Name: A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van Plasmodium falciparum-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer een gestandaardiseerd protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde klontvorming van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde erytrocyten. Deze methode is specifiek ontwikkeld voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mogelijk gemaakt door financiële steun van de Wellcome Trust. JM (080.964) en SCW (080.948) werden ondersteund door Wellcome Trust beurzen en DT door een Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studententijd.

1. Monsterneming Bloedplaatjes kunnen eenvoudig worden geactiveerd door middel van temperatuur, agitatie of opslag en daarom moeten ze met zorg worden behandeld. Het gebruik van vacutainers om bloed in te zamelen voor bloedplaatjes voorbereiding is onvermijdelijk in de meeste klinische situaties, maar moet zorgvuldig worden overwogen als zuigkracht kan mogelijk leiden tot activering van bloedplaatjes. Vanwege het klinische protocol dat wordt gebruikt in ons onderzoek het ziekenhuis, zijn onze monsters zorgvuldig verzamelde in natriumcitraat vacutainers. We hebben geen problemen met vroegtijdige activering van plaatjes in deze of onze vorige studie 12 meegemaakt. Wij verzamelen van bloed voor bloedplaatjes voorbereiding van bloedgroep O + individuen om niet-specifieke bloedgroep antigen aggregatie minimaliseren. Donoren ook niet opgenomen geneesmiddel in de voorafgaande 7-10 dagen omdat sommige geneesmiddelen is bekend bloedplaatjesfunctie beïnvloeden. 1.1 Bereiding van bloedplaatjes-rijk plasma (PRP) <ol><li> Verzamel ongeveer 5 mlvan volbloed van een malaria-naïeve gastheer of 2,5 ml bloed uit CM of ernstige malaria (SM) patiënten in een natriumcitraat vacutainer (BD productnummer 36276). </li><li> Centrifugeer de volbloed bij 250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Niet centrifugeren bij 4 ° C zo lage temperaturen de bloedplaatjes aggregatie veroorzaken. </li><li> Overdracht zorgvuldig de bewolkte supernatant in een schone 15 ml buis. Bloedplaatjes zijn gemakkelijk geactiveerd door temperatuurschommelingen en schokken en moet daarom met zorg worden behandeld. Vermijd schudden of schokkerige bewegingen van de buis. </li><li> Gebruik een Neubauer haematocytometer de bloedplaatjessuspensie tellen en aanpassen&gt; 300 x 10 3 bloedplaatjes / ul voor gezonde donors en &lt;150 x 10 3 bloedplaatjes / gl van GH en SM patiënten die 1X fosfaatbuffer (pH 7,2-7,4, PBS). Zorg ervoor dat u kiest voor een hoge verdunningsfactor om het aantal bloedplaatjes te verminderen en de juistheid ervan te waarborgen. </li></ol> Opmerking: Malaria patients hebben een verminderd aantal bloedplaatjes in vergelijking met de gezonde individuen 16,17,18. Daarom bloedplaatjes concentraties voor CM en de UM worden aangepast op basis van tellingen van de gemiddelde bloedplaatjes van patiënten binnen elke malaria diagnostische groep. De P. falciparum samenklontering fenotype is gebruikelijk in CM isolaten en toont een sterke bindingsaffiniteit dus de verminderde bloedplaatjes concentraties heeft geen invloed klonteren omvang of frequentie sinds concentratie van bloedplaatjes is gestandaardiseerd voor alle CM gevallen. 