Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van zuivere en levensvatbare primaire neuron type twee alveolaire epitheelcellen voor daaropvolgende functionele en moleculaire analyses. Eerst worden de long en luchtpijp van een geofferde muis gevuld met een oplossing van DYS displays en vervolgens met agarose. De long wordt daarna verwijderd nadat de dispa de long heeft kunnen verteren.

Het weefsel wordt handmatig gedisintegreerd. De resulterende suspensie wordt gefilterd door een reeks zeven met een afnemende poriegrootte. Vervolgens worden gekleurde en type twee alveolaire epitheelcellen geïsoleerd via flowcytometrische negatieve selectie.

Uiteindelijk kunnen de geïsoleerde alveolaire epitheelcellen van type twee worden gebruikt voor het uitvoeren van functionele en moleculaire assays om hun rol bij respiratoire infecties en bepaalde auto-immuunziekten te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van pulmonale immuunrelaties, met name in de context van auto-immuun-gemedieerde longziekten en virale infecties. Visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de preparatie van het orgaan en de celsuspensie moeilijk aan te leren zijn.

Het algehele succes van dit protocol hangt af van enkele belangrijke details tijdens deze stappen. Warm voor elke muis in het experiment een buis van 15 milliliter met vier milliliter DYS-buffer voor in een waterbad van 37 degrees Celsius. Plaats kleine aliquots van 1% low-melt agarose in water in een warmteblok van 95 degrees Celsius totdat deze gesmolten zijn. Koel ze vervolgens af naar 45 degrees Celsius en houd ze op deze temperatuur tot ze in de volgende stap worden gebruikt.

Om de long van de muis voor te bereiden, wordt een muis die is geëuthanaseerd door CO2-asphyxie besproeid met ethanol. Maak een lange snede langs de ventrale middellijn van het lichaam.

Trek vervolgens de ventrale huid naar achteren en snijd voorzichtig het peritoneum door om het te verwijderen. Na het uitbloeden van de muis wordt het diafragma voorzichtig gepuncteerd en verwijderd, waarna de ribben worden weggesneden. Om het hart en de long bloot te leggen, dient men er bijzonder op te letten de long niet te beschadigen met een 26 gauge canule en een 10 milliliter spuit gevuld met koud.

Puneer de rechterventrikel van het hart met PBS en perfuseer de long met PBS totdat deze bloedvrij is. Snijd de speekselklieren door en verwijder deze om de trachea bloot te leggen. Snijd daarnaast voorzichtig de spieren rondom de trachea door.

Plaats vervolgens een 22 gauge verblijvencannule in de trachea. Verwijder de naald en schuif de plastic katheter richting de long. Fixeer de katheter door een klein stukje garen rond de trachea en de katheter te knopen.

Indien gewenst, bereid een monster van bronchoalveolaire lavagevloeistof voor door de longen door te spoelen met PBS of medium met behulp van de in de trachea ingebrachte katheter. Bewaar de lavagevloeistof op ijs tot aan de verdere analyse. Het moeilijkste aspect van deze procedure is de digestie en desintegratie van het weefsel.

Om het succes van dit protocol te garanderen, moet u ervoor zorgen dat de volledige dispa alle longkwabben vult en dat dit ook na de weefseldigestie het geval is. U moet het weefsel desintegreren. Gebruik voorzichtig een spuit van twee milliliter om een maximumvolume van twee milliliter van de eerder bereide dispa via de katheter in de long te injecteren, zodat alle kwabben volledig zijn uitgezet. Vervang de spuit door een spuit van één milliliter die 0,5 milliliter vloeibare aros bevat en breng de inhoud in de long aan.

Laat de spuit op de katheter zitten om terugstroom van de aerogel te voorkomen en bedek de long onmiddellijk met laboratoriumtissue, papier en ijs. Laat de aerogel een paar minuten rusten. Verwijder vervolgens het tissuepapier, het ijs, de spuit en de katheter.

