Het visualiseren van Bacteriën in Nematoden met behulp van fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om fluorescent gelabelde bacteriële symbianten waar te nemen binnen hun nematode-gastheer. Dit wordt bereikt door de bacteriën eerst te labelen met een fluorescent eiwit door middel van conjugatie. De tweede stap is het isoleren van AIC-nematoden door eieren te oogsten.

Vervolgens worden de AIC-nematoden gekweekt in combinatie met hun fluorescent gelabelde bacteriële symbiant om natuurlijke associatie mogelijk te maken, wat uiteindelijk leidt tot de lokalisatie van de bacteriële symbiant binnen de nematode-gastheer. En de frequentie van deze associatie binnen de nematodepopulatie kan worden bepaald door middel van fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van symbiose te beantwoorden, zoals waar lokaliseren bacteriën zich binnen hun gastheer en wat is de verdeling van bacteriële dragers over een gastheerpopulatie?

Na overnachtelijke groei van de bacteriestammen, subcultuur, de donorontvanger en helperstammen in voedingsrijk groeimedium zonder antibiotica in een verhouding van één tot 100 cultuur tot medium, en vervolgens de culturen groeien bij de temperatuur die geschikt is voor elke stam tot ze de middenlogarische groeifase bereiken. Combineer vervolgens de stammen in een enkele microcentrifugebuis en centrifugeer de gemengde culturen gedurende twee minuten bij 17.900 Gs, decant de supernatant en spen het pellet in 30 microliter vers medium. Spuit vervolgens de suspensie op een voedingsrijk mediaplaat zonder antibiotica en laat de vlek drogen wanneer de suspensie is opgedroogd.

Incubeer de plaat omgekeerd overnacht bij een temperatuur die optimaal is voor de ontvangersbacterie en toegestaan is voor de donor en helper, indien van toepassing. Schrappen nu de vlek en strijk voor enkele kolonies op een selectieve antibioticumplaat om een zuivere bacteriecultuur te verkrijgen, een enkele kolonie voor isolatie. Zorg er ten slotte voor dat de resulterende kolonies de ontvangersymbiant zijn en niet de donor stam.

Door te screenen op de aanwezigheid van ontvangerspecifieke fenotypes. Bijvoorbeeld, cino abdi-bacteriën kunnen worden onderscheiden van e coli door een katalysatortest uit te voeren en te screenen op de aanwezigheid van het plasmide door fluorescentie te bevestigen onder de golflengte die overeenkomt met het fluorescente plasmide-eiwit. Na overnachtelijke groei van de natuurlijke bacteriële symbiant, verspreid 600 microliter van de bacteriecultuur over acht tot tien, 10 millimeter lipide aerates, en incubeer vervolgens de platen in het donker zonder vocht bij 25 graden Celsius.

Na twee dagen, voeg 5.000 infectieuze juveniele nematoden toe in 500 microliter medium op de bacterie-lawns. Na incubatie van de platen bij 25 graden Celsius gedurende drie dagen, plaats 20 microliter water op een microscoopglaasje. Gebruik vervolgens een steriele stick om een kleine hoeveelheid nematoden van de bacterie-lawn te schrabben.

Plaats de stick in het water om de nematoden te laten zwemmen. Bekijk dit glaasje onder lage vergroting. Als eieren en vrouwtjes zichtbaar zijn, ga door wanneer de vrouwtjes eieren bevatten, plaats een paar milliliter water op het oppervlak van de platen, draai voorzichtig de platen rond en giet vervolgens het water in een 50 milliliter conische buis.

De nematoden zouden van de platen moeten komen en niet langer zichtbaar zijn op het plaatoppervlak. Laat de nematoden naar de bodem van de buis zinken, pipet het overtollige water van de bovenkant van de buis en vul de buis opnieuw met schoon water. Na het laten zinken van de volwassen nematoden en het nogmaals pipetten van het overtollige water, vul de conische buizen met eieroplossing.

Meng vervolgens de buizen door zachtjes om te keren gedurende exact 10 minuten bij kamertemperatuur. Na het schudden, centrifugeer de conische buizen onmiddellijk gedurende exact 10 minuten bij 1.250 Gs en kamertemperatuur met de rem uit. Decanteer vervolgens snel het supernatant, suspendeer het pellet opnieuw met eieroplossing door te pipetten en vul de conische buis opnieuw met verse eieroplossing.

Meng de eiersuspensie goed door de buis drie tot vijf keer om te keren en suspendeer vervolgens de pellet in misogynie, bouillon of LB door te pipetten, en breng vervolgens de eiersuspensie over in een 15 milliliter conische buis. Vul nu de 15 milliliter buis met lb, was de eieren drie keer in de bouillon met behulp van dezelfde snelle staptechniek zoals zojuist gedemonstreerd, en verdun vervolgens de gesuspendeerde P-nematode eieren tot minimaal 10 eieren per microliter.

Breng de eieren over in een zes centimeter petrischaal met vijf milliliter LB en antibiotica tegen koloniserende bacteriën. De plaat kan worden bewaard, verpakt in perfil, gedurende maximaal vier dagen na overnachtelijke groei en selectie van de fluorescente bacteriën. Gebruik een steriele stick om 600 microliter van de bacteriecultuur te verspreiden op 10 millimeter lipide aerates, en om de cultuur te incuberen bij 25 graden Celsius.

Na twee dagen, verdeel 500 tot 5.000 nematodeneieren op elke lipideplaat. Als de plaat is opgeslagen, was de eieren in 15 milliliter LB zoals zojuist gedemonstreerd, minimaal één keer voordat de eieren worden geïnoculeerd op de eerder bereide bacterie-lawns. Incubeer vervolgens de nematodebacterie co-culturen in het donker zonder vocht bij 25 graden Celsius tot infectieve juvenielen verschijnen als een wazige witte ring aan de rand van de plaat.

Wanneer de infectieve juvenielen zijn waargenomen. Verwijder het deksel van de lipide-agarplaat en plaats de bodem van de plaat in de bodem van een lege 100 millimeter bij 20 millimeter petrischaal. Vul vervolgens de petrischaal met voldoende water tot ongeveer de helft van de hoogte van de kleinere plaat en incubeer de waterval totdat de nakomelingen infectieve juvenielen in het water zijn gekomen.

Na het verzamelen van de nematoden uit het water of op het gewenste levensstadium van de geschikte bacterie-lawn, los een paar korrels ole op in 30 microliter water, en gebruik één tot twee microliter van dit verlammende middel voor elke 50 microliter nematodenmonster. Breng vervolgens ongeveer 20 tot 30 microliter van het verlamde nematoden