1.2 Voorbereiding van de bloedplaatjes-arm plasma (PPP) <ol><li> PPP verkrijgen centrifugeren een gedeelte van de PRP hierboven verkregen bij 1500 xg gedurende 10 minuten. De meerderheid van bloedplaatjes pellets op de bodem van de buis. </li><li> Zowel PRP en PPP kunnen bij 4 ° C gedurende twee weken opgeslagen. Idealiter gebruik verse plaatjes voor de klonteren assay. Na 8-10 dagen meeste bloedplaatjes waarschijnlijk inactief en waarschijnlijk geaggregeerd. </li></ol> 2. Parasite Cultuur <ol><li> De gepelleteerde PRBC driemaal uit met 5-10 ml RPMI 1640 door centrifugatie bij 370 xg gedurende 5 minuten. Opmerking: in dit protocol alle culturen begon vanaf ongeveer 1 ml packed cell volume (PCV) en gehandhaafd op 5% hematocriet. Culturen kan worden gestart met een PCV van PRBC en aangepast met geïnfecteerde RBC en media om de gewenste hematocriet te bereiken. </li><li> Plaats de PRBC in een kolf en supplement met standaard malaria kweekmedium RPMI 1640 gesupplementeerd met 25 mM HEPES, 5% Albumax II of 10% serum en 40 ug / ml gentamycine een 5% hematocriet bereiken. </li><li> Permeaat cultuur kolven met een mengsel van 92,5% stikstof, 2,5% zuurstof en 5% kooldioxide voor het afdichten en incuberen. Als alternatief kan de luchtdichte kaarsenfles methode Trager-Jensen worden gebruikt. </li><li> Voor PRBC rechtstreeks verkregen van patiënten, incubeer hun cultuur kolf gedurende 24-36 uur in een 37 ° C incubator in 5% CO 2 tot volwassen parasieten te krijgen. OPMERKING: Most laboratorium-en cultuur-aangepaste lijnen zijn zeer gemakkelijk te onderhouden in de cultuur onder standaard omstandigheden. Er zijn eenvoudig hieronder beschreven technieken die kunnen worden gebruikt om verschillende parasietstadia synchroniseren groei te behouden. </li><li> Bereid een dunne bloeduitstrijkje zoals hieronder beschreven en onderzocht parasiet rijping onder een lichtmicroscoop. </li></ol> 3. Dunne Bloed Film Slide Voorbereiding <ol><li> Plaats ongeveer 10-15 ul van bloed aan het ene uiteinde van een matglazen dia rusten op een plat oppervlak. </li><li> Raak de bloeddruppel met de rand van een tweede schuif totdat het bloed gelijkmatig wordt verdeeld over de rand van de tweede schuif. </li><li> Terwijl de tweede dia in een hoek van 45 °, snel maar voorzichtig, zonder zelf te veel druk op de eerste dia, schuift het bloed over de eerste dia om een ​​dunne film van het bloed, dat gelijkmatig wordt verspreid maken. Lucht drogen. </li><li> Dompel de dia in methanol gedurende 10 sec. Lucht drogen. </li><li> Dompel de dia in 2% Giemsa stain gedurende tenminste 10 minuten. Spoel uitgebreid totdat het water helder is. Lucht drogen. </li><li> Onderzoeken dia met behulp van een 90-100x olie-emulsie lens op een lichtmicroscoop </li></ol> 4. Zuivering en Synchronisatie van Ongeslachtelijke Stages De zuivering van volwassen P. falciparum PRBC is een verplichte stap voor het klonteren assay. Inderdaad, alleen volwassen parasieten kunnen binden aan bloedplaatjes receptoren is in dit levensstadium dat de desbetreffende liganden expressie en steken uit het oppervlak van geïnfecteerde erythrocyten. Er zijn verschillende methoden om te zuiveren en te synchroniseren aseksuele fasen van P. falciparum: Late aseksuele stadia kan worden verrijkt door Percoll gradiënt 19; magnetische celsortering 20 of via de gelatine sedimentatie 21 hier beschreven protocol.. Sorbitol-synchronisatie selecteren voor ring fasen 22, waarna de ringen worden gedurende 24-26 uur bij een latere fase te verkrijgen (zonder nBehoefte aan gelatine beursgang voeren). 