Snijd vervolgens de trachea door en verwijder de long, het hart en de thymus uit de borstkas. Spoel de geprepareerde organen in een schaal met PBS. Snijd daarna het hart, de thymus en de resterende trachea van de long weg en gooi deze weg.

Plaats de long in de buis die de resterende twee milliliters van de displays bevat en incubeer deze 45 minuten bij kamertemperatuur. Pas de incubatie aan om een efficiënte blokkering van de FC-receptoren van fagocytische cellen te waarborgen vóór de kleuringsprocedure. Verplaats de long vanuit de displays naar een schaal met zeven milliliters van 1 µg/mL anti-CD 1632-antilichaam en 100 µL DNAs in DMEM; desintegreer het longweefsel vervolgens volledig door het met twee paren pincetten uit elkaar te trekken.

Incubeer het vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform ingesteld op 200 RPM indien gewenst. De celsuspensie kan daarna worden bewaard bij vier graden Celsius tot de volgende stap. Pipetteer de celsuspensie door een reeks nylon zeven.

Giet eerst de suspensie door een filter van 100 micron die op een buis van 50 milliliter is geplaatst. Als monsters worden samengevoegd, laat de celsuspensies van muizen uit dezelfde groep dan door hetzelfde filter lopen. Als het filter verstopt raakt, vervang deze dan door een nieuwe.

Herhaal dit proces met een filter met een maaswijdte van 70 micron. Zorg ervoor dat elke zeef, evenals de buizen en schaaltjes, grondig wordt gespoeld met DMEM om celverlies te minimaliseren en de opbrengst te maximaliseren. Trek de suspensie vervolgens door een filter met een maaswijdte van 48 micron dat over een plastic of glazen ring is gespannen, zoals hier wordt getoond.

Vang het doorstroomvolume op in een Petrischaal. Herhaal dit proces vervolgens met een gaas van 30 micron. Breng het filtraat, afhankelijk van het volume, over naar één of meerdere buizen van 50 milliliters en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 160 ×g bij vier graden Celsius.

Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer de celpellet in twee milliliter erytrocytenlysisbuffer. Beëindig vervolgens snel de lysis door toevoeging van 13 milliliter DMEM-medium. Overbreng de oplossing naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende 12 minuten bij 160 ×g en vier °C.

Resuspendeer de cellen in drie milliliters van een primaire antilichaamcocktail die antilichamen tegen CD 11 C, CD 11 BF vier 80 CD 19, CD 1632 en CD 45 bevat. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in het donker bij vier graden Celsius of op ijs. Was de cellen na de incubatie door de buis te vullen met DMEM en centrifugeer gedurende 12 minuten bij 160 ×g en vier graden Celsius.

Resuspendeer de cellen in één milliliter DMEM en filter deze voorstaps door een 50 micron filter in een buisje voor cel sortering. Tel de cellen om het totale aantal cellen in de longsuspensie te bepalen. Gebruik een 100 micro nozzle voor het sorteren van EC2 direct voorafgaand aan de sortering.

Meng de celsuspensie door de koker te vortexen. De vloeistofdruk en de emissie- en detectiegolflengten van de laser zijn afhankelijk van het instrument dat wordt gebruikt voor flowcytometrische cel sortering, evenals van de fluorochromen die in de antilichaamkleuringsprocedure worden gebruikt. Maak eerst een plot van side scatter area tegenover fluorescentie en selecteer (gate) alle cellen met een hoge side scatter area die negatief zijn voor de voor de kleuring gebruikte fluorochromen.

Genereer vervolgens plots van sideward scatter area versus forward scatter area, forward scatter height versus forward scatter area en sideward scatter height versus sideward scatter area, en stel gates in om doubletten of celaggregaten uit te sluiten tijdens het sorteren in een buis met DMEM. Bij het sorteren van longcelsuspensies geïsoleerd van gezonde muizen, zal de EC2-gate doorgaans ongeveer 42 ± 10% van alle events beslaan. Om de gesorteerde cellen te verzamelen, wordt er 20 minuten gecentrifugeerd bij 280 ×g en 4 °C.

