Monitoring Plasmide Replicatie in Live zoogdiercellen over meerdere generaties door fluorescentie microscopie
13 december 2012
Werkwijze voor het observeren individuele DNA-moleculen in levende cellen beschreven. De techniek is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lac repressor eiwit bindingsplaatsen ontworpen in het DNA van belang. Deze methode kan worden aangepast aan vele recombinant DNA volgen in levende cellen in de tijd.
Het algemene doel van deze procedure is om de verdeling van virale genomen in zich delende cellen te observeren. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide te maken dat kan worden gevisualiseerd door middel van fluorescentiemicroscopie. Hier wordt een plasmide ontworpen om tandem-herhalingen van de lactose-operatorsequentie of LAC O te bevatten.De tweede stap is om het plasmide in zich delende cellen te introduceren, gevolgd door infectie van de cellen met een retrovirus dat het lactose-repressor of lac-oog gefusioneerd met een fluorescent eiwit codeert.
De lactose-repressorfusie-eiwitten zullen specifiek binden aan de lactose-operatorsequenties in de plasmide-sub. De cellen worden gemonitord door middel van fluorescentiemicroscopie om individuele plasmiden door meerdere celcycli heen te volgen. Uiteindelijk worden de verkregen beelden verwerkt om te bepalen hoe de virale genomen in zich delende cellen worden gehandhaafd.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals kwantitatieve PCR Southern blotting of fluorescentie in situ hybridisatie, is dat deze techniek toelaat dat individuele plasmiden op meerdere tijdstippen worden waargenomen. Om visualisatie van het plasmide door middel van fluorescentiemicroscopie mogelijk te maken, worden standaard moleculaire kloneringtechnieken gebruikt om een DNA-fragment in te voeren dat ongeveer 250 kopieën van de lactose-operatorsequentie of LAC O bevat in het plasmide. In dit voorbeeld is het plasmide een back mid van ongeveer 170 kilobaseparen dat het volledige genoom van het cap's sarcoma-geassocieerde herpesvirus of KSHV bevat en codeert voor resistentie tegen hygromycine.
Introduceer het LAC O bevattende plasmide DNA in hela en SLK zoogdiercellen door middel van transfectie. In schalen van 60 millimeter, incubeer cellen met 10 microgram gezuiverd plasmide, DNA 25 microliters, lipectomie, 2000 0,5 milliliter, Optum, en 3,5 milliliter DMEM gedurende vier uur. Ververs het medium naar DMEM met 10% foetaal bovien serum en laat de cellen 48 uur herstellen.
Plaat vervolgens de getransfecteerde cellen in lage dichtheid in grote schalen en kweek ze gedurende drie weken in DMEM met 10% foetaal bovien serum en 300 microgram per milliliter hygromycine om het geïntroduceerde plasmide te selecteren, gebruik stukken steriele trips en geweekt filterpapier om hygromycine-resistente kolonies over te brengen naar nieuwe kweekschalen. Plaats de schalen in de incubator na één tot twee weken wanneer getransfecteerde klonen zijn gegroeid om de schaal te vullen, isoleer DNA voor restrictiedigestie en southern blotting om ervoor te zorgen dat het polymeer van het LAC O-plasmide homogeen is en van de verwachte grootte. Dit voorbeeldbloot toont dat het LAC O-polymeer in kloon één homogeen is en identiek is aan die van de positieve controle.
In baan zeven, als het plasmide niet is ontworpen om een fusie van de lactose-repressor lac oog te expresseren, infecteer geschikte klonen met een retrovirus dat lac oog gefusioneerd met een rood fluorescent eiwit zoals lac oog, TD-tomaat, TD-tomaat in plaats van eiwitten die dichter bij groen fluoresceren, om fototoxiciteit die zou optreden door meerdere blootstellingen over lange tijd te minimaliseren. Zodra het LAC oog-fusie-eiwit is geïntroduceerd, kweek de cellen in aanwezigheid van 200 microgram per milliliter IPTG om de fusie-eiwitten te blokkeren van het binden van DNA. Een van de meest cruciale aspecten van deze procedure is het verkrijgen van klonen met de juiste fluorescentie-intensiteit.
Een groot aantal klonen moet worden gescreend om degenen met optimale fluorescentiecultuur te identificeren. Kweek de cellen gedurende ten minste drie dagen om expressie van het LAC oog TD-tomaat-eiwit mogelijk te maken. Screen klonen op degenen met optimale niveaus van lac oog, TD-tomaat die duidelijke signalen tonen met minimale achtergrondniveaus van ongebonden fusie-eiwit, 24 tot 48 uur voorafgaand aan beeldvorming. Plaats de LAC I TD-tomaat-expresserende cellen in een 35 millimeter glazen bodemschaal met een dichtheid van minder dan 10%confluence. Dit zal toelaten dat paar cellen zich delen in kolonies van acht tot 16 cellen zonder overlapping één tot drie uur voorafgaand aan het begin van beeldvorming.
Spoel de plaat drie keer af met kweekmedium dat zowel selectieve geneesmiddelen als IPTG mist. Dit spoelt niet-levensvatbare cellen weg en stelt lac oog-fusie-eiwitten in staat om LAC cytes in de plasmiden te binden. Vervang het kweekmedium door twee milliliter DMEM met 10% foetaal bovien serum en 25 millimolar Hippies. Incubeer gedurende één tot drie uur net voorafgaand aan beeldvorming en vervang de bovenkant van de kweekschaal met cultfolie die is uitgerekt in een montagering voor een 35 millimeter schaal.