4.1 Plasmagel Flotation Plasmagel flotatie gebruikt gelatine-achtige oplossing te selecteren op lager gewicht knobbed erytrocyten in oplossing blijft terwijl de dichte ring vormen en rozetten naar de bodem zinken. Deze techniek geeft tot 90% zuiverheid van het volwassen stadium geïnfecteerde erytrocyten en kan worden gebruikt voor zowel veld en laboratorium isolaten. Zoals eerder vermeld, plasmagel flotatie verwijderd rosette PRBC en onvolwassen stadia die kunnen resulteren in een verminderde klontering frequentie in monsters met een hoge frequentie rosetting. Echter, zou de afwezigheid van de rosette PRBC na plasmagel beursgang geen invloed op de samenklontering assay omdat rosetting is een interactie van PRBC en niet-geïnfecteerde erytrocyten terwijl klonteren is pRBCs bindend gemedieerd door bloedplaatjes. De ligand betrokken bij deze twee eigenschappen is anders, met voornamelijk een aanvulling receptor CR-1 op geïnfecteerde erytrocyten bemiddelen rosetting.<ol><li> Voorverwarmen gelofusine oplossing en serum / Albumax II-vrij medium tot 37 C in een waterbad. </li><li> Overdracht cultuur een schone steriele 15 ml buis en pellet cellen door centrifugeren bij kamertemperatuur bij 370 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zorgvuldig aspireren supernatant om niet de pellet en resuspendeer cellen verstoren in een gelijk volume gelofusine en eiwitvrij medium. </li><li> Breng het mengsel in een steriele 15 ml buis en toe gedurende 15-20 minuten in een 37 ° C incubator of totdat een duidelijk onderscheid te zien tussen een bovenste en onderste niveau. </li><li> Overdracht zorgvuldig de bovenste laag om een ​​frisse steriele 15 ml buis en voeg 10 ml vers RPMI. </li><li> Centrifugeer bij 370 xg gedurende 5 minuten en zorgvuldig gooi supernatant. </li><li> Beoordelen parasitemie en het ontwikkelingsstadium door dunne bloeduitstrijkje en te onderzoeken onder een lichtmicroscoop zoals beschreven in paragraaf 4. </li></ol> OPMERKING: Mature PRBC bereik tussen 60-90% van de geïnfecteerde erytrocyten depending op de eerste parasitemie van de cultuur. Voor hoog percentage van de volwassen parasieten, gebruik culturen met een initiële parasitaemie van ≥ 10%. 5. Klonteren Assay <ol><li> Gebruik een Neubauer haematocytometer aan de PRBC suspensie verkregen na plasmagel beursgang tellen en aanpassen aan 1 x 10 8 PRBC / ul. </li><li> In een nieuwe 1,5 ml buis, resuspendeer PRBC bij 5% hematocriet, acridine oranje aan 20 ug / ml eindconcentratie en PRP op 10% van het totale volume. In plaats van acridine oranje, kan parasiet culturen worden gekleurd met 25 ug / ml ethidiumbromide gedurende 5 minuten vóór gebruik. Bijvoorbeeld voor een 200 ul reactiemengsel, voeg 10 ul volwassen PRBC, 20 ui 300 x 10 3 bloedplaatjes / ul voor PRP van gezonde donors of 150 x 10 3 bloedplaatjes / ul van SM patiënten en 170 gl eiwitvrij medium. OPMERKING: De verhouding van bloedplaatjes: PRBC in de uiteindelijke reacties is 20:01. Dit is belangrijk, en kan de maximum samenklontering frequentie van een monster te bepalen. Als er minder bloedplaatjes worden toegevoegd bij de controles dan niet alle klonteren pRBCs misschien de kans om klonteren te hebben. </li><li> Op dezelfde manier bereiden de volgende controles; niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en PRP en PRBC met PPP om de rol van bloedplaatjes in de pRBCs klonteren vergewissen. </li><li> Breng de suspensie over een 1,5-2,0 ml conische schroefdop flacon. </li><li> Plaats het flesje onder zacht schudden door walsen bij 10-12 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Controleer vorming clump een nat-dia bereid door pipetteren 10 ui PRBC ± bloedplaatjes mix op een glasplaatje, bedekken met een glas slip en onderzoek onder fluorescentie. </li><li> Bemonstering kan worden gedaan op 15-20 min. intervallen voor een totaal van 120 minuten. Een klomp wordt beschouwd als een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. </li></ol>

