Het gebruik van Time lapse microscopie om Anoxie-geïnduceerde Suspended Animation Visualiseer in

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een in vivo techniek om subcellulaire dynamiek in embryo's van C. elegans te beelden die zijn blootgesteld aan anoxie, met behulp van een gasstroomopstelling op een krachtige microscoop. Dit wordt bereikt door eerst een monster van jonge volwassen transgene dieren voor te bereiden om een geschikte populatie jonge embryo's voor beeldvorming te genereren. Bereid vervolgens dunne agarose-pads op objectglazen voor gebruik in de micro-incubatiekamer.

Vervolgens worden de zee-eleganties adequaat geanestheseerd en bedekt met halokoolstofolie om uitdroging te voorkomen bij blootstelling aan de gasstroom. Ten slotte wordt het ronde dekglas met de geanestheseerde dieren in de micro-incubatiekamer geplaatst. De kamer wordt daarna op de microscooptafel geplaatst en gevuld met stikstofgas om een anoxische omgeving te creëren tijdens de beeldvorming, waarbij uiteindelijk gebruik wordt gemaakt van een gasstroom door de micro-incubatiekamer.

In combinatie met in vivo fluorescentiemicroscopie maakt dit methode gedetailleerde video's en beelden met een hoge resolutie mogelijk van celcyclusarrest als reactie op anoxie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals indirecte immunofluorescentie, is dat subcellulaire veranderingen in vivo gedocumenteerd kunnen worden terwijl dieren worden blootgesteld aan specifieke condities. Deze methode kan inzicht bieden in anoxie-geïnduceerde schijndood in elegans-embryo's.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals gist, celculturen of andere kleine ongewervelde of gewervelde embryo's. Aanvullende condities zoals hyperoxie, temperatuur, stress of behandeling met kleine moleculen kunnen ook worden toegepast. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Anastacia Garcia en Mary Latt, twee promovendi uit mijn laboratorium. Begin met een geschikte transgene C. elegans-stam van belang; in deze studie zal de transgene stam TH 32 worden gebruikt om chromosomen en centrosomen te visualiseren als markers voor celdeling.

Genereer een gesynchroniseerde populatie door gravity-volwassenen te desintegreren in een hypochlorietoplossing en gebruik de resterende embryo's door gravity-volwassenen op een gezaaide plaat te plaatsen en één tot twee uur eieren te laten leggen, of door L4-larven uit een gemengde populatie over te brengen naar een nieuwe gezaaide plaat. Kweek de nematoden bij 20 °C tot de vroege volwassen fase, wat ongeveer 96 uur na het uitkomen, 72 uur vanaf L1-larven, of 24 uur na de L4-rui in beslag neemt. Deze methodologie biedt een manier om een populatie van jonge volwassenen te genereren die een overvloedig aantal jonge embryo's bevatten, welke grote blastomeren en kernen bevatten die optimaal zijn voor het in beeld brengen van subcellulaire en subnucleaire veranderingen.

Om een bevochtigingskamer in te richten voor de geprepareerde objectglazen, plaatst u een vochtig vel keukenpapier in een grote Petrischaal of bak die is afgesloten met een passend deksel. Bereid gesmolten 2%aros in gedeïoniseerd water door het mengsel in glaswerk te verhitten via een magnetron of waterbad. Plaats vervolgens één tot drie druppels warme aros op een schoon glazen objectglas; plaats onmiddellijk een tweede objectglas omgekeerd en loodrecht bovenop de aros-druppels en druk licht aan, zodat het resulterende laagje dun is en vrij van luchtbellen.

Nadat de aros langzaam is afgekoeld, worden de twee objectglazen uit elkaar gehaald, waarbij de aros-pad intact blijft op een van de glaasjes. Het is belangrijk om te controleren of de aros-pad dun genoeg is om de focusmogelijkheid van de microscoop niet te belemmeren. Gebruik vervolgens een schoon scheermesje om de aros-pad in een klein vierkantje te snijden.

