Name: Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Ontdek hoe neo-isletvorming in de lever van diabetische muizen wordt geïnduceerd via helper-afhankelijke adenovirale vectoren. Deze methode normaliseert bloedglucose en insulinespiegels effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), de Diabetes en Endocrinologie Research Center-(DERC - P30DK079638) van het Baylor College of Medicine, een Pilot &amp; Haalbaarheid subsidie ​​van de DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

HDAds zijn ontwikkeld om de zwakke eerste generatie Ad overwinnen en benutten voor gentherapie toepassing. De technische uitdagingen. Bijvoorbeeld HDAd heeft HV voor verpakking HDAd en vector amplificatie is niet zo efficiënt als eerste generatie Ad. HV is een eerste generatie Ad en verontreiniging van HV compromis de effectiviteit van HDAd. Daarom zeer efficiënte transfectie en optimale condities voor elke seriële passage kritisch. Een kritische parameter voor productie vector welke doorgang (P1-P4) worden gebruikt voor daaropvolgende passage 5, die rechtstreeks wordt gebruikt als inoculum voor suspensiecellen. Onze ervaring, worden de beste resultaten verkregen met de passage waarmee HDAd vector deel dramatisch toeneemt in de volgende passage (P3 in figuur 2). De opbrengst van HDAd vectoren afhankelijk transgene cassettes. Tijdens vectorproductie zijn beide transgenen tot expressie omdat beide genen onderalomtegenwoordige promotor. Ngn3 is een transcriptiefactor en Btc is een groeifactor, die deze HDAd vector die transcriptiefactor die van invloed kunnen cellijn remt vector amplificatie terwijl die expressie groeihormoon helpt in vector replicatie en verpakking suggereert. Met diabetes epidemische vormen aangenomen, zijn nieuwe benaderingen van b-celmassa te herstellen dat nodig is. In dit verslag we methoden om de voordelen van HDAd vectoren benutten om genoverdracht van afstammings-eilandje definiëren transcriptiefactor, Ngn3 met het eilandje groeifactor effect te beschrijven, betacelluline op eilandje neogenese induceren in periportale gebieden van de lever. Beoordelen van de effectiviteit van deze, is het belangrijk om muizen met stabiele hyperglycemie kiezen en dat passende controles altijd voorhanden zijn. Dit gen transfer experimenten, de lege vector behandelde diabetische muizen altijd worden gebruikt. Bovendien, met behulp van HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc individueel behandeld diabetische mice dient het testen van de individuele bijdrage van deze twee genen in eilandje neogenese. Omdat onze gegevens blijkt dat Ngn3 volstaat om eilandje neogenese induceren, maar de toevoeging van de groeifactor BTC, dient voor het versterken van de leidend tot sterke inductie van eilandje neogenese. Het is ook belangrijk om te testen of de vector expressie inderdaad bereikt in het doelweefsel, de lever en ook aangetoond dat de insuline getest in het plasma van behandelde muizen niet afkomstig is van residuele eilandjes in de pancreas, van waaruit blijkt dat het pancreas eilandjes in de diabetische muizen. Samenvattend, het voordeel van de HDAd-vector voor genoverdracht ligt in de hoge kloneringscapaciteit, efficiënte transductie en langdurige genexpressie in de lever minimum chronische toxiciteit en de aard van de niet-integratie van vector genoom in de gastheer chromosoom. De primaire beperkingen zijn de complexe stappen betrokken bij de generatie en dein vivo toepassing is grotendeels beperkt tot de lever met de meest populaire Ad serotype 5. Eilandje neogenese kan worden geïnduceerd plasma insuline en glucose tolerantie in diabetische muizen volledig te herstellen door het induceren eilandje neogenese in de lever door genoverdracht van islet afstammings-definiërende transcriptiefactor, Ngn3 met het eilandje groeifactor, betacelluline. In dit rapport geven we de optimale protocol van hoge kwaliteit HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc genereren en demonstreren technieken om te induceren en eilandje neogenese beoordelen in de levers van diabetische muizen om hyperglycemie te keren. Voetnoot: De virale vectoren en de cellijnen hier beschreven zijn verkrijgbaar bij de Vector Production Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Sommige commerciële kits zijn ook beschikbaar voor het genereren van HDAd virussen (bijv. Microbix biosystems Inc.)