<ol><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Today%22%5BJournal%5D)">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li>
<li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li>
<li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li>
<li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li>
<li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li>
<li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li>
<li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li>
<li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li>
<li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR%2FHABP1%2Fp32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li>
<li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li>
<li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li>
<li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422(2011).</li>
<li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li>
<li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243(2008).</li>
<li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+%28IgM%29+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li>
<li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation%3A+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li>
<li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection-induced+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li>
<li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li>
<li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MACS%22%5BJournal%5D)">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li>
<li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li>
<li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li>
<li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li>
<li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma%3A+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben beschreven een bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering assay gebruikt voor het bestuderen PRBC in klinische isolaten direct in het veld. Bloedplaatjes-gemedieerde klonterende karakteristiek gedrag P. falciparum klinische isolaten is geïdentificeerd als een aparte kleefstof fenotype, vaak in CD36-bindende isolaten 12,23-24. We hebben gebruik gemaakt van deze test om drie belangrijke punten te identificeren: 1) een sterke in vitro klonteren fenotype van P. falciparum geïsoleerd van Malawi kinderen die is geassocieerd met de ziekte ernst en diagnose 2) nieuwe receptor P-selectine mediaties klonteren van bloedplaatjes met CD36, 3) de mate van trombocytopenie aanwezig bij patiënten met CM volstaat om de verdere vorming van klonten in PRBC beperken 12 vitro. De betrokkenheid van bloedplaatjes in formatie klomp wordt aangetoond door de behandeling van een natte-dia preparaat zoals beschreven in hoofdstuk 6. Bloedplaatjes kunnen van PRP worden geïsoleerd door centrifugeren bij hoge snelhedenom de bloedgroep antigene reacties te minimaliseren, maar gebruikten we hele PRP om voortijdige activering van plaatjes van overmatig gebruik en van de hoge snelheid centrifugeren minimaliseren. Bloedplaatjes activiteit kan worden gemeten door de plaatjesaggregatie beproeving met zwakke bloedplaatjes agonisten, epinefrine of adenosine difosfaat (ADP) 25 zoals beschreven in 26. Er zijn verschillende aspecten van de test die eerder zijn slecht gekarakteriseerd, een daarvan is het belang van het selecteren PRP bronnen en het effect van bloed antigen groepen op de uitkomst van de assay. We bereidden PRP van personen die bloedgroep O + waren en had geen medicatie in de laatste 7-10 dagen niet genomen voordat bloed wordt getekend als sommige geneesmiddelen kunnen bloedplaatjes gedrag beïnvloeden. Andere factoren die van invloed kunnen klonteren succes omvatten PRBC hematocriet parasitemie niveau en lengte van het klonteren assay. Met behulp van hoge hematocriet en bloedplaatjes count het moeilijk zou zijn om te zeggen of het cluster is echt een klomp of dat er te veel cellen zijn alleen bij elkaar zitten, omdat ze dicht op elkaar gepakt 15. Klontvormende ook algemeen toe met langere incubatietijden. Dit zijn allemaal nuttige richtlijnen die moeten worden overwogen bij het ontwerpen klonteren studies. We vinden dat monsters van verschillende klinische groepen kunnen parallel geanalyseerd met PRP van dezelfde donor als het mogelijk zou zijn, maar in beperkte broninstellingen zoals veldsites transfusie zwembad het algemeen beperkt. Het is derhalve moeilijk om een ​​enkele O + donor tot assays standaardiseren zijn. Daarom hebben we een aantal O + donoren geïdentificeerd om bloedgroep compatibiliteit te garanderen waar mogelijk. Het gebruik van meerdere donoren is ook nuttig in gevallen van grote steekproeven maten zodat last van bloeddonatie niet op slechts een persoon vallen. Bemonsteringspunten 15-20 min zijn veel meer haalbaar als een person is het uitvoeren van de tests, waardoor voor natte-preparaten, en het uitvoeren van test kinetiek zonder bemonsteringstijden overlappen. De meeste van de microscopische gegevens visueel en enigszins objectief, daarom is het belangrijk dat celtelling wordt geverifieerd door meerdere personen. In dat geval kan hanteren een monster tegelijkertijd gebruiken volledige analyse van 3-4 monsters per dag, afhankelijk van persoonlijke efficiency. Bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering kan worden uitgevoerd met zowel klinische en laboratorium isolaten. Voor laboratorium-lijnen, is het aanbevolen dat CD36 bindende parasieten worden gebruikt om klonteren frequenties te maximaliseren. De assay kan worden gekoppeld met andere agglutinatie assays zoals rosette of in klonteren inhibitie assays die de studie van receptoren op de bloedplaatjes die PRBC binding, een slecht begrepen en onderzocht aspect van dit fenotype kunnen bemiddelen zou stellen.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-092</td><td> </td></tr><tr><td>Acridine oranje</td><td>Invitrogen</td><td>A3568</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelofusine</td><td>B Braun</td><td>Gelofusine</td><td> </td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td> </td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Invitrogen</td><td>15750045</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Albumax</td><td>GIBCO</td><td>1102-037</td><td> </td></tr><tr><td>Natriumcitraat vacutainer</td><td>BD</td><td>362760</td><td>capaciteit 4 ml</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Leica</td><td>MD16000 B</td><td> </td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Bevat blauwe en groene fluorescentiefilters voor acridine oranje en ethidiumbromide</td></tr></tbody></table>

