Een

Het algemene doel van deze procedure is het registreren van de elektrische activiteit van de zenuwen, spieren en neuronen, en de overeenkomstige bewegingen van het voedingsapparaat tijdens voedingsmotorische programma's. Dit wordt bereikt door eerst de buccale massa te verwijderen uit een geanestheseerde plegia en haakelektroden te bevestigen aan cruciale zenuwen en spieren. De tweede stap is het plaatsen van de buccale massa in een registreschaal en het voorbereiden van de ganglia voor extracellulaire registratie.

Vervolgens worden de doelneuronen gelokaliseerd met behulp van extracellulaire elektroden. De laatste stap is het induceren en registreren van voedingsmotorische programma's, zoals bijten, slikken en afstoten. Uiteindelijk wordt de gesuspendeerde preparatie van de buccale massa gebruikt om de activiteit van zenuwen, spieren en individuele neuronen aan te tonen tijdens verschillende voedingsachtige bewegingen van de buccale massa.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals studies met geïsoleerde ganglia, is dat registraties van zenuwen, spieren en individuele neuronen direct kunnen worden gerelateerd aan de bewegingen van het voedingsapparaat. Huu, een promovendus uit ons laboratorium, zal helpen bij het demonstreren van de procedure. Om met de procedure te beginnen, wordt een gezonde plegia van 200 tot 300 gram in een dissectieschaal geanestheseerd door ongeveer 50% van het lichaamsgewicht aan isotoon magnesiumchloride te injecteren. Masseer na de eerste injectie nabij de staart van het dier voorzichtig het oppervlak van het dier om het magnesiumchloride te verspreiden.

Geef naar behoefte extra injecties nabij de kop van het dier. Nadat het dier niet meer reageert op zachte tactiele stimuli, wordt het met de dorsale zijde naar boven op de plaat vastgepind. Plaats één pin in de staart en één pin in elke anterieure tentakel.

Gebruik vervolgens de pincet om de huid van het dier in het midden van de kop samen te knijpen en op te tillen. Maak achter de rhino-vieren een coronale incisie over de kop van het dier, net achter het punt dat wordt vastgehouden. Maak daarna een midsagittale incisie tussen de rhino-vieren in de richting van de mond om de buccale massa bloot te leggen.

Trek vervolgens de huidflap weg van de buccale massa en snijd door de zenuwen en het bindweefsel dat aan de lichaamswand vastzit. Om deze huidflap volledig van de buccale massa te scheiden, moet u ervoor zorgen dat u geen zenuwen of weefsels doorsnijdt die intrinsiek zijn aan de buccale massa. Pak daarna de slokdarm vast en houd deze vast.

Snijd door de slokdarm posterior aan het punt dat wordt vastgehouden. Trek de slokdarm omhoog en til de buccale massa achter de buccale massa op. De cerebrale, plurale en pedale ganglia vormen een ring, waarbij het cerebrale ganglion via de cerebro-buccale connectieven is verbonden met de buccale ganglia.

Laat deze ringganglia bevestigd blijven aan de buccale massa en knip alle zenuwen door die vanuit deze ganglia naar andere delen van het lichaam lopen. Snijd vervolgens door het bindweefsel rond de buccale massa en blijf de buccale massa optillen naarmate deze minder sterk met het lichaam verbonden is. Zodra de buccale massa alleen nog met de mond verbonden is, houdt u de slokdarm en de buccale massa vast.

Snijd rechtuit. Maak een laatste snede net anterieur van de kaken om de buccale massa van het lichaam te scheiden. Plaats de buccale massa in een oplossing van 50% isotone magnesiumchloride-oplossing en 50% SIA-zoutoplossing om een gedeeltelijke anesthesie te handhaven terwijl de elektroden worden bevestigd.

