) zijn een handig modelsysteem om interacties van de BCL-2-familie te analyseren, met directe implicaties voor een beter begrip van de mitochondriale route van apoptose. Er wordt een methode gepresenteerd voor het produceren van LUV's, samen met standaard combinaties van eiwitten uit de BCL-2-familie en controles om de permeabilisatie van LUV's te onderzoeken.

Het onderzoeken van Bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes

De BCL-2 (B-cel CLL/lymfoom)-familie bestaat uit ongeveer twintig eiwitten die samenwerken om ofwel het celoverleven te handhaven of om ... te initiëren.

Dit biochemisch gedefinieerde modelsysteem van grote unilamellaire vesicles imiteert het buitenste mitochondriale membraan om de functie van BCL2-eiwitten in vitro te observeren. Combineer eerst de lipiden en vorm een lipidenfilm in een afgesloten vial. Bereid vervolgens een verse LUV-oplossing en solubiliseer de lipidenfilm.Extrude vervolgens de lipide-oplossing en zuiver de grote LUV's via gelfiltratie. De laatste stap is het analyseren van de LUV's op een door detergent geïnduceerde toename van de fluorescentie. Uiteindelijk wordt het LUV-modelsysteem gebruikt om de functie en regulatie van membraanpermeabele eiwitten, zoals recombinante BCL2-eiwitten, te evalueren.Deze benadering met gebruik van grote unilamellaire blaasjes biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande systemen zoals mitochondriën. Omdat ze worden gegenereerd met gezuiverde lipiden in afwezigheid van eiwitten, zijn ze biochemisch gedefinieerd wat betreft zowel compositie als grootte.Dit maakt een duidelijke interpretatie van de resultaten mogelijk, aangezien de enige eiwitten in uw onderzoek de eiwitten zijn die u zelf toevoegt. Deze methode kan mechanistische inzichten verschaffen in het vermogen van de BCL2-familie om de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan te reguleren. Het kan ook worden toegepast op andere systemen die membraanremodellering en permeabiliteitsactiviteit onderzoeken.Dit zou mitochondriale dynamische machinery of bacterieel gevormde toxines omvatten. Werk in een zuurkast met minimale verlichting. Spoel een glazen spuit van het type Hamilton Gast met chloroform.Combine vervolgens de 4 mg chloroform-gesolubiliseerde lipiden in een glazen vial van 1,5 ml. Om het chloroform te verwijderen, wordt een zachte stroom van een inert gas zoals stikstof of argon toegepast. Verifieer na twee tot drie uur de aanwezigheid van een droge lipidelaag op de bodem en wanden van de vial in LUV-buffer.Bereid oplossingen van 500 µL van de polyanion-kleurstof en de CAS-ionische quencher voor en meng deze door middel van vortexen. Combineer vervolgens de NTS- en DPX-oplossingen, vortex deze gedurende één minuut en sonicat ze in een ultrasoon waterbad om te waarborgen dat de oplossingen volledig zijn opgelost en homogeen zijn.Voeg nu de A-N-T-S-D-P-X-oplossing toe aan de lipidefilm en sluit het flacon af met parafilm. Sonicate de lipidefilm gedurende vijf minuten; de oplossing zal na sonicatie melkachtig worden. Zorg ervoor dat de oplossing volledig is gesolubiliseerd, aangezien kleine lipideaggregaten de volgende stappen negatief zullen beïnvloeden. Controleer daarnaast de bodem en de zijkanten van het flacon om er zeker van te zijn dat er geen lipidefilm is achtergebleven.Stel de extruder samen volgens de richtlijnen van de fabrikant, waarbij LUV-buffer wordt gebruikt om de filtersteunen en het polycarbonaatmembraan te bevochtigen. Draai de behuizing van de unit vast zodat er geen volumeverlies optreedt tijdens de extrusie, maar niet té strak om het membraan niet te beschadigen. Test de extruder met LUV-buffer om er zeker van te zijn dat er geen lekken of problemen zijn. Vul nu de rechterspuit met de lipide-oplossing en extrudeer 31 keer, zodat de grote ELLA-vesikels minstens één keer door het membraan passeren en worden opgevangen in de linkerspuit. De eerste paar extrusies kunnen iets meer druk vereisen als de oplossing plotseling snel door het membraan stroomt.Controleer het membraan op scheuren en vervang dit indien nodig. Voeg in één stap toe aan de kolom. Vermijd verstoring van de grensvlak van de kralen.Laat de buffer uit de kolom lopen. Wanneer de stroom stopt, sluit u de kolom af en vult u deze voorzichtig met LUV-buffer, waarbij u erop let dat de beads niet worden verstoord. Verwijder vervolgens de stop en verzamel zes fracties van één milliliter.De AUV's elueren normaal gesproken in fractie drie en vier en kunnen worden geïdentificeerd aan hun troebele uiterlijk; recycle de kolomspoeling en bewaar deze bij vier graden Celsius. De UUV's in de kolomfractie worden gedetecteerd door een toename in fluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van chaps. Vergeet niet om voor alle LUV-studies zwarte, ondoorzichtige 96-wells platen te gebruiken.Pipetteer 100 µL LUV-buffer of LUV plus 0,5% chaps in zes wells. Voeg aan elke well vijf µL van de betreffende fractie toe en meng voor de biotech H one synergie. Open de gen five 2.0-software en stel een excitatiegolflengte van 355 nm en een emissiegolflengte van 520 nm in.Stel de gain-spanning in op 125 optiekpositie bovenaan en verhoog de leeshoogte met 5,5 millimeters. Lees nu de plaat uit bij 37 graden Celsius en identificeer de fracties die LUV bevatten. Neem de fracties van gezuiverde LUV af.Deze assays zijn ontworpen om het vermogen van BCL2-proteïnen om direct LUV-permeatie te induceren te meten, evenals voor de regulatie van de permeatieactiviteit. Combineer de assaycomponenten in de volgorde van toevoeging. Gedetailleerde informatie over de titraties van BS- en bid-proteïnen is beschikbaar in het bijbehorende manuscript.Incubeer de reacties bij 37 °C voor de tijdspunten van de assay. Plaats de plaat in de microplate reader, die de plaat zal schudden en de fluorescentie zal meten zoals eerder getoond. In dit experiment worden met OG-detergens geactiveerde backs gebruikt om een positieve controle voor LUV-permeatie te genereren.Het is opmerkelijk dat OG-concentraties onder 0,025% hier geen directe invloed hebben op de permeatie van LUV. Een behandeling met 0,5% chaps wordt ook gebruikt om de maximale hoeveelheid LUV-fluorescentie per assay te bepalen. Een noodzakelijk startpunt voor het bestuderen van LUV-permeatie met BCL-2-familie-eiwitten is het vaststellen van de concentraties Bax en Bid om een optimale release te bevorderen.Deze titratiecurves van backs en bid tonen de minimale achtergrondvrijgave en optimale synergie. Alternatief kan de LUV-permeatie kinetisch worden gemeten. Deze metingen werden elke twee minuten gedurende 30 minuten uitgevoerd, met voorafgaand aan elke meting twee seconden licht schudden van de plaat.Dit experiment bepaalt de invloed van een anti-apoptose-eiwit op BAX- en BID-afhankelijke LUV-permeatie. BCL-XL remt de activiteit van BAX en BID op een dosisafhankelijke manier. In een D-repressie-assay kan het remmende effect worden omgekeerd door de toevoeging van daaropvolgende BH3-only-eiwitten.Bijvoorbeeld, puma beta bindt aan BCL xl, waardoor backs en bid kunnen synergeren en permeabiliseren. De grote ELLA-vesikels. Zodra deze techniek voor het genereren van groteculaire vesikels onder de knie is, maakt dit een efficiënte en snelle analyse van BCL-2-familie-eiwitten, peptiden en kleine moleculen mogelijk in een biochemisch gedefinieerde omgeving die vergelijkbaar is met het buitenste mitochondriale membraan. Belangrijk is dat deze assay de snelle analyse van honderden condities mogelijk maakt met behulp van zowel eindpunt- als kinetische parameters.Vergeet niet dat zowel UUVs als BCL two-eiwitten zeer gevoelig zijn voor artefacten geïnduceerd door detergentia. Gebruik schone, detergentvrije apparatuur om reproduceerbare resultaten te garanderen.

