Name: Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Leer hoe u kunstmatige antigeen presenterende cellen (AAPC) gebruikt voor de activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen uit perifeer bloed. Deze gestandaardiseerde methode genereert grote aantallen functionele NKT-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Priyanka Subrahmanyam bedanken voor nuttige discussies. De auteurs hebben geen concurrerende financieel belang. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 en P30 Tumor Immunologie en immunotherapie programma naar TJ Webb. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health.

1. Generatie AAPC <ol><li> Voor het toevoegen eiwitten aan beads, bereiden alle reagentia en buffers: 0,1 M boraatbuffer, 1X D-PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +); Bead Wash Buffer (1X PBS +5% menselijk AB serum + 0,02% natriumazide) ; compleet medium (RPMI medium +100 mM natriumpyruvaat, 10 mM niet-essentiële vitamines, 100 mM MEM vitamine oplossing, 1% 2-mercaptoethanol, 10 uM ciprofloxacine, 5% menselijk AB serum) MACS buffer (1 L PBS free van Ca2 + en Mg2 +, 5 g BSA, en 2 mmol EDTA). </li><li> Spoel 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy kralen met 3 ml steriele 0,1 M boraatbuffer (boorzuur en water, pH 7.0-7.4) in een 5 ml helder borosilicaatglas schroefdraad flacon. </li><li> In een afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuisje, voeg 100 ug hCD1d-Ig dimeer en 20 ug costimulatoire moleculen (bijvoorbeeld anti-CD28mAb) naar 1 ml PBS w / o Ca2 + of Mg2 +. </li> &lt;li&gt; Plaats kraal met daarin glazen flesje op de magneet en zuig boraatbuffer van kralen. Voeg eiwit mengsel van stap 1,2 tot glazen flacon en vervang dop. Meng onmiddellijk door het buisje, bedek de dop met parafilm, en op een rotator en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> De volgende dag, plaats glazen flesje op de magneet en verwijder eiwitmengsel, terwijl zorgvuldig vermijden van kralen. Was de kralen door 3 ml bead wasbuffer (PBS met 5% AB serum +0.02% natriumazide) en incubatie bij 4 ° C op een rotator gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen. </li><li> Kralen kunnen worden opgeslagen in deze kraal wash mengsel. Om functionele AAPC te maken, verwijdert u een kleine hoeveelheid en tel de kralen met behulp van een hemacytometer. Controleer of de eiwitten stabiel worden geplaatst op de parels door kleuring met antilichamen (ex. PE-geconjugeerd anti-muis IgG1) en het uitvoeren van flowcytometrische analyse. </li><li> Om kralen te laden met antigeen, verwijdert u 5 x 10 7 kralen, en toe te voegen aan een kleine 1,5 ml glazen injectieflacon, spoel kralen met 1 ml steriele PBS. Resuspend gewassen kralen met 1 ml steriele PBS en voeg antigeen; voorbeeld: Load met α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Opmerking: Tijdens het, we hebben niet gedetecteerd eventuele problemen met vetoplosbaarheid of micelvorming, lipiden dient te worden behandeld volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Specifiek werd KRN7000 gereconstitueerd in DMSO (1mg/ml) voor deze studies. KRN7000 en glycolipide antigenen kunnen ook worden opgelost in 0,2 mg / ml PBS die 0,5% Tween-20 (ultrasone trillingen 2 uur. Bij 37 ° C). BELANGRIJK-De AAPC moeten worden geladen ten minste 48-72 uur voor gebruik. </li></ol> 2. Isolatie van CD161 + CD3 + cellen <ol><li> Verzamel perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Voor Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie scheiding van lymfocyten uit een buffy coat of leukoferese pack, eerst verdunnen gehepariniseerd bloed met een gelijk volume van 1X PBS bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 15 ml Ficoll (opgewarmd tot kamertemperatuur) tot 50 ml conische buizen. Langzaam overlay25 ml van het verdunde bloed mengsel op de Ficoll. Centrifugeer bij 2000 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur met de rem uit. </li><li> Verwijder voorzichtig de lymfocyt-interface (witte ring tussen de media en Ficoll) met een Pasteur pipet en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische buis. </li><li> Spoel de cellen door het opvullen van de buis 50 ml met PBS en centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en combineren de buizen van een persoon aan een buis en nawassen het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) met 20 ml PBS. Vervolgens telt de PBMC en resuspendeer in een concentratie van 5 x 10 7 cellen / ml in MACS buffer (1 L PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, 5 g BSA, en 2 mmol EDTA). </li><li> Om de T-cel fractie te isoleren, te beginnen met 2 ml van PBMC (10 8 cellen) en voeg 100 ul Pan T cel verrijkingscocktail oplossing uit de EasySep Human T Cell Enrichment Kit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li&gt; <li> Voeg 100 ul