Plaats vervolgens de buccale massa met de oplossing in een Petrischaal met sigaarvormige bodem, waarbij er door de buccale arterie aan het ventrale oppervlak van de buccale massa wordt gesneden. Verwijder daarna de pleurale en pedale ganglia door hun verbindingen met het cerebrale ganglion door te snijden. Laat het cerebrale ganglion via de CBC's verbonden met de buccale ganglia en de buccale massa, en verbreek andere verbindingen tussen het cerebrale ganglion en de buccale massa.

Trim de slokdarm en speekselklieren tot korte lengtes. Bevestig in deze stap de haakelektroden aan het oog van de ular-zenuw, aan spier-buccale zenuwen twee en drie, en aan tak A van buccale zenuw twee. Gebruik hiervoor een procedure die vergelijkbaar is met die in de JoVE-publicatie van Collins en Shield, welke hier kort wordt samengevat.

Positioneer bij elke elektrodeplaatsing de elektrode nabij de zenuw of spier, plaats de doelnerv in de haak en til deze voorzichtig op met een manipulator. Droog vervolgens het zenuwsegment met een Kim wipe. Breng een druppel quick gel secondelijm aan op de in de haak geplaatste zenuw; zorg ervoor dat de haak volledig met lijm is bedekt en dat de tip van het referentiedraadje niet met lijm is bedekt.

Gebruik vervolgens een spuit met een polyethyleen slangetje om de oplossing vanuit de schaal op de lijm aan te brengen, waardoor het oppervlak van de lijm zal uitharden. De volgende stap is het voorbereiden van een ronde Pyrex opnameschaal van 100 bij 50 millimeter om als opnamekamer te gebruiken; breng met een pipetpunt een dunne laag vacuümvet aan in de inkeping tussen de cerebrale en gebogen kamers om lekkage te minimaliseren. Vul vervolgens de voorste kamer met een plescia-zoutoplossing.

Breng de buccale massa voorzichtig over van de Petrischaal naar de voorste kamer van de ronde Pyrex-schaal, en zorg ervoor dat geen van de elektroden strak worden getrokken, aangezien dit de zenuwen kan beschadigen. Wees zeer voorzichtig met de haakelektroden als de schaal moet worden overgeplaatst naar een andere binoculaire dissectiemicroscoop. Voor het dunner maken van de schede.

Groepeer de elektroden aan weerszijden van de buccale massa. Houd de elektroden voorzichtig vast door de laboratoriumtape te grijpen die de connectorpinnen bedekt, en zorg er opnieuw voor dat geen van de elektroden strak wordt getrokken. Wanneer de schaal onder de microscoop is geplaatst, moeten de elektroden voorzichtig over de randen van de schaal gedrapeerd zijn en op het platform rusten tijdens pauzes en tussen de fasen van het experiment; belucht de zoutoplossing in de kamer van de buccale massa met behulp van een aquariumluchtsteen.

Zet vervolgens het cerebrale ganglion in de achterkamer vast, waarbij de CBC's door de inkeping lopen. Breng meer vacuümvet aan over de CBC's. Voeg daarna meer SIA-zoutoplossing toe aan beide delen van de schaal, zodat de ganglia volledig ondergedompeld zijn.

Zorg ervoor dat het zoutgehalte lager is dan de hoogte van het vacuümvet tussen de cerebrale en buccale kamers, zodat er geen lekkage tussen de kamers optreedt. Op dit punt moet de buccale massa op de bodem van de voorste kamer rusten. Zet vervolgens de buccale ganglia vast op het middelste platform om beschadiging van de zenuwen die nog aan de buccale massa vastzitten te voorkomen.

Plaats pinnen uitsluitend op de schede tussen twee zenuwen. Voeg vervolgens twee extra pinnen toe aan de zijkant van de CBC's om deze uit te rekken en te verankeren. Houd de buccale ganglia plat of gedraaid, afhankelijk van de locatie van de neuronen van belang.