examining-bcl-2-family-function-with-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Het huidige protocol beschrijft een methode om extracellulaire blaasjes uit het perifere bloed en vaste weefsels te extraheren met daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen.

Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes

Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van samengestelde Giant Unilamellaire blaasjes (cGUV's) met een blaasje-in-blaasjesstructuur, met aangepaste elektrische geleidbaarheid in binnenste, ringvormige en buitenste gebieden. Elektroformatie synthetiseert eenvoudige GUV's, die via osmotische shock worden omgezet in stomatocyten en cGUV's, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van de biofysica van cellen met kern.

Synthese van samengestelde reusachtige unilamellaire blaasjes: een biomimetisch model van nucleaatcellen

De komst van MEG systemen maat voor jonge kinderen biedt belangrijke nieuwe mogelijkheden om ontwikkeling van de hersenen te bestuderen. Het nieuwe systeem, in combinatie met een protocol dat experimentele eisen uitgelijnd met de capaciteiten van kinderen, kan gebruikt worden om cognitieve en taal processen in gezonde, wakkere kinderen van drie tot zes onderzoekslocaties.

Meting van Neuromagnetic hersenfuncties bij Pre-school voor kinderen met op maat gemaakte MEG

Leer hoe je grote unilamellaire blaasjes (LUVs) produceert om Bcl-2 familie-eiwitinteracties te bestuderen. Deze methode bootst de buitenste mitochondriale membraan na en biedt inzicht in apoptoseregulatie.

Het onderzoeken van Bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes

Meer video's verkennen