Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

In dit experiment wordt selectieve modulatie van de proteïnekinase C-isovormen gebruikt om hun mitochondriale en cellulaire functies in renale proximale tubuluscellen te bepalen onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Isoleer eerst de primaire renale proximale tubuluscellen uit de renale cortex, of RPC's die een oxidatief metabolisme hebben dat overeenkomt met dat van de renale proximale tubuli.

Infecteer de RPC's in vivo met adenovirale vectoren die actieve en inactieve vormen van proteïnekinase C epsilon tot expressie brengen. Analyseer vervolgens de verschillende mitochondriale functies en de celviabiliteit om het effect van het isozym op het vermogen van mitochondriën om ATP te synthetiseren en celdood te voorkomen te bepalen. Voer daarnaast een immunoblot-analyse uit van gefosforyleerd en totaal proteïnekinase C epsilon in cellulaire lysaten die gezamenlijk zijn verzameld.

De resultaten tonen aan dat de activering van proteïnekinase epsilon de mitochondriale capaciteit om ATP te genereren negatief reguleert, wat leidt tot een afname van de cellulaire ATP-niveaus en de levensvatbaarheid van renale proximale tubuluscellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande technieken, zoals cellijnen, is dat primaire culturen van renale proximale tubuluscellen de gedifferentieerde functies en het oxidatieve metabolisme van de renale proximale tubulus behouden. Aangezien proteïnekinasen kunnen worden gebruikt als doelwitten en potentiële therapeutische middelen, strekken de implicaties van deze techniek zich uit tot therapie ter preventie van nierschade of het versnellen van het herstel van de nieren na beschadiging.

Deze methode kan inzicht bieden in het mechanisme van letsel en herstel. Het kan ook worden toegepast op vers geïsoleerde konijnennieren, die opeenvolgend worden gespoeld met 50 milliliters steriel D-M-E-M-F 12 medium, steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4 en een PBS-ijzeroxide-oplossing om de cortex van elke nier te oogsten.

Homogeniseer eerst het weefsel met een 15 milliliter down homogenisator. Giet het homogenisaat vervolgens door twee steriele gaaszeven in een steriel bekerglas van één liter. Spoel de cellen die op de zeven achterblijven met buffer die deferoxamine bevat.

Overbreng al het weefsel dat op de bodem van de zeef van 85 micron is achtergebleven naar 40 milliliters deferoxamine-bevattende buffer in een conische centrifugebuis. Meng de celsuspensie voorzichtig met de sterke magneet.

Vang de ijzerhoudende glomeruli op en aspireer het ijzer dat aan de magneet is gehecht. Pas het volume van de celsuspensie aan naar 40 milliliters en voeg één milliliter digestiemedium met collagenase toe. Incubeer gedurende 17 minuten bij kamertemperatuur.

Meng de suspensie voorzichtig. Oogst de cellen na meerdere wasbeurten door centrifugatie bij 50 ×g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de celpellet in 46 milliliters medium zonder glucose.

Kweek de primaire RT PC's bij een dichtheid van één milligram eiwit per schaalcultuur in twee milliliters glucosevrij D-M-E-M-F 12 medium op een orbitale schudder bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Na het verversen van het medium worden de confluente RPT-cellen geïnfecteerd met een adenovirus dat CD NA draagt voor respectievelijk constitutief actief proteïnekinase C epsilon of dominant negatief proteïnekinase C epsilon; incubeer gedurende 24 uur, ververs het medium en kweek de getransfecteerde primaire RPC's nog eens 24 uur. Om de mitochondriale morfologie van de primaire cellaag te visualiseren, wordt het medium ververst, MIT tracker red 580 toegevoegd en worden de schalen gedurende 30 minuten teruggeplaatst in de incubator.

Onderzoek vervolgens de levende monolagen onder een fluorescentiemicroscoop met behulp van een waterimmersie-objectief. Doel twee. Om de mitochondriële functie te beoordelen, evalueert u de state 3-respiratie van de RPTC-suspensie in een zuurstofconsumptiekamer die is uitgerust met een Clark-type elektrode.

Meet eerst de staat 2 respiratie in afwezigheid van een DP. Voeg vervolgens een DP toe tot een eindconcentratie van 0,4 millimolair. Om staat 3 respiratie te initiëren voor staat 4 respiratie, voegt u oligomycine toe tot een eindconcentratie van 0,5 microgram per milliliter.

Voeg ook een meting voor ontkoppelde respiratie toe door 0,5 µM FCCP toe te voegen aan cellen die in toestand drie respireren. Voeg langzaam 20 µL van een 0,5 mM JC-1-oplossing toe aan elke RPTC-kweekschaal en draai deze rond om de kleurstof grondig te mengen. Plaats de schalen gedurende 30 minuten terug in de incubator.

Plaats vervolgens de culturen op ijs en voer twee wasbeurten uit met ijskoud PBS. Oogst daarna de cellen. Draag de RPT-cellen over naar een eppendorfbuisje en breek de monolagen op tot een suspensie van enkelvoudige cellen door middel van pipetteren.

Analyseer de fluorescentie via flowcytometrie met excitatie door een argon-ionlaser van 488 nanometer. Bereken vervolgens het mitochondriale membraanpotentiaal van de geïsoleerde mitochondriën. Dit faciliteert de beoordeling van de integriteit van de ademhalingsketen.

Na twee keer wassen van de RPTC-monolagen met ijskoud PBS-buffer, worden de cellen geoogst en gepellet door centrifugatie. Was het pellet één keer in één milliliter buffer A en homogeniseer vervolgens de cellen in een Down-homogenisator totdat de meeste cellen in het homogenaat zijn afgebroken bij inspectie onder een microscoop. Verwijder daarna het celdebris door middel van centrifugatie bij lage snelheid.

