A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van Plasmodium falciparum-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource
May 16th, 2013
Deze werkwijze onderzoekt de bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering fenotype Plasmodium falciparum-Geïnfecteerde erytrocyten (PRBC) in klinische isolaten. Dit wordt uitgevoerd door het isoleren en co-incubatie van bloedplaatjes-rijk plasma en een opschorting van PRBC.
Deze procedure biedt enkele gestandaardiseerde richtlijnen voor het uitvoeren van plaatjesgemedieerde klompvormingstesten van klinische of laboratorium isolaten van plasmodium fals parem. Verzamel eerst bloed van een besmette patiënt en verzamel geparasiteerde erytrocyten door centrifugatie, kweek en zuiver vervolgens de aseksuele volwassen stadia. Verzamel vervolgens bloed van een gezonde donor om het plaatjesrijke plasma voor te bereiden en te standaardiseren door centrifugatie.
Combineer zowel de bloedplaatjes als de geparasiteerde erytrocyten voor de klompvormingstest. Stel dat resultaten van immunofluorescentiemicroscopie P Fal sperum klonten kunnen laten zien die worden gemedieerde door bloedplaatjes. Deze techniek is specifiek ontworpen om het klompvormingsfenotype van plasmodium sra te meten.
Klinische isolaten in een omgeving met weinig middelen. Minimale variaties in procedures zijn naar verluidt om de invloed op het resultaat van klompzuur in het veld te verhogen. Een duidelijk en gemakkelijk te volgen protocol, aangepast aan omgevingen met weinig middelen, was daarom nodig om te standaardiseren over malaria-endemische veldlocaties In een natriumcitraat, vacutainer verzamel ongeveer vijf milliliter volbloed van een malaria-naïeve gastheer of 2,5 milliliter bloed van CM of SM malariapatiënten.
Centrifugeer het volbloed gedurende 10 minuten bij 250 Gs bij kamertemperatuur. Breng vervolgens voorzichtig de troebele supernatant over in een schone 15 milliliter buis. Onthoud dat bloedplaatjes gemakkelijk worden geactiveerd door temperatuur, variaties en fysieke schokken.
Tel de PRP-suspensie met behulp van annoy bower's, hemo cytometer en pas de gewenste concentratie aan met PBS om plaatjesarm plasma-pellet te verkrijgen, de meerderheid van de bloedplaatjes uit een deel van de PRP-fractie door centrifugatie bij 1500 GS gedurende 10 minuten. Bewaar PRP- en PPP-fracties bij vier graden Celsius gedurende maximaal acht tot 10 dagen. Ideaal is het gebruik van verse bloedplaatjes voor de klompvormingstest.
Was de gepelletiseerde perifere rode bloedcellen drie keer met vijf tot 10 milliliter RPMI 1640 in een kweekflacon. Supplement PRBC met standaard malaria-kweekmedium en verse niet-geïnfecteerde rode bloedcellen om een 5% hematocriet te bereiken. Doordrenk de kweekflessen met een mengsel van 92,5% stikstof, 2,5% zuurstof en 5% kooldioxide. Verzegel vervolgens en kweek voor volwassen parasieten van patiënt pbcs.
Incubeer de kweekflacon gedurende 24 tot 36 uur in een incubator van 37 graden Celsius bij 5% kooldioxide. Plaats ongeveer 10 tot 15 microliter bloed op een uiteinde van een bevroren glazen plaatje dat op een vlakke ondergrond rust. Raak de druppel bloed met de rand van een tweede plaatje totdat het bloed gelijkmatig over de rand van het tweede plaatje is verspreid terwijl het tweede plaatje onder een hoek van 45 graden wordt gehouden.
Verspreid het bloed snel maar voorzichtig zonder teveel druk uit te oefenen op het eerste plaatje gelijkmatig over het eerste plaatje. Laat vervolgens de dunne film van bloed drogen, dehydrateer het monstergebied met methanol gedurende 10 seconden. Laat vervolgens opnieuw drogen, dompel het monster onder met 2% keem.
Laat minimaal 10 minuten staan. Spoel uitgebreid tot het water helder is en laat drogen. Bekijk de monsters onder een 100 x olie-emulsielens op een lichtmicroscoop.
Zuiver en synchroniseer vervolgens de volwassen PFS parum, PRBC zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng vervolgens de kweek over in een schone, steriele 15 milliliter buis. Pellet de cellen door centrifugatie bij kamertemperatuur bij 370 GS gedurende vijf minuten.
Aspireer nu voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de cellen op een zodanige manier dat de helft van het totale volume jello-fusing is. Een derde van de tweede helft is eiwitvrij medium en tweederde van de tweede helft is pbcs.
Breng de suspensie over in een steriele 15 milliliter buis en incubeer gedurende 15 tot 20 minuten in een incubator van 37 graden Celsius totdat er een duidelijke afbakening ontstaat tussen de bovenste en onderste lagen. Breng voorzichtig de bovenste laag over in een verse, steriele 15 milliliter buis en voeg 10 milliliter vers RPMI toe, centrifugeer bij 370 tot 430 GS gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens voorzichtig het supernatant weg.
Beoordeel nu parsit en ontwikkelingsstadium door een dunne bloeduitstrijk en onderzoek onder een lichtmicroscoop zoals eerder beschreven. Pas de P RBC-suspensie aan die is verkregen na plasmagelflotatie tot één maal 10 tot de achtste P RBC's per microliter in een verse 1,5 milliliter buis. We suspenderen pbcs bij 5% hematocriet aine oranje of atherium bromide bij 20 microgram per milliliter, eindconcentratie en PRP bij 10% van het totale volume.
