Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

In dit experiment wordt selectieve modulatie van de proteïnekinase C-isoformen gebruikt om hun mitochondriale en cellulaire functies te bepalen in renale proximale tubuluscellen onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Isoleer eerst de primaire renale proximale tubuluscellen uit de renale cortex, of RPC's die een oxidatief metabolisme hebben dat overeenkomt met dat van renale proximale tubuli.

Infecteer de RPC's in vivo met adenovirale vectoren die actieve en inactieve vormen van het proteïnekinase C-isozym tot expressie brengen. Analyseer vervolgens de verschillende mitochondriale functies en de cellevensvatbaarheid om het effect van het isozym op het vermogen van de mitochondriën om ATP te synthetiseren en celdood te voorkomen te bepalen. Voer daarnaast een immunoblot-analyse uit van gefosforyleerd en proteïnekinase C epsilon in gezamenlijk genomen cellulaire lysaten.

Resultaten tonen aan dat de activatie van proteïnkinase epsilon de mitochondriale capaciteit om ATP te genereren negatief reguleert, de cellulaire ATP-niveaus verlaagt en de levensvatbaarheid van renale proximale tubuluscellen vermindert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande technieken, zoals cellijnen, is dat primaire culturen van renale proximale tubuluscellen de gedifferentieerde functies en het oxidatieve metabolisme van de renale proximale tubulus behouden. Aangezien proteïnkinasen kunnen worden gebruikt als doelwitten en potentiële therapeutische middelen, strekken de implicaties van deze techniek zich uit tot therapie, het voorkomen van nierschade of het versnellen van het herstel van de nieren na letsel.

Deze methode kan inzicht geven in het mechanisme van letsel en herstel. Het kan ook worden toegepast op, zoals de en Per vers geïsoleerde konijnennieren opeenvolgend met 50 milliliters. Elk van steriel D-M-E-M-F 12 medium steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7.4 en PBS ijzeroxide-oplossing om de cortex van elke nier te oogsten.

Homogeniseer eerst het weefsel met een 15 milliliter down homogenisator. Giet het homogenisaat vervolgens door twee steriele maaszeven in een steriele beker van één liter. Spoel de cellen die op de zeven achterblijven met buffer die deferoxamine bevat.

Breng al het weefsel dat op de bodem van de 85 micron zeef is achtergebleven over naar 40 milliliters deferoxamine-bevattende buffer in een conische centrifugebuis. Meng de celсусpensie voorzichtig met de sterke magneet.

Vang de met ijzer gevulde glomeruli op en aspireer het ijzer dat aan de magneet kleeft. Pas het volume van de cel-suspensie aan naar 40 milliliters en voeg één milliliter digestiemedium toe dat collagenase bevat. Incubeer gedurende 17 minuten bij kamertemperatuur.

Meng de suspensie voorzichtig. Oogst de cellen door centrifugatie bij 50 ×g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius na verschillende wasbeurten. Resuspendeer de celpellet in 46 ml medium zonder glucose.

De primaire RT PC's werden gekweekt bij een dichtheid van één milligram eiwit per kweekschaal in twee milliliters glucosevrij D-M-E-M-F 12 medium op een orbitale schudder bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Na het verversen van het medium werden confluente RPT-cellen geïnfecteerd met adenovirus dragend CD NA voor ofwel constitutief actieve proteïnekinase C epsilon, of dominant negatieve proteïnekinase C epsilon; incubeer gedurende 24 uur, ververs het medium en kweek de getransfecteerde primaire RPC's nogmaals 24 uur. Om de mitochondriële morfologie van de primaire cellaag te visualiseren, wordt het medium ververst, Mitotracker Red FM 80 toegevoegd en worden de schalen gedurende 30 minuten teruggeplaatst in de incubator.

Inspect vervolgens de levende monolagen onder een fluorescentiemicroscoop met behulp van een waterimmersie-objectief. Stap twee. Om de mitochondriële functie te beoordelen, evalueert u de respiratie in staat drie van de RPTC-suspensie in een zuurstofverbruikskamer uitgerust met een Clark-elektrode.

Meet eerst de respiratie van toestand twee in afwezigheid van een DP. Voeg vervolgens een DP toe tot een eindconcentratie van 0,4 millimolair. Om de respiratie van toestand drie te initiëren voor respiratie van toestand vier, voegt u oligomycine toe tot een eindconcentratie van 0,5 microgram per milliliter.

Voeg daarnaast een meting toe voor ontkoppelde respiratie door 0,5 µM FCCP toe te voegen aan cellen die zich in toestand drie bevinden. Voeg langzaam 20 µL van een 0,5 mM JC-1-oplossing toe aan elk RPTC-kweekschaaltje en draai deze rond om de kleurstof grondig te mengen. Plaats de schaaltjes gedurende 30 minuten terug in de incubator.

Plaats de culturen vervolgens op ijs en voer twee wasbeurten uit met ijskoud PBS. Oogst daarna de cellen. Breng de RPT-cellen over naar een eppendorfbuisje en breek de monoculturen op tot een enkelcellige suspensie door middel van pipetteren.

Analyseer de fluorescentie via flowcytometrie met excitatie door een argon-ionlaser van 488 nanometer. Bereken vervolgens het mitochondriale membraanpotentiaal van de geïsoleerde mitochondriën. Faciliteer hiermee de beoordeling van de integriteit van de ademhalingsketen.

Na twee wasbeurten van de RPTC-monolagen met ijskoud PBS-buffer, worden de cellen geoogst en gepellet door middel van centrifugatie. Was het pellet eenmaal in één milliliter buffer A en homogeniseer de cellen vervolgens in een Dounce-homogenisator totdat de meeste cellen in het homogenaat zijn afgebroken, zoals gecontroleerd onder een microscoop. Verwijder vervolgens het celdebris door middel van centrifugatie bij een lage snelheid.