van magnetische deeltjes aan de oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende nog 10 minuten. Breng het uiteindelijke volume van het oplosmiddel tot 2,5 ml en plaatst de buis in de paarse magneet gedurende 5 minuten. Snel giet het CD3 + fractie in een 15 ml conische buis. </li><li> Spoel de cellen door toevoeging van 5 ml koud MACS buffer, telt het aantal levensvatbare cellen en verwijderen van een aliquot van FACS kleuring. </li><li> De CD161 + cellen, eerste hersuspenderen verrijkte T cellen te selecteren in 980 ul ijskoude MACS buffer, voeg 10 ug anti CD161 mAb, en incubeer in de koelkast gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1500 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Vervolgens reconstrueren de celpellet in 800 ui MACS buffer. Voeg 200 ul van anti-muis IgG1 microbeads en incubeer de oplossing gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Tijdens deze incubatiestap equilibreer een LS kolom door 3 ml MACS buffer. </li><li> Vervolgens was de cellen door centrifugeren 1500 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Automabrengen de cellen in 3 ml MACS buffer. Pipetteer dan de cellen in de LS MACS scheidingskolom. Zorg ervoor dat u het genereren van luchtbellen te vermijden door pipetteren langzaam. Spoel de kolom door 3 ml MACS buffer. Tweemaal herhalen. </li><li> Voeg 3 ml verse MACS buffer en verwijder kolom van magneet. Plaats de kolom in een 15 ml conische buis. Plaats zuiger en duwen inhoud aan gezuiverd CD161 + CD3 + cellen te verkrijgen. Graaf NKT cel verrijkt fractie. Je moet over 2-4 miljoen cellen. </li></ol> 3. AAPC-gemedieerde NKT celexpansie <ol><li> In co-cultuur door 10 6 verrijkte CD161 + CD3 + T-cellen en 10 6 AAPC in 16 ml compleet medium (compleet medium + IL-2, 100 U / ml). Plate dit mengsel door het toevoegen van 160 ul / putje eindvolume van een 96 well weefselkweek behandeld polystyreen, U-bodemplaat met lage verdamping deksel. Voer medium uitwisseling elke 7 de dag door het toevoegen van 80 pl vers medium. </li><li> Oogstcellen, tellen, en het uitvoeren van FACS-kleuring op dag 12-14. </li><li> De geëxpandeerde NKT cellen worden opnieuw uitgeplaat zoals hierboven beschreven in stap 3.1, specifiek 10 6 geëxpandeerde T-cellen en 10 6 AAPC resuspenderen in 16 ml compleet medium. Plaat dit mengsel door toevoeging van 160 ul / putje van een 96 putjes U-bodemplaat. Blijven co-cultuur medium vernieuwen elke 7 de dag door het toevoegen van 80 pl vers medium. </li><li> Het beste is om extra NKT cellen in te vriezen na de tweede ronde van expansie (1 x10 6 / Cryovial in 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.) </li></ol> 4. Functionele Test: AAPC-gemedieerde stimulatie van NKT-cellen <ol><li> Stel 5x10 4 NKT cellen / putje met 5x10 5 AAPC in 200 ul eindvolume (compleet medium) in 96 en U-bodemplaat. </li><li> Harvest celkweeksupernatant voor ELISA na 24-48 uur. </li></ol>

<ol><li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+T-cell+receptor+%CE%B1%CE%B2-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V%CE%B2+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel population of T-cell receptor αβ-bearing thymocytes which predominantly expresses a single Vβ gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li>
<li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li>
<li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+%CE%B1%CE%B2+T+cells+expressing+invariant+TCR+%CE%B1-chains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Close phenotypic and functional similarities between human and murine αβ T cells expressing invariant TCR α-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li>
<li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V%CE%B124%2B+CD4-CD8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Requirements for CD1d recognition by human invariant Vα24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li>
<li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+expression+of+a+distinctive+V14%2B+T-cell+antigen+receptor+%CE%B1+chain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor α chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li>
<li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+invariant+V%CE%B124-J%CE%B1Q%2FV%CE%B211+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">An invariant Vα24-JαQ/Vβ11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li>
<li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+System%3A+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24%2B+NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li>
<li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li>
<li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li>
<li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li>
<li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li>