a simple protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde klontvormende van<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt;-geïnfecteerde erytrocyten in een slechte setting resource

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum zorgt ervoor dat de meerderheid van de ernstige malaria infecties. De pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan cerebrale malaria (CM) zijn niet volledig begrepen en verscheidene hypothesen naar voren gebracht, met inbegrip van mechanische obstructie van kleine bloedvaten door P. falciparum-geparasiteerde rode bloedcellen (PRBC). Sterker nog, tijdens de intra-erytrocytaire fase van zijn levenscyclus, P. falciparum heeft het unieke vermogen om het oppervlak van de geïnfecteerde erytrocyten wijzigt exporteren oppervlakteantigenen met verschillende kleefeigenschappen op de RBC membraan. Hierdoor kan de beslaglegging op PRBC in meerdere weefsels en organen door adhesie aan endotheelcellen die de microvasculatuur van post-capillaire venules 1. Door dit te doen, de rijpe vormen van de parasiet te voorkomen milt goedkeuring van de misvormde geïnfecteerde erytrocyten 2 en beperken hun omgeving om een gunstiger lage zuurstofdruk 3. Als gevolg van deze Sequestrantsoen is slechts onvolwassen ongeslachtelijke parasieten en gameten die in het perifere bloed worden gedetecteerd. Cytoadherence en opslag van volwassen PRBC aan de talrijke gastheer receptoren tot expressie gebracht op microvasculaire bedden optreedt bij ernstige en ongecompliceerde ziekte. Echter, verscheidene lijnen van bewijs suggereren dat alleen specifieke lijm fenotypes waarschijnlijk gepaard gaan met ernstige pathologische uitkomsten van malaria. Een voorbeeld van dergelijke specifieke gastheer-parasiet interacties aangetoond in vitro, waarbij het ​​vermogen van de intercellulaire adhesiemolecuul-1 binding van PRBC ondersteunen met bijzondere hechtingseigenschappen is gekoppeld aan de ontwikkeling van cerebrale malaria 4,5. De placenta is ook erkend als gebied van preferentiële PRBC accumulatie in malaria-geïnfecteerde zwangere vrouwen, met chondrotinesulfaat A geuit op syncytiotrophoblasts die lijn de placenta intervilleuze ruimte als de belangrijkste receptor 6. Rosette van PRBC to geïnfecteerde erytrocyten via complement receptor 1 (CD35) 7,8 is ook geassocieerd met ernstige ziekte 9. Een van de meest recent beschreven P. falciparum cytoadherence fenotypen is het vermogen van de PRBC van bloedplaatjes-gemedieerde klonten in vitro. Deze vorming van klonten PRBC vereist CD36, een glycoproteïne op het oppervlak van bloedplaatjes. Andere menselijke receptor, gC1qR/HABP1/p32, uitgedrukt op diverse celtypen waaronder endotheelcellen en bloedplaatjes, is ook aangetoond dat PRBC hechting op bloedplaatjes tot klonten 10 vergemakkelijken. Of klonten ontstaan ​​in vivo blijft onduidelijk, maar kan verklaren de significante accumulatie van bloedplaatjes in de hersenen microvasculatuur van Malawi kinderen die stierven CM 11 beschreven. Bovendien is het vermogen van klinisch isolaat culturen te klonteren in vitro werd direct verbonden met de ernst van de ziekte in 12 Malawian </sup&gt; En Mozambikaanse patiënten 13, (hoewel niet in de Malinese 14). Met verschillende aspecten van de PRBC klonteren fenotype slecht gekarakteriseerd, hebben de huidige studies over dit onderwerp niet gevolgd een gestandaardiseerde procedure. Dit is een belangrijke kwestie als gevolg van de bekende hoge variabiliteit inherent in de test 15. Hier presenteren we een werkwijze voor het in vitro bloedplaatjes-gemedieerde kluiten P. falciparum met de hoop dat een platform voorziet in een consistente werkwijze van andere groepen en bewustzijn van de beperkingen verhogen onderzoeken dit fenotype in toekomstige studies. Wordt gevestigd in Malawi, bieden wij een protocol speciaal ontworpen voor een beperkte omgeving hulpbron, met het voordeel dat vers verzameld klinische isolaten kunnen worden onderzocht op fenotype zonder noodzaak van cryopreservatie.