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> ProFectionR Mammalian Transfectie kit </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Natriumdeoxycholaat </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM poeder </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicilline streptomycine </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, graad II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocine </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Glas spinner kolven </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Glas spinner kolven </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Schuif A-Lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube optiseal poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cesiumchloride 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimale LE-80K ultracentrifuge </td></tr><tr><td> Filter </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifugebuis 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner weerhouder </td><td> Braintree wetenschappelijke, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> Insuline, muis ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Mouse C-peptide ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07.231 </td></tr><tr><td> cavia anti-insuline antilichaam </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> geit-anti-Pdx1 antilichaam </td><td> gift van Dr Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> muis anti Ngn3 antilichaam </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. van Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> muis anti Nkx6.1 antilichaam </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. van Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anti-betacelluline antilichaam </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Kleur Reagens SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Kleur Endpoint Reagent Set </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Specifieke Reagentia en apparatuur.

neo-islet vorming in de lever van muizen met diabetes door helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Type 1 diabetes wordt veroorzaakt door T-cel gemedieerde auto-immune vernietiging van de insuline producerende cellen in de pancreas. Tot nu insuline vervanging nog steeds de belangrijkste therapie, omdat eilandjestransplantatie beperkt door donor beschikbaarheid en de noodzaak van langdurige immunosuppressie. Induced eilandje neogenese door genoverdracht van Neuogenin3 (Ngn3), het eilandje lineage definiërende specifieke transcriptiefactor en betacelluline (BTC), een eilandje groeifactor heeft de potentie om type 1 diabetes te genezen. Adenovirale vectoren (Ads) zijn zeer efficiënte genoverdracht vector, maar eerste generatie Ad hebben verschillende nadelen voor in vivo gebruik. Helper-afhankelijke advertenties (HDAds) zijn de meest geavanceerde Advertenties die zijn ontwikkeld om het veiligheidsprofiel van de vroege generatie van advertenties te verbeteren en om transgene expressie 1 te verlengen. Het ontbreekt hen aan chronische toxiciteit omdat ze geen virale coderende sequenties 2-5 en behouden slechts Ad cis elements nodig vector replicatie en verpakking. Dit maakt het klonen van 36 kb genen. In dit protocol beschrijven we de methode HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc genereren en deze vectoren leveren in STZ-geïnduceerde diabetische muizen. Onze resultaten tonen aan dat co-injectie van HDAd-Ngn3 en &#39;neo eilandjes&#39; HDAd-Btc induceert in de lever en hyperglycemie keert bij diabetische muizen.

We beschrijven de lever neo-eilandje formatie in STZ (streptozotocine)-geïnduceerde diabetische muizen door genoverdracht van Neurogenin3 (Ngn3) en betacelluline (BTC) met behulp van helper-afhankelijke adenovirale vector (HDAd) en de omkering van hyperglycemie. Onze methode wordt voordelen van helper-afhankelijke adenovirale vectoren met hun zeer efficiënt in vivo transductie en langdurige genexpressie.

