Name: Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Leer de isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen via flowcytometrische negatieve selectie. Deze methode levert cellen met hoge viabiliteit en zuiverheid voor functionele en moleculaire studies naar ademhalingsziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen M. Höxter bedanken voor technische bijstand bij het sorteren primaire murine AECII van bioveiligheidsniveau 2 monsters. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Duitse Research Foundation (DFG) DB (SFB587, TP B12 en BR2221/1-1) en een beurs van de Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) tot AA. DB wordt ondersteund door initiatief van de president en Networking Fonds van de Helmholtz Vereniging van Duitse Research Centers (HGF) onder contract nummer W2/W3-029.

Details over de vereiste reagentia en materialen worden vermeld in de tabel aan het einde van het protocol hieronder. Vóór aanvang bereiden 15 ml buisjes (een per muis) met 4 ml dispase en voorverwarmen ze tot 37 ° C in een waterbad. In een verwarmingsblok kort verwarmen kleine hoeveelheden van 1% laag smeltpunt agarose (in water) tot 95 ° C tot vloeibaar en vervolgens afkoelen tot 45 ° C tot gebruik. 1. Voorbereiding van de Muis Lung <ol><li> Offer de muis door CO 2 stikken. Opmerking: Voer geen cervicale dislocatie omdat dit de luchtpijp verwonden, zodat volgende stappen van het protocol, zoals de installatie van de long met vloeistof, kan niet met succes worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat het verlies van nociceptieve reflexen. </li><li> Spuit de muis met ethanol en een lange snede langs de ventrale middenlijn van het lichaam. Trek de ventrale vacht en huid en vervolgens ook zorgvuldig te schrappen en het buikvlies. </li><li> Exsanguinate demuis door het snijden van de linker en rechter halsader (vena jugularis) en de nierslagader (Arteria renalis). Verwijder stromend bloed met weefsel. </li><li> Zorgvuldig lekke band en verwijder het membraan naar het hart en de longen worden blootgesteld door het wegsnijden van de ribben. Wees extra voorzichtig dat u de longen beschadigen. </li><li> Met een canule 26G en 10 ml spuit met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), doorboren de rechter ventrikel van het hart en de longen perfuseren met PBS tot deze bloed. </li><li> Snij en verwijder de speekselklieren van de luchtpijp bloot te leggen. Ook zorgvuldig knippen de spieren rond de luchtpijp. </li><li> Plaats een 22G inwoning canule in de luchtpijp, verwijder de naald en druk de plastic catheter in de richting van de longen. Bevestig de katheter door koppelverkoop een klein stukje draad om luchtpijp en de katheter. </li></ol> 2. Enzymatische afbraak van het longweefsel Desgewenst kan een bronchoalveolaire lavage vloeistof monsterbereid door spoelen van de longen door de catheter ingebracht in de trachea met PBS of medium voor de volgende stap. <ol><li> Een 2 ml spuit voorzichtig inboezemen een maximaal volume van 2 ml dispase (4 ml van het monster) in de long via de katheter zodat alle lobben volledig geëxpandeerd. Wisselen spuit met een 1 ml spuit met 0,5 ml van de vloeibare agarose en druppelen in de longen. </li><li> Laat de spuit op de katheter om terugstroming van de agarose te voorkomen en deze onmiddellijk de long met laboratorium tissuepapier en ijs. Laat de agarose gel een paar minuten. </li><li> Verwijder het zijdepapier, ijs, spuit en catheter, snijd de luchtpijp en accijnzen de longen, het hart en de thymus van de borst. Spoel daarna de long in een schaal met PBS en verwijder het hart, de thymus en de resterende luchtpijp. </li><li> Plaats de longen naar de resterende 2 ml dispase en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. </li></ol> 3. Bereiding van de LungCelsuspensie <ol><li> Verwijder de longen van de dispase en breng deze in een schotel met 7 ml anti-CD16/32 antilichaam (1 pg / ml eindconcentratie) in DMEM medium en 100 ul DNase. </li><li> Behulp van een tang, volledig uiteenvallen het longweefsel van elkaar te trekken en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder voorzichtig schommelen op een rocker ingesteld op 200 rpm. Desgewenst kan de celsuspensie dan bewaard bij 4 ° C tot de volgende stap. </li><li> Filter de celsuspensie door nylon mazen eerst met 100 urn en vervolgens met 70 urn, 48 urn en 30 urn poriën. Zorg elke maas spoelen en de buizen en gerechten grondig met DMEM om verlies van cellen te minimaliseren en te maximaliseren. Als u poolen van monsters, kan dit hier worden bereikt door vervolgens het passeren van cellen schorsingen van muizen van de ene groep door dezelfde filter stromen. Vernieuw het filter in het geval van verstopping. </li><li> Afhankelijk van het volume, Breng het filtraat aan een of meer 50 ml buizen encentrifugeer 15 min bij 160 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 2 ml erytrocyten lysis buffer (0,15 M NH4Cl, 0,01 M KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) en snel lysis beëindigd door toevoeging van 13 ml DMEM medium. De oplossing wordt naar een 15 ml en centrifugeer gedurende 12 minuten bij 160 xg en 4 ° C. </li></ol> 4. Antilichaam Kleuring voor flowcytometrische cell-sortering <ol><li> Resuspendeer de cellen in 3 ml primair antilichaam cocktail, bereid in DMEM medium bij verdunningen geschikt voor flowcytometrie. (Antilichamen werden voorheen getitreerd voor optimale werkverdunningen door kleuring 1 x 10 6 splenocyten in een volume van 100 ul. Gebruik 3 ml van het primaire antilichaam cocktail met de optimale concentratie voor elk van de gebruikte antilichamen cellen samengevoegd uit maximaal vijf muizen. Als er meer muizen worden samengevoegd tot een monster, het volume aanpassen). </li><li> Voor kleuring Incubeer de cellen gedurende 10 min in het donkerbij 4 ° C. </li><li> Spoel de cellen door het vullen van de buis met 15 ml DMEM medium en centrifugatie gedurende 12 min bij 160 xg en 4 ° C. </li><li> Bij ontkoppeld of gebiotinyleerde antilichamen werden gebruikt in 4.1: Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 - 3 ml secundair antilichaam cocktail. Vlek gedurende 10 min bij 4 ° C in het donker. </li><li> Spoel de cellen door het vullen van de buis met DMEM en centrifugatie gedurende 12 min bij 160 xg en 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM en voorfilter door een 50 urn filter in een buis voor cel-sortering. Optioneel: Tel de cellen van het totale aantal cellen in de long celsuspensie te verkrijgen. </li></ol> 5. Cell-sortering <ol><li> Meng de cellen door vortexen voor sortering. Gebruik een 100 um mondstuk voor cel-sortering van AECII. Mantelvloeistof druk en laser emissie-en detektieinrichting golflengten afhankelijk van het instrument voor flowcytometrische cell-sortering en de fluorochromen in de ANTIBody kleuringsprocedure. </li><li> Hek aan de SSC high cellen die negatief zijn voor de fluorochromen voor kleuring en sorteren in een buis die DMEM. Gebruik voorwaartse verstrooiing hoogte (FSC-H) vs gebied (FSC-A) en zijwaartse verstrooiing hoogte (SSC-H) vs gebied (SSC-A) vensters om alle doubletten of celaggregaten sluiten (zie details van de gating strategie in Figuur 1 a). </li><li> Om de gesorteerde cellen centrifuge inzamelen voor 20 min bij 280 xg en 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in kweek-medium of buffer als voor latere analyse. </li></ol>