Deze afdekking zal verdamping van het kweekmedium remmen, wat de zoutconcentratie in de loop van de tijd zou verhogen en de cellen zou doden. Het beeldvormingssysteem dat in dit experiment wordt gebruikt, bestaat uit een Zeiss Axio 200 M omgekeerde microscoop, uitgerust met een gemotoriseerde stage en een EM CCD-camera voor gevoelige detectie van signalen. Fluorescerende excitatielicht wordt geleverd door de neutrale witte LED van een Collibra-systeem.
Het beeldvormingssysteem wordt bestuurd door een software voor geautomatiseerde acquisities van beelden over lange tijdsintervallen met meerdere Z-stacks. Een stage top incubator wordt gebruikt om cellen op 37 graden Celsius, vijf tot 10% koolstofdioxide in een bevochtigde kamer te houden. Gebruik een verwarmde hals voor het olie-objectief om te voorkomen dat het objectief sijpelt.
Warmte van het monster zorgt ervoor dat het systeem voldoende tijd heeft om tot een stabiele temperatuur te komen. Om bewegingsartefacten tijdens het experiment te minimaliseren, moet het beeldvormingssysteem op een luchttafel staan om geïsoleerd te zijn van trillingen. Om de procedure voor het visualiseren van gelabeld DNA te beginnen, gebruik DIC-beeldvorming om de cellen te bekijken en bepaal het brandpuntsvlak van de boven- en onderkant van de cellen in meerdere kijkvelden. In elk veld, beweeg naar een brandpuntsvlak ongeveer een derde van de weg af vanaf de top van de cel,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het observeren van individuele DNA-moleculen in levende cellen met behulp van een fluorescent gelabeld lac-repressor-eiwit. De techniek maakt het mogelijk om recombinante DNA's in de loop van de tijd te volgen, waardoor inzichten worden verkregen in hun gedrag in delende cellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Genetica
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- De studie richt zich op de verdeling van virale genomen in delende cellen.
- Een plasmide is ontworpen om tandemherhalingen van de lactose-operatorsequentie te bevatten.
- De methode maakt gebruik van fluorescentiemicroscopie voor visualisatie.
- Infected met een retrovirus codeert voor de lactose-repressor gefuseerd met een fluorescent eiwit.
Doel van het onderzoek
- Om te observeren hoe virale genomen worden gehandhaafd tijdens celdeling.
- Om individuele plasmiden door meerdere celcycli heen te volgen.
- Om het begrip van DNA-gedrag in levende cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwerp van een plasmide met lactose-operatorsequenties.
- Introductie van het plasmide in delende cellen.
- Infected van cellen met een retrovirus dat een fluorescent gelabelde lac-repressor codeert.
- Monitoring van cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van plasmiden in levende cellen.
- Volgen van individuele plasmiden door celcycli heen.
- Inzichten in de handhaving van virale genomen in delende cellen.
- Verwerking van verkregen beelden om genoomverdeling te analyseren.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van DNA-dynamica in levende cellen.
- Fluorescent tagging maakt real-time observatie van genetisch materiaal mogelijk.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van het gedrag van virale genomen tijdens celdeling.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Monitoring plasmid replication in live mammalian cells enables real-time observation of genetic element behavior across generations, addressing a key gap in understanding episomal maintenance in therapeutic contexts. This approach supports target validation by providing quantitative, single-cell resolution of synthesis and partitioning dynamics, which informs predictive confidence in vector design and transgene stability assessments. The method is particularly relevant for de-risking viral vector platforms and synthetic biology constructs where faithful inheritance impacts long-term expression and safety profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis regarding episomal maintenance mechanisms in mammalian cells.
- Operational Value: Provides direct visualization of plasmid synthesis and daughter-cell partitioning without population averaging.
- Predictive Value: Supports assessment of genetic construct stability, informing lead selection for gene therapy and viral vector development.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable fluorescence signals compatible with high-content imaging workflows.
- Reproducibility: Allows longitudinal tracking of individual plasmids, reducing variability inherent in endpoint assays.
- Scalability: Compatible with adherent cell lines like HeLa and SLK, enabling cross-model comparison of replication fidelity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism studies with preclinical evaluation of vector persistence.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed plasmid loss stems from synthesis failure or partitioning defects, guiding vector optimization.
- Disease-Relevant System: Applied to EBV and KSHV-derived plasmids in human cell lines, offering insight into oncogenic viral maintenance relevant to antiviral target identification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, particularly in early lead optimization where transgene stability and expression consistency are critical decision points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of *cis*-acting elements and *trans*-acting factors influencing plasmid replication and segregation.
- Screening: Enables quantitative assessment of replication efficiency and partitioning fidelity across genetic variants.
- Analytics: Generates temporal, single-cell datasets that allow calculation of synthesis rates and inheritance patterns per generation.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to phenotypic outcomes in viral persistence models, informing preclinical advancement criteria.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for evaluating diverse genetic constructs under standardized conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in episomal maintenance by distinguishing synthesis from partitioning defects.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized transfection, selection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, predictive data on genetic construct stability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vectors based on multi-generational inheritance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to engineer LacO-repeat plasmids and fluorescent fusion protein expression.
- Depends on fluorescence microscopy infrastructure capable of time-lapse, Z-stack acquisition with environmental control.
- Necessitates optimization of IPTG washout timing and fusion protein expression levels to minimize background signal.
- Adaptation to primary or non-adherent cells may require protocol modifications for transfection efficiency and imaging compatibility.
- Phototoxicity management is essential for long-term imaging, necessitating careful selection of fluorescent proteins and excitation parameters.