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Diabetes type 1 wordt veroorzaakt door T-cel-gemedieerde auto-immuunvernietiging van insulineproducerende cellen in de pancreas. Tot nu toe is insulinevervanging nog steeds de ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om neo-eilandjes in de lever van diabetische muizen te induceren via genoverdracht middels helper-afhankelijke adenovirale vectoren. Dit wordt bereikt door het genereren van helper-afhankelijke adenovirale vectoren die het eilandje-transcriptiefactor-gen neuro en de eilandje-groeifactor betalin dragen om periportale neo-eilandjesvorming in de lever te induceren; de vectoren worden vervolgens in diabetische muizen geïnjecteerd. De behandelde diabetische muizen worden vervolgens getest op de normalisatie van de bloedglucose en plasma-insuline, en op de aanwezigheid van insuline-producerende bètacellen in de lever.De resultaten van deze assays tonen aan dat hyperglykemie wordt omgekeerd bij vector-behandelde muizen als gevolg van de vorming van nieuwe eilandjes in de periportale regio's van de lever. Het voordeel van een herpa-afhankelijke adenovirale vector is een breed tropisme en een hoge chronische capaciteit. Bovendien bevat een herpa-afhankelijke adenovirale vector geen enkele adenovirale coderende regio.Daarom ontbreekt het aan chronische toxiciteit. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van diabetes, omdat de inductie van nieuwe eilandjes een effectief alternatief is voor eilandjes-transplantatie, welke wordt beperkt door een tekort aan donoren, afstoting van het transplantaat en allo-immuniteit. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat het transfectieproces lastig is vanwege de grote omvang van de vectorklasse.Om besmetting met het helpervirus te minimaliseren, moeten het amplificatie- en het zuiveringsproces zorgvuldig worden uitgevoerd. De productie van helper-afhankelijke adenovirusvectoren omvat meerdere stappen die nauwkeurig moeten worden gevolgd voor optimale resultaten. Zaai ter voorbereiding op de transfectie 800.001 16 cellen uit in elk van twee schalen van zes centimeter.Incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Na twee dagen zullen de cellen 70 tot 80% confluent zijn voor transfectie. Op de dag van de transfectie.Vervang het groeimedium door vijf milliliters vers medium en incubeer de cellen gedurende drie uur. Transfect vervolgens de cellen met 10 micrograms DNA dat codeert voor het neurogenen in drie, hierna aangeduid als drie, of een beta-cel, hierna aangeduid als BTC, met behulp van de pro perfection arm mammalian transfection kit van Promega Transfect. Was de volgende dag de cellen twee keer met telkens één milliliter groeimedium.Voeg het helpervirus toe in een concentratie van 500 vectorpartikels per cel in 0,1 milliliters PBS met calcium en magnesium. Plaats de cellen vervolgens elke 10 minuten in de incubator. Schud de schalen voorzichtig om het helpervirus gelijkmatig te verspreiden.Voeg na 60 minuten 1,5 milliliters onderhoudsmedium toe en plaats de schaaltjes gedurende 24 uur terug in de incubator. Voeg de volgende dag nogmaals één milliliter onderhoudsmedium toe. Onderzoek vervolgens de cellen met een standaard lichtmicroscoop om de cytopathische effecten te beoordelen.Geïnfecteerde cellen zullen afgerond worden en loslaten. Ga door met het incuberen van de geïnfecteerde cellen tot dag twee. Op dit punt moet meer dan 80% van de cellen cytopathische effecten vertonen.Verzamel het ruwe virale lysaat door herhaaldelijk op en neer te pipetteren en breng dit over naar een buis van vijf milliliter met het ruwe virale lysaat. Voeg 10% volume van 40% sucrose toe. Label deze buis als CVL voor ruw viraal lysaat passage nul voor lysis.Om virale deeltjes uit de cellen vrij te maken, wordt de buis met het ruwe virale lysaat drie keer bevroren en ontdooid door de buis afwisselend in een vriezer van -80 °C en een waterbad van 37 °C te plaatsen. Na de derde vries-dooi cyclus wordt het medium gebruikt om de vector verder te amplificeren, zoals beschreven in de begeleidende tekst. Het proces van vectoramplificatie levert een ruw viraal lysaat op van passage vijf of P5 van de vector.Voor grootschalige productie van helper-afhankelijke adenovirussen begint men met het drie maal ontdooien van P5 uit de vectoramplificatieprocedure, zoals eerder beschreven tijdens het ontdooiingsproces. Breng 1 16 