Centrifugeer de ruwe mitochondriën uit het supernatant bij 15, 000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en was de gepelletteerde mitochondriën drie keer met buffer c. Resuspendeer de mitochondriële pellet in 50 tot 100 µL van de assaybuffer en vries deze in vloeibare stikstof in om de NADH-ubichinon-oxido-reductase-activiteit te bepalen. Voeg 500 µL van de assaybuffer toe inclusief de additieven en mitochondriën; neem ook een blanco monster mee dat alle additieven bevat maar geen mitochondriën. Equilibreer de plaat vijf minuten bij 30 °C onder menging.

Plaats vervolgens de plaat in de spectrofotometer en voeg 10 µL 3,25 mM ubiquinon toe om de reactie in elke put te starten. Registreer de absorptie bij 340 nm gedurende drie minuten met intervallen van 22 seconden. Meet in een soortgelijke assay de activiteit van cytochroom C oxidase met gereduceerd cytochroom C als substraat voor de ATP-synthasereactie.

Bereid mengsels voor het bepalen van de totale APA-activiteit en de oligomycine-ongevoelige APA-activiteit van elke behandelingsgroep. Incubeer de monsters in het reactiemengsel bij 31 °C gedurende 10 minuten. Start de reactie door een TP-substraat toe te voegen en incubeer bij 31 °C gedurende vijf minuten.

Breng 200 µL van het incubatiemengsel over naar een buisje met 50 µL 3 M TCA en laat de eiwitten 10 minuten op ijs neerslaan. Pelleteer vervolgens door middel van centrifugatie. Vul daarna een 96-wellplaat met 50 µL van elke fosfaatstandaard en 50 µL van elk monster-supernatans in dubbelvoud.

Voeg vervolgens 250 µL Sumner-reagens toe aan elke put en incubeer 15 minuten bij 30 °C. Registreer daarna de absorptie bij 595 nm. Was de RPTC-monolagen twee keer met ijskoude PBS-buffer.

Oogst de cellen in één milliliter PBS en breng de cel-suspensie over naar een eppendorfbuisje. Pelleteer de RPTC-monsters door centrifugatie en bepaal het TP-gehalte met de luciferase-methode van een TP-bioluminescentie-assaykit. Gebruik voor de analyse van de cellevensvatbaarheid in schaaltjes van 35 millimeter vijf RPTC-monolagen voor drie controlegroepen van cellen positief voor necrose, cellen positief voor apoptose en een controle zonder kleuring voor twee schaaltjes.

Voeg twee µL 50 mM cisplatin toe aan de tweede set. Voeg twee µL 500 mM tert-butylhydroperoxide toe. Nadat de cellen zijn gekleurd met propidiumjodide zoals beschreven in de bijbehorende tekst, worden de monoculturen gewassen met de bindingsbuffer.

Kleur vervolgens de cellen met ANNEXIN vijf geconjugeerd met ZI, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Oogst daarna voorzichtig de cellen en suspendeer ze in 500 microliters bindingsbuffer met behulp van een rubberen policeman.

Gebruik een pipet om de cellen te verspreiden tot een enkelcellige suspensie en breng de celsuspensie over naar flowcytometrie-buisjes. Verspreid de cellen tot een enkelcellige suspensie. Ga onmiddellijk over tot het kwantificeren van de fluorescentie voor PI en FE via flowcytometrie; adenovirale aflevering van CD NA-coating van de CONSTITUENTLY actieve en de inactieve mutanten van proteïnekinase C epsilon resulteert in significant verhoogde proteïneniveaus van proteïnekinase C epsilon in RPTC en in mitochondriën.

Zoals verwacht wordt de constitutief actieve vorm van het enzym gefosforyleerd in RP tcs en het dominant negatieve enzym wordt niet gefosforyleerd. De aanwezigheid van actief proteïne kinase C epsilon vermindert de mitochondriale respiratie in RPTC, ongeacht het gebruikte substraat om de mitochondriën van energie te voorzien. Echter heeft het inactieve proteïne kinase C epsilon geen effect op de mitochondriale respiratie.

Interessant genoeg vermindert activering van proteïnekinase C epsilon in RP TCS de activiteit van complexen één en vier. Deze afname in RPTC-respiratie is geassocieerd met stijgingen in het mitochondriële membraanpotentieel. De dominant-negatieve mutant heeft geen dergelijk effect.

Deze veranderingen gaan gepaard met afnames in de activiteit van een TP-synthase in mitochondriën geïsoleerd uit RPTC die het actieve proteïnekinase C epsilon overexpresseren. Als gevolg hiervan is de ATP-inhoud van RPTC die het actieve proteïnekinase C epsilon overexpresseren verlaagd; aanhoudende activatie van proteïnekinase C epsilon heeft ingrijpende effecten op de mitochondriale morfologie, zoals blijkt uit mitochondriale fragmentatie.

Activatie, maar niet inhibitie, van proteïnekinase C. Dit resulteert ook in veranderingen in de morfologie van RPTC's, wat leidt tot celkrimp en elongatie van de overlevende cellen. Deze mitochondriale effecten van overexpressie van het actieve proteïnekinase C epsilon in RPC's correleerden ook met celdood door zowel oncosis als apoptose.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwitten kunt overexpresseren in primaire culturen met behulp van de adenovirale techniek en hoe u de mitochondriale capaciteit voor een TP-synthese kunt beoordelen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vier uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. En wees voorzichtig: vergeet niet dat het werken met adenovirussen risico's met zich meebrengt, dus neem passende voorzorgsmaatregelen.