<ol><li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+type+II+cell%3A+defender+of+the+alveolus+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li>
<li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelium%3A+more+than+just+a+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li>
<li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4%2B+T+cell+mediated+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47(2007).</li>
<li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4%28%2B%29+T+cells+and+induce+Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li>
<li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+longer+an+innocent+bystander%3A+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li>
<li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection%3A+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li>
<li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li>
<li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li>
<li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetyl-L-cysteine+%28NAC%29+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li>
<li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing%2C+stress+tolerance%2C+surfactant+lipid+composition%2C+and+immune+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Pulm.+Med%22%5BJournal%5D)">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15(2012).</li>
<li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li>
<li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li>
<li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li>
<li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+synthesis%2C+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li>
<li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+%28IFN-lambda+1%29+in+response+to+influenza+A+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Onze protocol voor de isolatie van muizen AECII door flowcytometrie biedt een snelle manier toegang primaire cellen uit de muizenlong voor een hele reeks van functionele en moleculaire studies. De beschreven procedure levert zeer levensvatbare en zuivere populaties van AECII die voldoende in aantal directe latere analyses zoals RNA isolatie (zie figuur 2b) en transcriptoom studies. Voor functionele toepassingen, is het ook mogelijk om cultuur de geïsoleerde cellen, waardoor bijvoorbeeld het gen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> verblijfscanule Introcan 22G </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 ml (5000 caseïnolytische eenheden) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> aliquot tot 4 ml in 15 ml buizen, bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Biozym Plaque Agarose </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease I uit runderpancreas, 2000 Kunitz eenheden / flacon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> vers Los de inhoud van 1 injectieflacon in 300 ul DMEM </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> gebruikt zoals bepaald door de fabrikant (Low Glucose, Pyruvaat, HEPES) </td></tr><tr><td> cell zeven (100 urn, 75 urn) </td><td> BD Falcon </td><td> 352360, 352350 </td><td></td></tr><tr><td> nylon mesh (48 urn, 30 pm) </td><td> Bückmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 urn filter </td><td> Partec </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> anti-muis CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> kloon 93; gezuiverd </td></tr><tr><td> anti-muis F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> kloon BM8; APC gekoppelde </td></tr><tr><td> anti-muis CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> kloon M1/70; PE gekoppelde </td></tr><tr><td> anti-muis CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> kloon N418; APC gekoppelde </td></tr><tr><td> anti-muisCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> kloon 30-F11; gezuiverd </td></tr><tr><td> anti-muis CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1D3; PE gekoppelde </td></tr><tr><td> polyklonaal geit anti-rat IgG </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> polyklonale, gekoppeld PE </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antilichamen gekoppeld aan andere fluorochromen worden gebruikt, afhankelijk van de stromingscytometer en lasers beschikbaar. </td></tr></tbody></table>