Een voorbeeld van een bloedplaatjes-gemedieerde klomp assay met ongeveer 70% volwassen stadia van P. falciparum na verrijking door plasmagel beursgang is weergegeven in figuur 2. Een klomp is een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. Kleuring met acridine oranje of ethidiumbromide kan worden gevisualiseerd door fluorescentie microscopie. Acridine oranje spectraal vergelijkbaar met fluoresceïne, een excitatie maximum bij 502 nm en een emissiemaximum bij 525 nm (groen), terwijl ethidium bromide heeft een excitatie-maximum bij 493 nm en een emissiemaximum bij 620 nm (vergelijkbaar met rhodamine kleurstoffen, red ). Klontjes zijn makkelijk te herkennen onder de microscoop zoals onder normaal licht ze als celaggregaten en onder fluorescentie als puntjes met groen of rood na kleuring met acridine oranje en ethidiumbromide kleurstoffen, respectievelijk, zoals weergegeven in figuur 2 (30 min tijdstip met acridine oranje ). Hoe groter de massa, hoe groter de cel aggregaat weergegeven under normaal licht en hoe groter de vlekken van groene of rode fluorescentie onder de respectievelijke kleurstoffen. Aangezien de kleurstoffen doelwit DNA en daarom vlek kernen, bloedplaatjes en niet-geïnfecteerde RBC niet worden gedetecteerd onder fluorescentie microscopie vanwege hun gebrek aan kernen. Willekeurige vorming van kleine PRBC groepjes van 4,7 ± 1,6 pRBCs / klonteren optreden na 30 minuten. De clump maat verhoogt tot gemiddeld&gt; 15 PRBC / massa na incubatie gedurende 120 min met enige klonten met tientallen PRBC / massa die niet visueel kunnen worden geteld. De frequentie van het klonteren fenotype wordt berekend als het aantal geïnfecteerde cellen aanwezig in groepjes / 1000 geïnfecteerde cellen, geteld in duplo assays. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figuur 1. Werken flow voor klonteren experiment. Bloedplaatjes rich en arm plasma (A) en een P. falciparum-geïnfecteerde erytrocyten cultuur (B) worden bereid en vervolgens gecombineerd om het klonteren assay (C). <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figuur 2. Samenklontering van erytrocyten geïnfecteerd door P. falciparum laboratorium isoleren. Clumps gevormd door HB3 op tijdstip 0, 30 en 120 min in bloedplaatjes-rijk plasma (A) en slechte klonteren vorming in bloedplaatjes arm plasma (B). Assay Beperkingen Er zijn beperkingen die specifiek van invloed zijn functie van de bloedplaatjes of invloed uitkomst en de meeste daarvan zijn al benadrukt door Arman en Rowe 15. Hier noemen we enkele van de mogelijke problemen die zouden kunnen optreden bij different stadia van de assay: <ol><li> Aanpassing klinische isolaten in vitro cultuur kan een uitdaging soms langere tijd kweek nodig om voldoende hoge parasitemie bereiken om de vorming van klonten mogelijk te maken. Met hoge antigene variatie tarieven in P. falciparum, de lijm fenotype van de cultuur-aangepaste parasiet misschien niet overeen met de oorspronkelijke infecterende parasiet populatie na langdurige tijd in cultuur. </li><li> Teneinde niet-specifieke agglutinatie door bloedgroep antigenen voorkomen moet bloedplaatjesdonoren overeenkomen voor bloedgroep antigeen klinische isolaten in dezelfde assay of de universele donorbloed antigen O gebruikt. Echter, mensen met bloedgroep O-zijn zeldzaam in Afrikaanse sites zoals Malawi en bloedplaatjes daarom vaak gebruikt worden verkregen van bloedgroep O + donoren en moeten worden afgestemd voor bloedgroep. </li><li> Tellen klonten op een nat preparaat glijbaan is lastig en uitdagend voor het vastleggen van beelden als de cellen zijn constant in beweging. Meestal PRBC ophopen op de randen van het dekglaasje of zij de neiging aan elkaar te kleven vorming &quot;false&quot; klonten die gemakkelijk kunnen worden verward met echte massa. Om celbeweging verminderen, zodat de cellen te sedimenteren gedurende 15 min bij kamertemperatuur voorafgaand aan de analyse. </li><li> De samenklontering test is tijdgevoelige en derhalve alleen tot een monster per persoon te analyseren op een tijdstip voor een optimale nauwkeurigheid. Bemonsteringstijd punten twee verschillende monsters gemakkelijk overlappen, resulteert verkeerde monsternemingstijdstippen tussen monsters bij gevaar meer dan een monster tegelijk. In dergelijke omstandigheden kan geavanceerde kwantitatieve software klonteren afmetingen bepalen of alternatief cel-specifieke antilichamen worden gebruikt om de samenstelling van de klonten te analyseren. Hoewel deze technieken kan sterk verbeteren van de betekenis van de gegevens, in arme omgevingen waar deze test waarschijnlijk zal worden gebruikt, zoals technieken en apparatuur zijn niet direct beschikbaar. </li></ol>

Deze werkwijze onderzoekt de bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering fenotype<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Geïnfecteerde erytrocyten (PRBC) in klinische isolaten. Dit wordt uitgevoerd door het isoleren en co-incubatie van bloedplaatjes-rijk plasma en een opschorting van PRBC.

A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource

*P. falciparum* veroorzaakt de meeste ernstige malariainfecties. De pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan cerebrale malaria (CM) zijn niet volledig...