<li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li>
<li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li>
<li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I%2Fpeptide+antigen+complexes+on+microspheres+%28large+multivalent+immunogen%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li>
<li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li>
<li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells%3A+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8%2B+T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM%2FTSP+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li>
<li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li>
<li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li>
<li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

AAPC kan worden gebruikt om de basis voor NKT celactivering bestuderen en heeft potentiële klinische waarde voor ex vivo expansie van NK T cellen voor adoptieve immunotherapie. Mescher et al.. Beschreef een van de eerste kraal systemen waar gebiotinyleerde muizen MHC klasse I-peptide-constructen werden enkele keten gecombineerd met gebiotinyleerd costimulatoire moleculen B7.1 en B7.2 via streptavidine op het oppervlak van latex microsferen 14, 15. Deze aanpak is succesvol gebruikt om antigenspecifieke T-cellen uit transgene muizen te stimuleren. Bovendien, omdat deze benadering gebruikt een enkele keten MHC-peptide complex te zorgen voor een homogene belasting van de MHC moleculen zou elk doel antigen peptide dat een nieuwe transfectie voor expressie van het gewenste enkele keten MHC-peptide complex, waardoor het algemene karakter van de aanpak. Belangrijk is dat Dr Schneck groep een pionier in de kraal op basis-AAPC, door het ontwikkelen van een andere niet-cellulaire kraal op basis van AAPC, Gemaakt door koppeling HLA-Ig, signaal 1 en anti-CD28, signaal 2, op magnetische beads. HLA-Ig, een unieke multimere vorm van HLA gefuseerd aan een immuunglobuline moleculaire scaffold 16, 17 is ontwikkeld door zijn groep. Vervolgens ontwikkelden ze MHC-Ig based AAPC, waarvan is aangetoond effectief vergroten CMV en MART-1 specifieke CTL 18. Hier hebben we aangetoond dat CD1d-Ig based AAPC kan worden gebruikt om functionele NKT cellen vergroten. Een studie gebruikt een gelijkaardig systeem dat de fysische interactie van NK cellen onderzoeken met CD1d 19. Met name hebben we speciaal een kunstmatige antigen presenterende cel die is aangepast aan de eisen er nodig zijn voor optimale NKT celproliferatie. De AAPC uitbreiding methode biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor het uitbreiden en verrijken menselijke NKT cellen. Onze AAPC kan worden aangepast aan systematische evaluatie van de rol van een reeks van potentiële co-stimulerende moleculen en beoordelen hun rol op NKT cel proliferatietie en functie. Zo AAPC vormen een solide veelzijdige technologie nuttig is voor het induceren en het uitbreiden van NKT-cellen. Het genereren van aAPCs duurt minder dan een week en is geschikt voor de productie van grote hoeveelheden kralen. Een kritische stap in het genereren van de AAPC bevestig dat CD1d-Ig stabiel is geïmmobiliseerd op het oppervlak van de korrels en hun functionaliteit te beoordelen consistentie van partij tot partij. Een mogelijke beperking van het systeem is dat er geen mechanisme is dat schakelen stimulatie, andere dan mechanische verwijdering van de korrels. Specifiek, de betrokkenheid van de T cel receptor (TCR) met het antigeen: CD1d/MHC complex genereren doorgaans de immunologische synaps in overleg met toebehoren / adhesie moleculen, wat kan resulteren in de inductie van remmende of onderdrukkende factoren op zowel de T-cel en antigen presenterende cel. In het AAPC systeem kunnen deze factoren worden verhoogd door de T-cel, maar de hiel niet uitdrukken verwante ligandenvoor deze receptoren. Bovendien CD4 + NKT-cellen is aangetoond antitumor responsen bij muizen en mensen te onderdrukken, dan is het mogelijk dat niet-selectieve activering van NKT cellen (dwz global stimulatie met α-GalCer) of activering van het verkeerde deelverzameling kan leiden tot ongewenste immunologische uitkomsten. Bijgevolg moet men fenotypisch en functioneel karakteriseren van de AAPC-geëxpandeerde NKT celpopulatie. Zoals getoond in figuur 4, hebben wij gevonden dat stimulatie met α-GalCer-geladen AAPC expressie anti-CD28 kan NKT cellen die Th1, Th2 en Th17 type cytokinen leiden. Murine studies hebben gemeld dat uitdaging met IL-33, een recent geïdentificeerde cytokine, resulteerde in verhoogde niveaus van circulerende inflammatoire cytokines zoals IL-5 en IL-13. Behandeling van NKT cellen met IL-33 vergroot hun cytokine productie 20. IL-33 is een specifieke ligand voor ST2 en het is aangetoond dat oplosbare ST2 can blok IL-33 signalering. Dus, als een voorbeeld van een toekomstige toepassing, kan