Bereid eveneens de volgende controles voor: niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en PRP en PRBC met PPP om de rol van bloedplaatjes in de klompvorming van PBC's vast te stellen. Breng vervolgens de suspensie over in een schroefdop van twee milliliter. Plaats de fles onder zachte agitatie door rollen bij 10 tot 12 RRP bij kamertemperatuur, met bemonstering met tussenpozen van 15 tot 20 minuten gedurende in totaal 120 minuten om te controleren op klompvorming.
Pipetteer 10 microliters van het monster op een glazen plaatje en bedek het met een glazen deksel om het onder fluoresceren te bekijken, Een klomp wordt beschouwd als een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. Dit experiment testte ongeveer 70% volwassen stadia van p FALs parem na verrijking door plasmagelflotatie klonten zijn gemakkelijk onder de microscoop te spotten zoals onder normale licht. Ze verschijnen als celaggregaten en onder fluoresceren als groene of rode stippen.
Wanneer gekleurd met acro en oranje of atherium bromide sterven respect
Overzicht
Deze methode onderzoekt het door bloedplaatjes gemedieerde klonteringsfenotype van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde erytrocyten in klinische isolaten. De procedure omvat het isoleren en co-incuberen van bloedplaatjesrijk plasma met een suspensie van geparasiteerde rode bloedcellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Microbiologie
- Klinisch onderzoek
Achtergrond
- Door bloedplaatjes gemedieerde klontering is een belangrijk fenomeen in de malariapathologie.
- Het begrijpen van deze klontering kan helpen bij het beoordelen van de ernst van malaria.
- Gestandaardiseerde methoden zijn essentieel voor reproduceerbaarheid in onderzoek.
- Deze studie richt zich op klinische isolaten in omgevingen met beperkte middelen.
Doel van de studie
- Om een gestandaardiseerd protocol te ontwikkelen voor assays van door bloedplaatjes gemedieerde klontering.
- Om het klonteringsfenotype van Plasmodium falciparum te meten.
- Om onderzoek in malaria-endemische regio's te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Bloedverzameling van geïnfecteerde patiënten en gezonde donoren.
- Centrifugatie om geparasiteerde erytrocyten te isoleren en bloedplaatjesrijk plasma te bereiden.
- Co-incubatie van bloedplaatjes met geparasiteerde rode bloedcellen.
- Beoordeling van klontering met behulp van immunofluorescence microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Het klonteringsfenotype werd met succes gemeten in klinische isolaten.
- Condities voor bloedplaatjesactivatie werden geïdentificeerd om variabiliteit te minimaliseren.
- De resultaten wezen op significante klontervorming na incubatie.
- De klontergrootte nam significant toe na verloop van tijd, wat wijst op actieve klontering.
Conclusies
- De assay biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van malariapathologie.
- Standaardisatie is cruciaal voor consistente resultaten in verschillende omgevingen.
- Deze methode kan worden aangepast voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes provides a measurable phenotype linked to malaria severity in endemic populations. Standardizing this assay enables consistent evaluation of parasite adhesion mechanisms across resource-limited field sites. This supports target validation and mechanistic de-risking in antimalarial therapeutic development by linking in vitro phenotypes to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-parasite adhesion pathways involving CD36 and gC1qR/HABP1/p32 receptors.
- Operational Value: Provides a standardized method to assess clumping phenotype in clinical isolates without cryopreservation.
- Predictive Value: Links in vitro clumping frequency to disease severity in patient populations, supporting biomarker association studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses platelet-rich plasma and purified parasitized erythrocytes to generate quantitative clumping readouts.
- Reproducibility: Defines centrifugation, incubation, and sampling intervals to minimize variability in low-resource settings.
- Scalability: Requires minimal equipment (centrifuge, microscope) enabling deployment across malaria-endemic field sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects platelet-mediated clumping to severe malaria phenotypes observed in pediatric cerebral malaria cases.
- Translational Continuity: Allows progression from field isolate testing to mechanistic studies of adhesion receptor inhibition.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of compounds or antibodies that disrupt platelet-mediated clumping in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the malaria discovery continuum from early target validation to preclinical evaluation of adhesion-blocking interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of parasite ligand-receptor interactions involved in sequestration and microvascular pathology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (clump frequency and size) for evaluating compound effects on platelet-mediated aggregation.
- Analytics: Generates measurable endpoints—clump frequency per 1000 infected cells and average clump size—enabling comparison across isolates and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro phenotyping with ex vivo clinical correlations from severe malaria patient cohorts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing adhesion phenotypes across diverse Plasmodium falciparum strains and geographic isolates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in parasite sequestration by quantifying a receptor-mediated adhesion phenotype.
- Operational Value: Ensures standardization through defined platelet preparation, parasite enrichment, and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antimalarial programs by identifying compounds that inhibit pathogenic adhesion mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro clumping inhibition to potential reduction in severe malaria outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in parasitology, blood handling, and microscopy for accurate isolate preparation and clump detection.
- Dependent on centrifuge access for platelet-rich plasma preparation and parasitized erythrocyte purification.
- Necessitates standardization of agitation speed (10–12 rpm) and sampling intervals (15–20 min) across sites to ensure reproducibility.
- Must account for platelet sensitivity to temperature shifts and mechanical stress during isolation and assay setup.
- Limited to qualitative and semi-quantitative readouts unless paired with automated imaging or flow cytometry for high-throughput adaptation.