Deze procedure biedt enkele gestandaardiseerde richtlijnen voor het uitvoeren van assays voor bloedplaatjes-gemedieerde klontering van klinische of laboratoriumisolaten van Plasmodium falciparum. Verzamel eerst bloed van een geïnfecteerde patiënt en oogst de geparasiteerde erytrocyten door centrifugatie, en kweek en zuiver vervolgens de mature aseksuele stadia. Verzamel daarna bloed van een gezonde donor om bloedplaatjesrijk plasma voor te bereiden en te standaardiseren door centrifugatie.Combineer zowel de bloedplaatjes als de geparasiteerde erytrocyten voor de klonteringsassay. De resultaten van immunofluorescentiemicroscopie kunnen P. falciparum-klonten aantonen die worden gemedieerd door bloedplaatjes. Deze techniek is specifiek ontworpen om het klonteringsfenotype van Plasmodium spp. te meten.Klinische isolaten in een omgeving met beperkte middelen. Er is gemeld dat minimale variaties in procedures de uitkomst van de clumping acid-test in het veld beïnvloeden. Daarom was er behoefte aan een helder en gemakkelijk te volgen protocol, aangepast aan omgevingen met beperkte middelen, om standaardisatie over malaria-endemische veldlocaties te realiseren. Verzamel in een sodiumcitraat-vacutainer ongeveer vijf milliliter volbloed van een gastheer zonder malaria-ervaring of 2,5 milliliter bloed van patiënten met CM- of SM-malaria.Centrifugeer het volbloed bij 250 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Draag vervolgens het troebele supernatant voorzichtig over naar een schone buis van 15 milliliter. Houd er rekening mee dat bloedplaatjes gemakkelijk worden geactiveerd door temperatuurschommelingen en fysieke schokken.Tel de PRP-suspensie met een Neubauer-hemocytometer en pas de gewenste concentratie aan met PBS. Verkrijg een platelet poor plasma-pellet, waarbij het merendeel van de bloedplaatjes uit een deel van de PRP-fractie wordt verwijderd door centrifugatie bij 1500 ×g gedurende 10 minuten. Bewaar de PRP- en PPP-fracties bij 4 °C voor maximaal 8 tot 10 dagen. Gebruik idealiter verse bloedplaatjes voor de clumping-assay.Was de gepelletteerde perifere rode bloedcellen drie keer met vijf tot 10 milliliters RPMI 1640 in een kweekfles. Vul de PRBC aan met standaard malariakweekmedium en verse niet-geïnfecteerde rode bloedcellen om een hematocriet van 5% te bereiken. Spoel de kweekflessen door met een mengsel van 92.5% stikstof, 2.5% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Sluit deze vervolgens af en kweek ze voor rijpe parasieten uit patiënten-pbcs.Incubeer de kweekfles gedurende 24 tot 36 uur in een incubator bij 37 °C met 5% carbon dioxide. Plaats ongeveer 10 tot 15 µL bloed op één uiteinde van een matglasplaatje dat op een vlak oppervlak rust. Raak de bloeddruppel aan met de rand van een tweede objectglas, terwijl het tweede objectglas in een hoek van 45 graden wordt gehouden, totdat het bloed gelijkmatig over de rand van het tweede objectglas is verspreid.Verspreid het bloed snel maar voorzichtig gelijkmatig over de eerste objectglasplaat, zonder te veel druk uit te oefenen. Laat de dunne bloedfilm vervolgens aan de lucht drogen en dehydrateer het monstergebied gedurende 10 seconden met methanol. Laat dit daarna opnieuw aan de lucht drogen en dompel het monster vervolgens onder in 2% keem.Laat dit ten minste 10 minuten inwerken. Spoel uitgebreid tot het water helder is en laat aan de lucht drogen. Onderzoek de monsters onder een 100 x olie-emulselens op een lichtmicroscoop.Purificeer en synchroniseer vervolgens de mature PFS parum, PRBC zoals beschreven in het tekstprotocol. Draag de cultuur over naar een schone, steriele buis van 15 milliliter. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij kamertemperatuur bij 370 GS gedurende vijf minuten.Aspire nu voorzichtig het supernatant zonder het pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de cellen zodanig dat de helft van het totale volume bestaat uit jello fusing. Van de tweede helft is één derde eiwitvrij medium en twee derde pbcs.Breng de suspensie over naar een steriele buis van 15 milliliter en incubeer deze gedurende 15 tot 20 minuten in een incubator op 37 degrees Celsius totdat er een duidelijke scheiding ontstaat tussen de bovenste en onderste lagen. Breng de bovenste laag voorzichtig over naar een nieuwe steriele buis van 15 milliliter, voeg 10 milliliters vers RPMI toe en centrifugeer bij 370 to 430 GS gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.Beoordeel nu de parasitemie en het ontwikkelingsstadium via een dun bloeduitstrijkje en onderzoek dit onder een lichtmicroscoop zoals eerder beschreven. Pas de P RBC-suspensie die is verkregen na plasmagel-flotatie aan naar 1 × 10⁸ P RBC's per µL in een nieuwe 1,5 mL buis. We suspenderen de RBC's bij 5% hematocriet in acridine oranje of ethidiumbromide met een eindconcentratie van 20 µg/mL en PRP tegen 10% van het totale volume.Bereid op dezelfde wijze de volgende controles voor: niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en PRP en PRBC met PPP, om de rol van bloedplaatjes bij de klontering van de PBC vast te stellen. Breng de suspensie nu over naar een schroefdopflacon van twee milliliter. Plaats de flacon onder zachte agitatie door te rollen bij 10 tot 12 RRP bij kamertemperatuur, waarbij op intervallen van 15 tot 20 minuten monsters worden genomen gedurende een totale tijd van 120 minuten om de vorming van klonters te controleren.Pipetteer 10 µL van het monster op een objectglas en dek dit af met een dekglas om het onder fluorescentie te onderzoeken. Een klont wordt beschouwd als een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. In dit experiment werden ongeveer 70% van de rijpe stadia van p FALs parem geanalyseerd na verrijking door plasmagel-flotatie. Klonten zijn onder de microscoop gemakkelijk te herkennen, zowel onder gewoon licht als onder fluorescentie. Ze verschijnen als celaggregaten en onder fluorescentie als groene of rode vlekken.Wanneer respectievelijk gekleurd met acridine oranje of ethidiumbromide, neemt de grootte van de clusters aanzienlijk toe tot een gemiddelde van meer dan 15 pbcs per cluster na incubatie gedurende 120 minuten, waarbij sommige clusters talrijke pbcs per cluster bevatten die visueel niet geteld konden worden. De frequentie van het klonteringsfenotype wordt berekend als het aantal geïnfecteerde cellen aanwezig in clusters per 1000 geïnfecteerde cellen, geteld in dubbele assays.Na het bekijken van deze video heeft u nu een duidelijk inzicht in het uitvoeren van een assay voor plaatjesgemedieerde klontering van Plasmodium falciparum. Let erop dat u de bloedplaatjes niet activeert door schokkerige bewegingen en temperatuurschommelingen. Deze assay kan ook worden toegepast om de plaatjesgemedieerde klonteringsassay bij ernstige malaria te meten.