flowcytometrische isolatie van primaire murine type ii alveolaire epitheelcellen voor functionele en moleculaire studies

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

In de afgelopen jaren, is de bijdrage van alveolaire type II epitheelcellen (AECII) diverse aspecten van immuunregulatie in de longen vaker erkend. AECII is aangetoond dat deel cytokine productie in ontstoken luchtwegen en zelfs als antigen-presenterende cellen in zowel infectie en T-cel gemedieerde auto-immuniteit 1-8. Daarom zijn ze bijzonder interessant ook binnen klinische vraagstellingen, zoals hyperreactiviteit van de luchtwegen bij buitenlandse en zelf-antigenen alsook infecties die direct of indirect richten AECII. Echter ons begrip van de gedetailleerde immunologische functies bediend door alveolaire type II epitheelcellen van gezonde long en in ontsteking blijft fragmentarisch. Veel studies over AECII functie worden uitgevoerd met behulp van de muis of mens alveolaire epitheliale cellijnen 9-12. Werken met cellijnen biedt zeker een aantal voordelen, zoals de beschikbaarheid van een groot aantal of cellen voor uitgebreide analyses. Echter, wij geloven het gebruik van primaire muriene AECII zorgt voor een beter begrip van de rol van dit type cel in complexe processen, zoals een infectie of auto-immuun ontsteking. Primaire murine AECII direct geïsoleerd uit dieren die lijden aan dergelijke ademhalingsproblemen, wat betekent dat ze zijn onderworpen aan de aanvullende extrinsieke factoren een rol spelen in de geanalyseerde setting. Als voorbeeld kan levensvatbare AECII worden geïsoleerd uit muizen intranasaal geïnfecteerd met influenza A-virus, die voornamelijk deze cellen richt voor replicatie 13. Belangrijker door ex vivo infectie van AECII geïsoleerd uit gezonde muizen, kan studies van de cellulaire responsen bevestigd na infectie worden verlengd. Onze protocol voor de isolatie van primaire murine AECII is gebaseerd op enzymatische afbraak van de muizenlong gevolgd door etikettering van de resulterende celsuspensie met antilichamen specifiek voor CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 en CD16/CD32. Granulaire AECII worden vervolgens geïdentificeerd als ongelabelde en zijwaartse verstrooiing hoog (SSC hoog) celpopulatie worden gescheiden door fluorescentie geactiveerde celsortering 3. In vergelijking met andere werkwijzen voor het isoleren primaire epitheelcellen muizenlongen, ons protocol voor flowcytometrische isolatie van AECII door negatieve selectie levert ongerepte zeer levensvatbare en zuivere AECII in relatief korte tijd. Bovendien, in tegenstelling tot conventionele methoden van isolatie door panning en uitputting van lymfocyten via binding van antilichaam-gekoppelde magnetische korreltjes 14, 15, flowcytometrische cell-sortering maakt onderscheid door celgrootte en granulariteit. Aangezien instrumentatie voor flowcytometrische celsortering beschikbaar is, kan de beschreven procedure worden toegepast tegen relatief lage kosten. Naast standaard antilichamen en enzymen voor long desintegratie geen extra reagentia zoals magnetischebeads vereist. De geïsoleerde cellen zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies, waaronder in vitro kweek en T-cel stimulatie assays en transcriptoom, proteoom of secretoom analyses 3, 4.