cellen uit een spinnerfles van 3 liter over in conische flessen van 500 milliliter en centrifugeer deze bij 1000 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder na het centrifugeren al het supernatant, behalve 100 milliliter.Resuspendeer vervolgens de cellen en breng ze over naar een spinkolf van 250 milliliter. Voeg al het ruwe P5 virale lysaat toe. Voeg daarna het helpervirus toe in een hoeveelheid van 200 virale deeltjes per cel en incubeer gedurende één uur bij 37 °C bij 60 RPM.Breng na de incubatie één milliliter van de celsuspensie over naar een putje van een 12-wells plaat en breng de rest van de celsuspensie over naar een nieuwe spinnerfles van drie liter; voeg twee liter suspensiegroeimedium toe. Incubeer zowel de fles als de plaat gedurende twee dagen in een CO₂-incubator bij 60 RPM. Controleer de cellen in de plaat gedurende de volgende twee dagen op cytopathische effecten.Als de cellen in de plaat cytopathische effecten vertonen, vertonen de cellen in de spinnerfles ook cytopathische effecten. Verzamel na de incubatie de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer deze met 15 milliliters van 100 millimolar tris. HCL in een 50 milliliter buis met het label P zes.Bewaar deze buis bij -80 °C tot de zuivering. Om de vector te zuiveren, voegt u 1 mL 5% natriumdesoxycholaat toe aan de ontdooide buis met het ruwe virale lysaat van P6. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens magnesiumchloride, RNAse A en DNAse I toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Centrifugeer de buis na de incubatie 10 minuten bij 6.000 ×g. Verzamel na het centrifugeren het supernatant in een nieuwe steriele NVT 65 ultracentrifugebuis van 50 ml. Voeg 2,8 ml van een cesiumchloride-oplossing met een lage dichtheid van 1,25 g/ml toe.Voeg vervolgens met een pipet van 2 mL 2,8 mL van een CM-chloride-oplossing met een hoge dichtheid (1,41 g/mL) toe aan de buis door de pipet tegen de bodem van de buis te plaatsen en de oplossing langzaam vrij te laten. Voeg daarna met een pipet van 2 mL vijf tot zes milliliter supernatant toe als overlay. Vul de buis tot aan de hals door de pipet tegen de zijwand van de buis te plaatsen en de oplossing langzaam vrij te laten.Anders kan het inklappen tijdens centrifugatie bij hoge snelheid. Vul de buis indien nodig verder aan met 100 millimolair tris HCL. Centrifugeer vervolgens 30 minuten bij 237 000 ×g bij 10 °C.Na de ultracentrifugatie met dichtheidsgradiënt is een enkele opalente vectorband zichtbaar onder het ondoorzichtige celpuin. Soms is er een zeer zwakke helperband zichtbaar onder de meer prominente vectorband. Veeg de buis af bij de onderste opalente band met 70% ethanol.Gebruik vervolgens een spuit van drie milliliter voorzien van een naald met een gauge van 22. Puncteer de wand van de buis aan de basis van de vectorband en verzamel de onderste opalescente band. Breng het verzamelde vectormateriaal over in nieuwe gesteriliseerde ultracentrifugebuizen en voeg vervolgens cesiumchloride-dichtheidsoplossing van 1,35 g/ml toe om de buizen tot aan de hals te vullen.Centrifugegeer gedurende de nacht bij 10 °C bij 237.000 ×g. Verzamel na de tweede dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie de opalente band zoals voorheen. Breng de band over naar een dialysecassette en dialyseer deze de volgende dag gedurende de nacht tegen drie liter steriele T tris, HCl met magnesiumchloride en sucrose bij 4 °C.Om de helper-afhankelijke adenovirusvector uit de dialysecassette te verwijderen, gebruikt u een spuit van 3 mL om 2 mL lucht vanuit de bovenhoek in de cassette te injecteren. Draai de cassette om zodat de spuit en de naald zich in de onderste hoek bevinden en zuig, terwijl u de cassette rechtop houdt, de oplossing in de spuit op. Breng de oplossing, die nu het gezuiverde virus bevat, over in gelabelde cryovials. Verdeel aliquots van 20 µL voor de fysieke titer en 50 µL voor DNA-karakterisering in 1,5 mL microcentrifugebuisjes en vries deze vervolgens in. De cryobuisjes bevatten het gezuiverde virus bij -80 °C. Het gezuiverde virus moet vervolgens worden geëvalueerd op zuiverheid van de titer en in vitro-efficiëntie.Zoals beschreven in het bijbehorende document, wordt strept Odin gebruikt om diabetes op te wekken. In deze studie, zoals beschreven in het bijbehorende document, worden strept zos en behandelde muizen wekelijks gemonitord op hyperglykemie. Zodra