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

Selectie van Plasmodium falciparum Parasieten voor Cytoadhesion Human Brain endotheelcellen

This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

De paramagnetische eigenschappen van hemozoin gebruikt in latere stadia van...

Scheiding van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-geïnfecteerde erythrocyten met magnetische middelen

Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.

HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Eiwitten

Menselijk microRNA transloceert van gastheer erytrocyten naar Plasmodium falciparum parasieten. Hier worden de technieken beschreven die worden gebruikt om synthetische microRNA's in gastheer erytrocyten te transfecteren en alle RNA's uit P. falciparum te isoleren. Daarnaast zal dit artikel een methode voor polysoomisolatie in P. falciparum beschrijven om de ribosomale bezetting en translationele potentieel van parasiet transcripten te bepalen.

Methoden om de regulerende rol van kleine RNA&#39;s en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in besmette waterige rode bloedcellen, met behulp van een verzwakte totale reflectie infrared spectrometer en multivariate data-analyse.

Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse

Het algemene doel van dit protocol is om instructies te geven over het meten van de capaciteit van antilichamen aanwezig in sera of plasma van individuen, van nature blootgesteld aan Plasmodium falciparum infectie, om fagocytose van de parasiet-geïnfecteerde erytrocyten (IEs) te opsoniseren en induceren.

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test

Hier beschrijven we een nieuwe methode om de mechanismen van cellulaire immuniteit tegen Plasmodium tijdens het bloedstadium van infectie op te helderen. Dit is een in vitro test die geïnfecteerde rode bloedcellen dodental door cytotoxische lymfocyten meet.

In vitro Bepaling van plasmodium-geïnfecteerde rode bloedceldoding door cytotoxische lymfocyten

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

Leer een gestandaardiseerd protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde klontvorming van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde erytrocyten. Deze methode is specifiek ontwikkeld voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen.

A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van Plasmodium falciparum-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource (Video) | JoVE Journal

A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van

Meer video's verkennen