Het gebruik van Time lapse microscopie om Anoxie-geïnduceerde Suspended Animation Visualiseer in C. elegans Embryo's
December 3rd, 2012
Hier beschreven wordt een In vivo Techniek image subcellulaire structuren dieren blootgesteld aan anoxie met een gasstroom door microincubation kamer in combinatie met een draaiende schijf confocale microscoop. Deze methode is eenvoudig en flexibel genoeg om een aantal experimentele parameters en modelsystemen passen.
Het algemene doel van deze procedure is om een in vivo-techniek te beschrijven om subcellulaire dynamica in zee-elegantie-embryo's te beeldvormen die zijn blootgesteld aan anoxie met behulp van een gasstroom door een opstelling op een krachtige microscoop. Dit wordt bereikt door eerst een monster van jonge volwassen transgene dieren voor te bereiden om een geschikte populatie jonge embryo's voor beeldvorming te genereren. Vervolgens worden dunne agros-pad-glazenschijfjes voorbereid voor gebruik in de micro-incubatiekamer.
Vervolgens worden de zee-elegantie goed verdoofd en bedekt met halo-koolstof olie om uitdroging te voorkomen wanneer ze worden blootgesteld aan de gasstroom. Ten slotte wordt het ronde dekglas met de verdoofde dieren in de micro-incubatiekamer geplaatst. De kamer wordt vervolgens op het microscoopplatform geplaatst en gevuld met stikstofgas om een anoxische omgeving te creëren tijdens het beeldvormen, uiteindelijk gebruikmakend van een gasstroom door micro-incubatiekamer.
In combinatie met in vivo-fluorescentiemicroscopie maakt dit mogelijk hoge resolutie gedetailleerde video's en afbeeldingen van celcyclusstilstand als reactie op anoxie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals indirecte immunofluorescentie, is dat subcellulaire veranderingen in vivo kunnen worden gedocumenteerd terwijl dieren worden blootgesteld aan specifieke omstandigheden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in door anoxie geïnduceerde opgeschorte animatie in elegans-embryo's.
Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals gist, celcultuur of andere kleine ongewervelde of gewervelde embryo's. Aanvullende omstandigheden zoals hyperoxische temperatuur, stress of behandeling met kleine moleculen kunnen ook worden toegepast. Het demonstreren van deze procedure is Anastacia Garcia en Mary Latt twee afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium Begin met een geschikte transgene C Elgan-stam van belang in dit onderzoek, de TH 32 transgene stam zal worden gebruikt om chromosomen en centrosomen als markeringen voor celdeling te visualiseren.
Genereer een gesynchroniseerde populatie door volwassen dieren door zwaartekracht in hypochlorietoplossing te desintegreren en gebruik resterende embryo's door volwassen dieren door zwaartekracht op een geïncubeerde plaat en ei te leggen gedurende één tot twee uur, of het plukken van L vier larven uit een gemengde populatie op een nieuwe geïncubeerde plaat. Laat nematoden groeien bij 20 graden Celsius tot GR jonge volwassenheid, wat ongeveer 96 uur na het uitkomen zal duren, 72 uur na L een larven of 24 uur na L vier vervelling. Deze methodologie biedt een manier om een populatie van jonge volwassenen te genereren die een overvloed aan jonge embryo's bevatten, die grote blasphemers en kernen bevatten die optimaal zijn voor beeldvorming van subcellulaire en subnucleaire veranderingen.
Om een vochtige kamer op te zetten om voorbereide glijmiddelen vast te houden, plaats een vochtige papieren handdoek in een grote petrischaal of bak bedekt met een deksel van voldoende grootte. Bereid gesmolten 2% aros in gedeïoniseerd water voor door de mix in glaswerk te verwarmen via een magnetron of waterbad. Plaats vervolgens één tot drie druppels warme aros op een schone glazen microscoopglazenschijf en plaats onmiddellijk een tweede schuif ondersteboven bovenop de aros-druppels en druk lichtjes zodat de resulterende pad dun en vrij van luchtbellen zal zijn.
Nadat de aros langzaam is afgekoeld, neem langzaam de twee microscoopglazenschijfjes uit elkaar, waarbij de aros-pad intact blijft op een van de schijven. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de aros-pad dun genoeg is om de scherpstelling van de microscoop niet te belemmeren. Later. Gebruik een schone scheermesjes om de Aros-pad in een klein vierkant te vormen.
Schijfjes in de voorbereide vochtige kamer totdat ze klaar zijn om te worden gebruikt. Gebruik dezelfde schone scheermesjes om voorzichtig de rand van de aros-pad te nemen en deze van de schuif over te brengen op een rond 25 millimeter microdekglas. Vermijd de ophoping van luchtbellen onder het ronde dekglas, het glas moet passend passen in de micro-incubator.
Voeg een druppel verdoving toe aan de aros-pad. Pak vijf tot tien wormen en plaats ze in de druppel verdoving. Laat een tot drie minuten verstrijken totdat de wormen geen beweging meer vertonen.
Gebruik een pipettip om een druppel halo-koolstof olie op de wormen toe te voegen om de wormen tegen uitdroging te beschermen terwijl gas door de kamer stroomt. Verbind vervolgens een uiteinde van de flexibele plastic buis met de kamer. Scheid de twee helften van de gesloten micro-incubator en plaats het dekglas rechtop op de onderste ring.