Resuspendeer de alveolaire epitheelcellen type twee of EC2 in kweekmedium of buffer, zoals vereist voor de daaropvolgende analyse. Primaire murine alveolaire epitheelcellen type twee werden geïsoleerd door middel van flowcytometrische negatieve selectie zoals beschreven in deze video; de analyse van de gesorteerde cellen wordt hier weergegeven, zoals aangegeven.

De zuiverheid van de geïsoleerde cellen is ongeveer 92 ± 5%. Een spin van gesorteerde A EC2 werd gekleurd voor het surfactant-eiwit C; een fasecontrastbeeld is links weergegeven en immunofluorescentie is rechts weergegeven. Bijna 100% van de cellen bleek positief voor surfactant-eiwit C, wat de succesvolle isolatie van een zuivere populatie bevestigt. Om de effecten van een in vivo influenza A-virusinfectie te beoordelen, werden A EC2 geïsoleerd uit C 57 BL six-muizen die één, twee of drie dagen eerder intranasaal fosfaatgebufferde zoutoplossing of influenza A-virus PR eight A 34 hadden toegediend gekregen.

Deze plots tonen longcel-suspensies van zowel een niet-geïnfecteerd als een drie dagen geïnfecteerd C 57 black six mannetje, gekleurd voor sortering vanwege de rekrutering van immuuncellen naar de geïnfecteerde long. Het aandeel fluorescentie-negatieve cellen met een hoge side scatter is aanzienlijk afgenomen binnen de celsuspensie bereid uit de drie dagen geïnfecteerde muizen in vergelijking met de niet-geïnfecteerde muizen. De expressie van Influenza A-virus nucleair proteïne in gesorteerde C two werd geanalyseerd via intracellulaire kleuring met een nucleair proteïne-specifiek antilichaam.

Het histogram laat zien dat AEC2 die zijn geïsoleerd uit in vivo geïnfecteerde muizen een specifiek fluorescentiesignaal geven na intracellulaire kleuring voor het nucleoproteïne van het influenza A-virus. De tabel toont de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de kleuring van het nucleoproteïne; de intensiteit van het signaal dat wordt geproduceerd door de intracellulaire nucleoproteïne-kleuring van AEC2 geïsoleerd uit influenza A-virus-geïnfecteerde muizen neemt toe met de duur van de virale infectie om de levensvatbaarheid van AEC2 geïsoleerd uit gezonde muizen aan te tonen en hun vatbaarheid voor influenza A-virusinfectie te testen.

De expressie van het virale nucleaire eiwit van influenza werd ook geanalyseerd in X vivo geïnfecteerde geïsoleerde cellen, zoals hier wordt getoond. Een aanzienlijk deel van de EC2-cellen tot expressie brengt het virale nucleaire eiwit zes uur na infectie. Deze gegevens zijn hier samengevat.

Het percentage EC2 dat positief is voor de intracellulaire kleuring van het virale kernproteïne hangt af van de virale dosis die is gebruikt voor het ex vivo infectie-experiment. Deze resultaten tonen aan dat de geïsoleerde primaire neuronen, de EC2, levensvatbaar en vatbaar zijn voor virale infectie en replicatie, beoordeeld op basis van de waargenomen expressie van het virale proteïne. Bij het uitvoeren van deze procedure is het zeer belangrijk om alle stappen van weefseldigestie en -disintegratie zorgvuldig uit te voeren.

Daarnaast is het zeer belangrijk om strikt te gaten op de fluorescentie-negatieve en zijdelingse getter-area high-cellen. Na het sorteren volgens deze procedure kunnen andere methoden, zoals moleculaire en functionele studies, worden uitgevoerd om de rol van ular type twee tthe derde van de long uit te sluiten in de context van virale infecties en auto-immuun gemedieerde longziekten.I.