Bij het sorteren longcelsuspensies geïsoleerd uit gezonde muizen, zal de AECII poort doorgaans goed zijn voor ongeveer 42 ± 10% van alle gebeurtenissen. Dit percentage kan aanmerkelijk lager bij muizen met ademhalingsaandoeningen zoals een virale infectie worden gebruikt als de oorspronkelijke celsuspensie een aanzienlijk hoger percentage lymfocyten en andere cellen aangetrokken om de luchtwegen bevatten. Voor AECII geïsoleerd uit IAV geïnfecteerde longen op dag 3 na infectie we hebben waargenomen verlaging van de frequ...

We beschrijven de snelle isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen (AECII) door flowcytometrische negatieve selectie. Deze AECII vertonen hoge levensvatbaarheid en zuiverheid en zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies over hun rol bij luchtwegaandoeningen zoals auto of infectieziekten.

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

In de afgelopen jaren is de bijdrage van alveolaire epitheelcellen type II (AECII) aan diverse aspecten van de immuunregulatie in de long ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van zuivere en levensvatbare primaire neuron type twee alveolaire epitheelcellen voor daaropvolgende functionele en moleculaire analyses. Eerst worden de long en luchtpijp van een geofferde muis gevuld met een oplossing van DYS displays en vervolgens met agarose. De long wordt daarna verwijderd nadat de dispa de long heeft kunnen verteren.Het weefsel wordt handmatig gedisintegreerd. De resulterende suspensie wordt gefilterd door een reeks zeven met een afnemende poriegrootte. Vervolgens worden gekleurde en type twee alveolaire epitheelcellen geïsoleerd via flowcytometrische negatieve selectie.Uiteindelijk kunnen de geïsoleerde alveolaire epitheelcellen van type twee worden gebruikt voor het uitvoeren van functionele en moleculaire assays om hun rol bij respiratoire infecties en bepaalde auto-immuunziekten te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van pulmonale immuunrelaties, met name in de context van auto-immuun-gemedieerde longziekten en virale infecties. Visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de preparatie van het orgaan en de celsuspensie moeilijk aan te

flow-cytometric-isolation-primary-murine-type-ii-alveolar-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

De gezondheidsstatus van de long wordt weerspiegeld door het type en het aantal immuuncellen die aanwezig zijn in de bronchiolen van de long. We beschrijven een bronchoalveolaire lavage techniek die de isolatie en studie van niet-adherente cellen en oplosbare factoren uit het onderste luchtwegen van muizen mogelijk maakt.

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Dit werk beschrijft een FACS-based protocol dat het mogelijk maakt om de gelijktijdige isolatie van type I en type II pericytes uit skeletspieren mogelijk te maken.

Isolatie van type I en type II pericytes uit muizenskeletspieren

Deze mededeling beschrijft methodologieën voor isolatie en cultuur van de alveolaire macrofagen van mens en lymfkliertest modellen voor experimentele doeleinden.

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Dit protocol biedt een op flow cytometrie gebaseerde methode om levensvatbare alveolaire type II epitheelcellen (AECII) te isoleren uit neonatale, juveniele of volwassen muislongen (geïnfecteerd of niet-geïnfecteerd). Deze aanpak maakt downstream moleculaire en/of functionele studies van AECII mogelijk om hun rol tijdens longontsteking en infectie te identificeren.

Isolatie van alveolaire Type II epitheelcellen uit neonatale, juveniele en volwassen muislongen die zich kunnen aanpassen aan infectieuze experimentele omgevingen

Leer de isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen via flowcytometrische negatieve selectie. Deze methode levert cellen met hoge viabiliteit en zuiverheid voor functionele en moleculaire studies naar ademhalingsziekten.

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Meer video's verkennen