A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van Plasmodium falciparum-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource

Deze procedure biedt enkele gestandaardiseerde richtlijnen voor het uitvoeren van assays voor door bloedplaatjes gemedieerde klontering van klinische of laboratoriumisolaten van Plasmodium falciparum. Verzamel eerst bloed van een geïnfecteerde patiënt en oogst de geparasiteerde erytrocyten door centrifugatie, om vervolgens de asexuele volwassen stadia te kweken en te zuiveren. Verzamel daarna bloed van een gezonde donor om het plaatjesrijk plasma door centrifugatie voor te bereiden en te standaardiseren.

Combine zowel de bloedplaatjes als de geparasiteerde erytrocyten voor de klonteringsassay. Resultaten van immunofluorescentiemicroscopie kunnen aantonen dat P. falciparum-klonters worden gemedieerd door bloedplaatjes. Deze techniek is specifiek ontworpen om het klonteringsfenotype van Plasmodium sp. te meten.

Klinische isolaten in een omgeving met beperkte middelen. Er is gerapporteerd dat minimale variaties in procedures de uitkomst van de clumping acid-test in het veld kunnen beïnvloeden. Daarom was een helder en eenvoudig te volgen protocol nodig, aangepast aan omgevingen met beperkte middelen, om standaardisatie over malaria-endemische veldlocaties te waarborgen. Verzamel in een natriumcitraat-vacutainer ongeveer five milliliters volbloed van een gastheer zonder eerdere malaria-infectie of 2.5 milliliters bloed van patiënten met CM- of SM-malaria.

Centrifugeer het volbloed bij 250 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Draag vervolgens het troebele supernatant voorzichtig over naar een schone buis van 15 milliliter. Houd er rekening mee dat bloedplaatjes gemakkelijk worden geactiveerd door temperatuurvariaties en fysieke schokken.

Tel de PRP-suspensie met behulp van een hemocytometer van Neubauer en pas de gewenste concentratie aan met PBS om bloedplaatjesarm plasma te verkrijgen; verkrijg het grootste deel van de bloedplaatjes uit een deel van de PRP-fractie door centrifugatie bij 1500 g gedurende 10 minuten. Bewaar de PRP- en PPP-fracties bij vier graden Celsius gedurende maximaal acht tot 10 dagen. Gebruik bij voorkeur verse bloedplaatjes voor de clumping-assay.

Was de gepelde perifere rode bloedcellen drie keer met 5 tot 10 milliliters RPMI 1640 in een kweekfles. Vul de PRBC aan met standaard malariakweekmedium en verse niet-geïnfecteerde rode bloedcellen om een hematocriet van 5% te bereiken. Permeer de kweekflessen met een mengsel van 92,5% stikstof, 2,5% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Sluit ze vervolgens af en kweek ze voor rijpe parasieten uit patiënten-pbcs.

Incubeer de kweekfles gedurende 24 tot 36 uur in een incubator op 37 °C bij 5% CO2. Breng ongeveer 10 tot 15 µL bloed aan op één uiteinde van een matglasplaatje dat op een vlak oppervlak rust. Raak de bloeddruppel aan met de rand van een tweede objectglas terwijl u dit tweede objectglas in een hoek van 45 graden houdt, totdat het bloed gelijkmatig over de rand van het tweede objectglas is verspreid.

Verspreid het bloed snel maar voorzichtig gelijkmatig over het eerste objectglas, zonder te veel druk uit te oefenen. Laat de dunne bloedfilm vervolgens aan de lucht drogen en dehydrateer het monstergebied gedurende 10 seconden met methanol. Laat dit opnieuw aan de lucht drogen en dompel het monster vervolgens onder in 2% keem.

Laat dit gedurende ten minste 10 minuten inwerken. Spoel grondig na totdat het water helder is en laat aan de lucht drogen. Bekijk de monsters onder een 100 x olie-emmersilens op een lichtmicroscoop.

Zuiver en synchroniseer vervolgens de rijpe PFS parum PRBC zoals beschreven in het tekstprotocol. Draag de cultuur over naar een schone, steriele buis van 15 milliliter. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij kamertemperatuur bij 370 GS gedurende vijf minuten.

Aspirer nu voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de cellen zodanig dat de helft van het totale volume bestaat uit jello fusing. Van de tweede helft is één derde proteïnevrij medium en twee derde pbcs.

Breng de suspensie over naar een steriele buis van 15 milliliter en incubeer deze gedurende 15 tot 20 minuten in een incubator bij 37 degrees Celsius totdat er een duidelijke scheiding ontstaat tussen de bovenste en onderste lagen. Breng de bovenste laag voorzichtig over naar een nieuwe steriele buis van 15 milliliter, voeg 10 milliliters vers RPMI toe en centrifugeer bij 370 to 430 GS gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.

Beoordeel nu de parasitemie en het ontwikkelingsstadium met een dun bloeduitstrijkje en onderzoek dit onder een lichtmicroscoop zoals eerder beschreven. Pas de P RBC-suspensie die is verkregen na plasmagel-flotatie aan naar 1 × 10⁸ P RBCs per µL in een nieuwe 1,5 mL buis. We suspenderen de RBCs bij een hematocriet van 5% in acridine oranje of ethidiumbromide met een eindconcentratie van 20 µg/mL en PRP tot 10% van het totale volume.

Bereid op soortgelijke wijze de volgende controles voor: niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en PRP en PRBC met PPP om de rol van bloedplaatjes bij de klontering van de PBC vast te stellen. Draag de suspensie vervolgens over naar een schroefdopbuisje van twee milliliter. Plaats het buisje onder zachte agitatie door te rollen bij 10 tot 12 RRP bij kamertemperatuur, waarbij op intervallen van 15 tot 20 minuten monsters worden genomen gedurende in totaal 120 minuten om de vorming van klonters te controleren.

Pipetteer 10 µL van het monster op een glazen objectglas en dek dit af met een decentglas om het onder fluorescentie te bestuderen. Een klont wordt beschouwd als een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. In dit experiment werden ongeveer 70% van de mature stadia van p FALs parem geanalyseerd na verrijking door plasmagel-flotatie. Klonten zijn onder de microscoop gemakkelijk te herkennen, zowel onder normaal licht als onder fluorescentie. Ze verschijnen als celaggregaten en onder fluorescentie als groene of rode stippen.

Wanneer respectievelijk gekleurd met acridine oranje of ethidiumbromide, neemt de grootte van de clusters aanzienlijk toe tot een gemiddelde van meer dan 15 pbc's per cluster na incubatie gedurende 120 minuten, waarbij sommige clusters talrijke pbc's per cluster bevatten die visueel niet konden worden geteld. De frequentie van het clusterfenotype wordt berekend als het aantal geïnfecteerde cellen dat in clusters aanwezig is per 1000 geïnfecteerde cellen, geteld in dubbele assays.

Na het bekijken van deze video zou u nu een duidelijk inzicht hebben in het uitvoeren van een assay voor plaatjes-gemedieerde klontering van Plasmodium falciparum. Wees voorzichtig om de bloedplaatjes niet te activeren door schokkerige bewegingen en temperatuurvariaties. Deze assay kan ook worden toegepast om de plaatjes-gemedieerde klonteringsassay bij ernstige malaria te meten.