de bloedglucose gedurende 48 uur tussen 250 and 500 mg/dL ligt, worden de muizen in de staartvenefixatie geplaatst voor een injectie in de staartvene.Plaats de staart in een buis van 50 milliliter met warm water om de staartvenen te dilateren. Reinig de staart vervolgens met een in 70%ethanol gedrenkt weefsel. Vul een spuit van één milliliter met een naald van maat 30,5 met de juiste concentratie vector en controleer of er geen luchtbellen in de spuit zitten.Pak vervolgens met de duim en wijsvinger de staart vast onder de injectieplaats en voer de naald in de staartvene in. Als de naald in de vene zit, kan er een bloedflits in de naaldhouder zichtbaar zijn. Injecteer de vector langzaam.Als de naald correct is geplaatst, zal er geen weerstand voelbaar zijn tijdens en na de injectie. Verwijder de naald en druk met gaas op de injectieplaats om eventuele bloedingen te stoppen voordat de muis terug in de kooi wordt geplaatst. Controleer na de vectorbehandeling wekelijks de glucosewaarde na zes uur vasten en het lichaamsgewicht, en monitor elke twee weken de insuline- en leverenzymspiegels.Voer zes weken na de behandeling een glucosetolerantietest uit om te bepalen of de glucose-gestimuleerde insulineafgifte in vivo is hersteld drie en zes weken na de behandeling. Neem de lever en pancreas van de muizen af voor analyse van weefsel-MNA en immunokleuring om vast te stellen of eilandjesneogenese in de lever van diabetische muizen kan worden geïnduceerd via genoverdracht door middel van een adenovirale vector. Helper-afhankelijke adenovirus H-D-A-D-N-G-N drie- en BTC-vectoren werden geprepareerd en gezuiverd zoals beschreven in deze video; de vectoren werden toegediend aan streptozotocine-geïnduceerde diabetische muizen via injectie in de staartvene.Lege vectoren en H-D-A-D-B-T-C-vectoren alleen dienden als negatieve controles. De bloedglucose werd vervolgens elke twee dagen gemonitord gedurende zeven tot 10 dagen na de injectie. Hyperglykemie werd omgekeerd bij muizen die zowel HDAD en GN three als H-D-A-D-B-T-C kregen geïnjecteerd, maar niet bij de controlemuizen.Glucose-gestimuleerde insulinesecretie werd ook gemonitord via een glucosetolerantietest die zes weken na de behandeling werd uitgevoerd, zoals hier te zien is. De insulinesecretie was hersteld bij de muizen die zowel HDAD en GN drie als H-D-A-D-B-T-C kregen geïnjecteerd om vast te stellen of de insuline in de lever was gesynthetiseerd. De C-peptide- en insulinegehaltes werden in de lever bepaald.C-peptideconcentraties en het totale insulinegehalte werden gemeten met een commerciële ELISA-kit. De aanwezigheid van peptide en insuline in molaire ratio's bevestigt dat de insuline die in de lever wordt gedetecteerd, inderdaad in de lever wordt gesynthetiseerd. Immunohistochemie toonde positieve cellen aan in de lever van muizen behandeld met HDAD, NGN three en H-D-A-D-B-T-C, maar niet in muizen behandeld met de controlevector; immunokleuring toonde daarnaast aan dat er geen resterende eilandjes aanwezig waren in de pancreas van de met NGN three BTC behandelde muizen.De expressie van lineagespecifieke transcriptiefactoren in het ooglid werd ook beoordeeld via immunokleuring van de lever. Zoals hier getoond, werd NGN3 tot expressie gebracht in de lever van NGN3 BTC-behandelde muizen, maar niet in de muizen die behandeld waren met de lege vector.Tevens werd BTC op een hoger niveau tot expressie gebracht in de lever van NGN three BTC-behandelde muizen in vergelijking met de behandeling met een lege vector, zoals hier te zien is. P DX one-immunokleuring onthulde nucleaire lokalisatie in de NGN three BTC-behandelde levers, maar niet in de levers van de muizen die met een lege vector waren behandeld. NK X 6.1 werd eveneens alleen aangetroffen in de afgenomen levers van de NGN three BTC-behandelde muizen.Samen suggereren deze resultaten een succesvolle inductie van de vorming van nieuwe oogleden in de lever van de muis. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe behulpzame adenovirale vectoren kunnen worden gegenereerd om ooglid-lijnbepalende genen naar de lever over te brengen voor het induceren van ooglidneogenese. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie weken worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het helpervirus een eerste generatie avir is die ons ondersteunt. Contaminatie moet tot een minimum worden beperkt voor in vivo toepassingen.