Bewaar de objectglazen in de voorbereide bevochtigingskamer tot aan het gebruik. Gebruik hetzelfde schone scheermesje om voorzichtig de rand van het aros-kussen te pakken en deze van het objectglas over te brengen naar een rond micro-dekglaasje van 25 millimeter. Vermijd de vorming van luchtbellen onder het ronde dekglaasje; het glas moet goed passen in de micro-incubator.

Voeg een druppel anestheticum toe aan het aros-kussen. Selecteer vijf tot 10 wormen en plaats deze in de druppel anestheticum. Laat de wormen één tot drie minuten rusten totdat ze stoppen met bewegen.

Voeg met een pipetpunt een druppel hallow carbon oil toe bovenop de wormen om uitdroging van de wormen te voorkomen terwijl er gas door de kamer stroomt. Sluit vervolgens één uiteinde van de flexibele plastic slang aan op de kamer. Scheid de twee helften van de gesloten perfusie-micro-incubator en plaats het dekglas voorzichtig rechtop op de onderste ring.

Sluit de twee zijden van de kamer stevig op elkaar aan. Verbind de kamer vervolgens via de flexibele plastic slang met de stikstoftank en plaats deze op de objecttafel van de microscoop. Controleer op lekken door te bevestigen dat de slang en de poortpluggen aan de zijkant van de kamer stevig vastzitten om de embryo's te kunnen beeldvormen.

Lokaliseer eerst de dieren bij een lagere vergroting. Ga vervolgens over naar de juiste hogere vergroting. Om embryonale blasphemers in volwassenen af te beelden, gebruikt u de 488 nanometer laser om het GFP-fusie-eiwit in de cellen van belang te lokaliseren.

Om een specifiek stadium van celcyclusarrest te visualiseren, bijvoorbeeld de late profase, identificeer dan een blastomeer in een eerder stadium van de celdeling, zoals de late interfase of vroege profase. Perfuseer de kamer met stikstofgas en blijf de blastomeren monitoren terwijl de stikstof de kamer vult, waarbij het brandvlak indien nodig wordt aangepast. Voer time-lapse imaging uit om het gewenste fenomeen van belang in dit geval vast te leggen.

Profase-arrest en docking van chromosomen aan het binnenste kernmembraan. Neem elke 10 seconden beelden gedurende maximaal 30 minuten. Meestal treedt anoxie-geïnduceerd profase-arrest op binnen 20 tot 30 minuten na het begin van de stikstofgasstroom.

Om het herstel van de door anoxie geïnduceerde arresteerde toestand te documenteren, schakelt u het gas uit en laat u de kamer terugkeren naar normoxie terwijl u een time-lapse serie opneemt. De hervatting van de celcyclus en het ontwarren van de chromosomen vindt doorgaans plaats binnen vijf tot 20 minuten. Gebruik Erris Image J of Photoshop om beelden en video's te verwerken en importeer deze vervolgens in QuickTime voor weergave.

Binnen het embryo dat aan anoxie is blootgesteld, condenseren de chromosomen van de profase en lijnen zij zich uit langs de binnenste kernperiferie. Dit fenomeen wordt chromosoomdocking genoemd; bij reoxygenatie zal de progressie van de celcyclus hervatten en de chromosomen van de profase.

Blasphemy zal zich verplaatsen van de nucleaire periferie naar de equatoriale plaat, wat duidt op de progressie naar de metafase. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vier uur worden uitgevoerd met behulp van dieren in het juiste stadium. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er alleen gezonde jonge volwassen dieren worden gebruikt om voldoende tijd vrij te maken voor het voltooien van het experiment, en om geduldig te zijn bij het leren selecteren van blasphemers in het juiste stadium.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe anoxie-geïnduceerde subcellulaire gebeurtenissen in vivo kunnen worden vastgelegd met behulp van GaN-embryo's en een gasstroomkamer op een krachtige microscoop.