Centrifuge het supernatant bij 15,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriën als pellet te verkrijgen en was de gepellette mitochondriën drie keer met buffer c. Resuspendeer de mitochondriële pellet in 50 tot 100 µL van de assaybuffer en vries deze in vloeibare stikstof in om de NADH-ubiquinon-oxidoreductase-activiteit te bepalen. Voeg 500 µL van de assaybuffer met additieven en mitochondriën toe; neem ook een blanco monster op dat alle additieven bevat maar geen mitochondriën. Equilibreer de plaat bij 30 °C gedurende vijf minuten onder menging.

Plaats vervolgens de plaat in de spectrometer en voeg 10 µL 3,25 mM ubiquinone toe om de reactie in elke well te starten. Registreer de absorbentie bij 340 nm gedurende drie minuten met intervallen van 22 seconden. Meet in een vergelijkbare assay de activiteit van cytochroom C oxidase met gereduceerd cytochroom C als substraat voor de ATP-synthase-reactie.

Bereid mengsels voor voor het bepalen van de totale APA-activiteit en de oligomycine-ongevoelige APA-activiteit van elke behandelingsgroep. Incubeer de monsters in het reactiemengsel bij 31 °C gedurende 10 minuten. Start de reactie door een TP-substraat toe te voegen en incubeer bij 31 °C gedurende vijf minuten.

Breng 200 µL van het incubatiemengsel over naar een buisje met 50 µL 3 M TCA en laat de eiwitten 10 minuten op ijs neerslaan. Pelletiseer deze vervolgens door middel van centrifugatie. Vul daarna een 96-well plaat met 50 µL van elke fosfaatstandaard en 50 µL van elk monster-supernatans in dubbelvoud.

Voeg vervolgens 250 µL Sumner-reagens toe aan elke well en incubeer 15 minuten bij 30 °C. Registreer daarna de absorbentie bij 595 nm. Was de RPTC-monolagen twee keer met ijskoude PBS-buffer.

Oogst de cellen in één milliliter PBS en breng de celsuspensie over naar een eppendorfbuisje. Pelleteer de RPTC-monsters door centrifugatie en bepaal het ATP-gehalte met de luciferase-methode van een ATP-bioluminescentie-assaykit. Voor de analyse van de celviabiliteit in schaaltjes van 35 millimeter worden vijf RPTC-monolagen gebruikt voor drie controlegroepen van cellen: cellen die positief zijn voor oncosen, cellen die positief zijn voor apoptose en een controle zonder kleuring voor twee schaaltjes.

Voeg twee microliters 50 millimolar cisplatin toe aan de tweede set. Voeg twee microliters 500 millimolar tert-butylhydroperoxide toe. Nadat de cellen zijn gekleurd met propidiumjodide zoals beschreven in de bijbehorende tekst, worden de monoculturen gewassen met de bindbuffer.

Kleur vervolgens de cellen met ANNEXIN five geconjugeerd met ZI, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Oogst daarna voorzichtig de cellen en suspendeer ze in 500 microliters bindingsbuffer met behulp van een rubberen policeman.

Gebruik een pipet om de cellen te verspreiden tot een enkelcel-suspensie en breng de celsuspensie over naar flowcytometrie-buisjes. Verspreid de cellen tot een enkelcel-suspensie. Ga onmiddellijk over tot het kwantificeren van de fluorescentie voor PI en FE via flowcytometrie; adenovirale aflevering van CD NA-coating van de constitutief actieve en de inactieve mutanten van proteïnekinase C epsilon resulteert in significant verhoogde proteïneniveaus van proteïnekinase C epsilon in RPTC en in mitochondriën.

Zoals verwacht is de constitutief actieve vorm van het enzym gefosforyleerd in RP tcs en is het dominant negatieve enzym niet gefosforyleerd. De aanwezigheid van actieve proteïnekinase C epsilon vermindert de mitochondriale respiratie in RPTC, ongeacht het substraat dat wordt gebruikt om de mitochondriën van energie te voorzien. De inactieve proteïnekinase C epsilon heeft echter geen effect op de mitochondriale respiratie.

Interessant genoeg vermindert activering van proteïnekinase C epsilon in RP TCS de activiteit van complex I en IV. Deze afname in RPTC-respiratie is geassocieerd met stijgingen in het mitochondriale membraanpotentiaal. De dominant-negatieve mutant heeft geen dergelijk effect.

Deze veranderingen gaan gepaard met afnames in de activiteit van een TP-synthase in mitochondriën geïsoleerd uit RPTC die het actieve proteïnekinase C epsilon overexpresseren. Als gevolg hiervan is de ATP-inhoud van RPTC die het actieve proteïnekinase C epsilon overexpresseren verlaagd; aanhoudende activatie van proteïnekinase C epsilon heeft ingrijpende effecten op de mitochondriale morfologie, zoals blijkt uit mitochondriale fragmentatie.

Activering van proteïnekinase C, maar geen inhibitie. Dit resulteert ook in veranderingen in de morfologie van RPTC's, wat leidt tot celkrimp en verlenging van overlevende cellen. Deze mitochondriale effecten van overexpressie van het actieve proteïnekinase C epsilon in RPC's correleerden ook met celdood door zowel oncosis als apoptose.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u eiwitten overexpressieert in primaire culturen met behulp van de adenovirale techniek en hoe u de mitochondriale capaciteit voor TP-synthese beoordeelt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Let er op dat werken met adenovirus risico's met zich meebrengt, dus neem passende voorzorgsmaatregelen.