neo-islet-formation-liver-diabetic-mice-helper-dependent-adenoviral

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Transplantatie van geïsoleerde eilandjes is voorgesteld om een ​​potentiële behandeling voor diabetes type 1 zijn. Hier beschrijven we een methode om de eilandjes van de muis pancreata isoleren en transplantatie ze aan de subcapsulaire ruimte van de nier.

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Dit protocol maakt het mogelijk factoren te identificeren die de functionele beta cel massa moduleren om potentiële therapeutische doelen voor de behandeling van diabetes te vinden. Het protocol bestaat uit een gestroomlijnde methode om eilandje replicatie-en bèta-cel functie te beoordelen in geïsoleerde eilandjes rat na manipulatie van genexpressie met adenovirussen.

Het beoordelen van replicatie en Beta cel functie in Adenovirally-getransduceerde Geïsoleerd Rodent Eilandjes

Wij een reproduceerbare werkwijze voor type 1 diabetes (T1D) bij de muis binnen twee weken adoptieve overdracht van eilandjescellen antigeen-specifieke primaire CD4 + T-cellen.

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Dit protocol demonstreert het isoleren van muizen eiland en zaait op een decellularized steiger. Steigergesteunde eilandjes werden getransplanteerd in het epididymale vetpaneel van streptozotocine (STZ) geïnduceerde diabetische muizen. Islets overleefden op de transplantatieplaats en reverseerde de hyperglycemische conditie.

Steiger-gesteunde transplantatie van eilanden in het epididymale vetpaneel van diabetische muizen

Een methode voor de omental transplantatie van de eilandjes in een muis is ingevoerd. De geïsoleerde eilandjes met hydrogel zijn gemengd en het mengsel wordt geplaatst in de omental etui van een diabetische muis. Vervolgens de bloedglucose wordt gecontroleerd en immuno-histochemische analyse wordt uitgevoerd.

Een methode voor Islet transplantatie aan de majus in muis

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van transgenic expressie pEUI(+) enkelvoud gene schakeloptie door tebufenozide behandeling.

Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit

Alvleesklier islet transplantatie is een manier om normoglycemia bij type 1 diabetes. Dit artikel richt zich op de transplantatie-techniek via de intraportal route om normale glucoseniveaus in diabetesmuizen te handhaven.

Intraportal transplantatie van de alvleesklier eilandjes in Mouse Model

Een protocol om gengemodificeerde menselijke pseudoislets te maken van verspreide menselijke eilandjes cellen die door lentivirus met korte haarspeld RNA (shRNA) worden weergegeven. Dit protocol maakt gebruik van direct beschikbare enzym-en kweekvaten, kan gemakkelijk worden uitgevoerd en produceert genetisch gemodificeerde humane pseudoislets die geschikt zijn voor functionele en morfologische studies.

Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en minimaal invasieve methode voor het transplanteren en afbeelden van NIT-1-cellen in niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte muizen die worden uitgedaagd met splenocyten gezuiverd van spontaan diabetische NOD-muizen.

Bioluminescente monitoring van transplantaatoverleving in een adoptief transfermodel van auto-immuundiabetes bij muizen

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Ontdek hoe neo-isletvorming in de lever van diabetische muizen wordt geïnduceerd via helper-afhankelijke adenovirale vectoren. Deze methode normaliseert bloedglucose en insulinespiegels effectief.

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Meer video's verkennen