Om het buccale ganglion te roteren, gebruikt u een fijne pincet om een deel van het overtollige omhulsel van de CBC vast te pakken en dit vast te pinnen tussen buccale zenuw twee en buccale zenuw drie. Op deze manier kunnen de meeste cellichamen die zich dicht bij de achterkamer bevinden en van bovenaf niet gemakkelijk bereikbaar zijn, nu worden waargenomen. Plaats tot slot twee pinnen in het omhulsel van het buccale ganglion aan de zijde van de buccale massa.

Om de beweging van het buccaal ganglion te minimaliseren, pakt u de schede van het buccaal ganglion aan bij de achterkamer en knipt u het overtollige scheidingsweefsel weg met een fijne schaar, zonder de cellichamen bloot te leggen. Om schade te minimaliseren, verwijdert u pas de hoeveelheid schede die nodig is om de cellichamen te kunnen zien nadat het dunner maken van de schede is voltooid. Bevestig alle elektrodepinnen in de sockets van de kabels die verbonden zijn met de versterkers.

Zorg ervoor dat de elektroden niet strak gespannen staan, correct zijn aangesloten op de bijbehorende kabels en dat de polariteiten juist zijn om alle resterende magnesiumchloride uit te spoelen. Vervang de SIA-zoutoplossing in de buccale massakamer door verse SIA-zoutoplossing. Rijg vervolgens een zijden hechtdraad door het zachte weefsel aan de voorzijde van de buccale massa en dorsaal van het kaakkraakbeen.

Gebruik twee stukjes boetseerklei om de hechting aan de rand van de schaal te bevestigen, zodat de buccale massa vanuit de anterieure eindpositie wordt opgehangen. Gebruik een manipulator om een glazen extracellulaire elektrode vast te houden, zodanig dat de elektrodepunt zich nabij het buccale ganglion bevindt. Om een neuron te lokaliseren en te identificeren, laat u de punt van de extracellulaire elektrode voorzichtig op de schede zakken.

Over het soma van het neuron. Breng een stimulerende stroom aan en schakel vervolgens het kanaal dat wordt gebruikt om het soma te exciteren over naar de registratiemodus om de activiteit op de extracellulaire elektrode en de corresponderende activiteit op de zenuwen vast te leggen om afstoting op te wekken. Stimuleer, zoals bij motorische programma's, de buccale zenuw 2A met een lange reeks pulsen van 2 Hz en 1 ms om EES-patronen te genereren.

De patronen houden aan gedurende de stimulatie en kunnen voortduren tot kort nadat de stimulatie is beëindigd. Om bijt-achtige motorische programma's op te wekken, plaatst u enkele kristallen vaste caracol direct op het cerebrale ganglion.

Repetitieve patronen beginnen over het algemeen binnen vijf minuten en duren ongeveer 10 tot 15 minuten voordat ze afnemen om slikken te induceren. Pas, net als bij motorische programma's, caracol toe en wacht tot de buccale massa krachtige happen genereert. Plaats vervolgens tijdens een hap een strip zeewier in de mond van het dier, zodat het het zeewier vastgrijpt.

Hier zijn de stimulatie en registratie van het geïdentificeerde motorneuron B nine en de registratie van hetzelfde neuron, de I two spier, en verschillende zenuwen tijdens voedingsmotorische programma's. Hier zijn de videobeelden genomen uit dezelfde reeks motorische programma's. Slikpatronen werden geïnduceerd door toediening van carbachol aan het cerebrale ganglion en de daaropvolgende plaatsing van een strook zeewier in de grijper tijdens door carbachol geïnduceerd bijten.

Op deze afbeelding is de ragula uitgestrekt om het zeewier vast te grijpen, en op deze afbeelding is de ragula ingetrokken, waardoor het zeewier de mond in wordt getrokken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het opzetten van de preparatie van de gesuspendeerde buccale massa en het verkrijgen van opnames van de in vitro voedingsmotorische programma's.