Sluit de twee zijden van de kamer stevig op elkaar. Verbind vervolgens de kamer via de flexibele plastic buis met de stikstofgastank en plaats deze op het microscoopplatform. Controleer op lekken door ervoor te zorgen dat de buis en poortpluggen langs de zijkant van de kamer stevig zijn bevestigd om embryo's te beeldvormen.
Loceert eerst dieren bij lage vergroting. Ga vervolgens naar de juiste hogere vergroting. Om embryonale blasphemers in volwassenen te beeldvormen, gebruikt u de 488 nanometer laser om het GFP-fusie-eiwit in de cellen van belang te lokaliseren.
Om een specifiek stadium van celcyclusstilstand te visualiseren, bijvoorbeeld late profase, identificeert u een blasphemer in een eerdere fase van celdeling, zoals late interfase of vroege profase. Perfuseer de kamer met stikstofgas en blijf de blasphemers controleren terwijl de stikstof de kamer vult, waarbij u het brandvlak indien nodig aanpast. Voer time-lapse-beeldvorming uit om het gewenste fenomeen van belang in dit geval vast te leggen.
Profasestilstand en aankoppeling van chromosomen aan het binnenste nucleaire membraan. Neem om de 10 seconden een afbeelding gedurende maximaal 30 minuten. Typisch treedt anoxie-geïnduceerde profasestilstand op binnen 20 tot 30 minuten na het begin van de stikstofgasstroom.
Om herstel van de door anoxie geïnduceerde stilstand
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een in vivo techniek om subcellulaire dynamica in zee-egels embryo's te beeldhouwen die zijn blootgesteld aan anoxie. De methode maakt gebruik van een gasstroom door een micro-incubatiekamer in combinatie met een krachtige spinning disc confocale microscoop.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Subcellulaire beeldvorming is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire reacties op omgevingsstress.
- Anoxie kan de cellulaire dynamica en levensvatbaarheid aanzienlijk beïnvloeden.
- Zee-egels dienen als modelorganisme voor ontwikkelingsbiologie studies.
- Hogeresolutie beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor het observeren van dynamische processen in levende exemplaren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het beeldhouwen van subcellulaire structuren in levende embryo's onder anoxische omstandigheden.
- Om het begrip van cellulaire reacties op zuurstofgebrek te verbeteren.
- Om een flexibele beeldvormingstechniek te bieden die geschikt is voor verschillende experimentele opstellingen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van jonge volwassen transgene zee-egels om embryo's te genereren.
- Gebruik van dunne agar pad slides in een micro-incubatiekamer.
- Anesthetisatie van zee-egels met halo koolstof olie om uitdroging te voorkomen.
- Beeldvorming met een spinning disc confocale microscoop onder stikstofgasstroom om een anoxische omgeving te creëren.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt real-time beeldvorming van subcellulaire dynamica in embryo's mogelijk.
- Succesvolle handhaving van anoxische omstandigheden tijdens beeldvorming.
- Aangetoonde flexibiliteit voor verschillende experimentele parameters.
- Biedt inzichten in de effecten van anoxie op cellulaire processen.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire reacties op anoxie.
- Het kan worden aangepast voor verschillende modelsystemen en experimentele omstandigheden.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van subcellulaire dynamica onder stressomstandigheden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This technique enables real-time visualization of subcellular dynamics in live embryos under controlled anoxic conditions, providing mechanistic insights into stress-induced cell cycle arrest. By capturing reversible prophase arrest and chromosome docking in C. elegans, it supports target validation in pathways governing suspended animation and metabolic dormancy. The approach offers a disease-relevant system for probing oxygen-sensing mechanisms with predictive confidence in preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing anoxia-induced cell cycle arrest in vivo, clarifying pathway dynamics in oxygen deprivation.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of subcellular changes without fixation artifacts.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking anoxia exposure to quantifiable cell cycle progression metrics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems using GFP-tagged reporters for standardized, reproducible imaging of cell division dynamics.
- Quantitative Outputs: Generates time-lapse data enabling measurement of arrest onset, duration, and recovery kinetics under defined oxygen gradients.
- Platform Scalability: Adapts to high-content screening workflows for small molecules or genetic modifiers affecting stress response pathways.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models ischemia-reperfusion injury and hypoxic stress in developmental contexts, aligning with translational biomarker discovery.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by monitoring conserved cellular responses to anoxia across model systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on reversible phenotypic arrest and recovery thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live-cell imaging data that informs target engagement and pathway modulation studies prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-sensing pathways through direct visualization of cell cycle arrest and recovery in embryos.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative readouts on mitotic progression, enabling compound screening for modulators of suspended animation.
- Analytics: Provides time-resolved measurements of prophase arrest duration and chromosome dynamics, facilitating comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by modeling hypoxic stress responses relevant to ischemia, stroke, and metabolic disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to yeast, vertebrate embryos, and cell culture systems under varied stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanistic links between anoxia and cell cycle regulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled gas flow and environmental chamber design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of cytotoxic or cytostatic effects in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds targeting hypoxia-inducible factor (HIF) pathways or mitochondrial stress responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic strain handling, embryo preparation, and live-cell fluorescence microscopy.
- Dependent on spinning disc confocal microscopy, gas flow control systems, and environmental chamber maintenance.
- Necessitates standardization of anoxia exposure timing, temperature control, and recovery protocols across teams.
- Involves adaptation considerations for different model systems, including embryo staging and reporter compatibility.
- Limited by the need for oxygen-tolerant fluorescent tags and potential phototoxicity during prolonged time-lapse acquisition.