AAPC expressie ST2 worden gegenereerd en gebruikt om te bepalen of kon selectief remmen de productie van Th2 cytokines induceren terwijl Th1 cytokine secretie door NKT cellen. Ook is gemeld dat iv injectie van Kb-expressie AAPC in C57BL / 6 muizen resulteerde in verminderde longmetastase van tumor 21. Belangrijk, deze gegevens demonstreren dat AAPC verkeer naar de longen en kunnen effector T-cel subsets te activeren. Daarom zou men genereert meerdere soorten AAPC en onderzoekt de wisselwerking tussen antigeen specifieke T-cel subsets. Samengevat, deze studies tonen aan dat CD1d-Ig based AAPC kunnen worden gebruikt om normale cellulaire APC vervangen en moet het potentieel om de huidige klinische benaderingen voor NKT-cellen gebaseerde adoptieve immuuntherapie verbeteren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep humane T-cel Enrichment Kit </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanine CD161 menselijke mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magneet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-muis IgG 1 Microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimeer XI recombinant oplosbaar Dimere Mouse CD1d: IG Fusieproteïne </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 Epoxy beads </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamine Solution </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacine </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE antimurien lgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-muis IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, geen calcium, magnesium no </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Amerikaanse Bioanalytisch </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Human AB Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml polystyreen ronde bodem buizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Glas Monsterflesjes met Cap </td><td> Fisher Scientific </td><td> Kleine (03-343-6A) Grote (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

kunstmatige antigeen presenterende cel (aapc) gemedieerde activering en uitbreiding van natural killer t-cellen

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cellen zijn een unieke subset van T cellen die markers kenmerk van zowel natuurlijke killer (NK) cellen en T cellen 1 weergegeven. In tegenstelling tot klassieke T-cellen, NKT cellen herkennen lipide antigeen in de context van CD1 moleculen 2. NKT cellen brengen een invariant chain TCRα omlegging: Vα14Jα18 in muizen en Vα24Jα18 in mensen, die gepaard gaat met Vβ ketens van beperkte diversiteit 3-6, en worden aangeduid als canonieke of invariante NKT (i NKT) cellen. Soortgelijke conventionele T cellen NKT cellen ontwikkelen van CD4-CD8-T-cellen thymus precursor na de passende signalering door CD1d 7. Het potentieel om NKT cellen te gebruiken voor therapeutische doeleinden is sterk toegenomen met de mogelijkheid te stimuleren en menselijke NKT cellen uit te breiden met α-galactosylceramide (α-GalCer) en verschillende cytokines 8. Belangrijk, deze cellen hun oorspronkelijke phenotype, uitgescheiden cytokinen en weergegeven cytotoxische werking tegen tumor cellijnen. Aldus ex vivo geëxpandeerde NKT cellen functioneel blijven kan worden toegepast voor adoptieve immunotherapie. Echter NKT-cellen gebaseerde immunotherapie beperkt door het gebruik van autoloog antigeen presenterende cellen en de kwantiteit en kwaliteit van deze stimulator cellen aanzienlijk variëren. Monocyt-afgeleide DC van kankerpatiënten werden gerapporteerd verlaagde costimulatoire moleculen uitdrukken en minder inflammatoire cytokines produceren 9,10. In feite hebben murine DC dan autologe APC gebruikt om de functie van NKT cellen van CML patiënten 11 testen. Dit kan echter slechts worden gebruikt voor in vitro testen, omdat NKT cellen kunnen niet worden uitgebreid door muizen DC en toegepast voor adoptieve immunotherapie. Zo kan een gestandaardiseerd systeem dat is gebaseerd op kunstmatige antigeen presenterende cellen (AAPC) produceren de stimulerende effecten van DC zonder de valkuilen van allo-of xenogene ceLLS 12, 13. Hierin beschrijven we een werkwijze voor het CD1d gebaseerde AAPC. Aangezien de betrokkenheid van de T cel receptor (TCR) van CD1d-antigen complexen een fundamenteel vereiste van NKT cel activatie antigeen CD1d-Ig complexen een betrouwbare methode te isoleren, activeren en vergroten effector NKT celpopulaties.

Hierin beschrijven we een werkwijze voor het CD1d-Ig based AAPC, door covalente koppeling van CD1d-Ig en anti-CD28 mAb aan magnetische kralen NKT cellen te stimuleren als standaardmethode voor de vermeerdering van NKT cellen (Figuur 1). Eerste moet men aantonen dat de CD1d-Ig-fusie-eiwitten stabiel worden geïmmobiliseerd op het oppervlak van de magnetische korrels. Zoals getoond in Figuur 2A, CD1d-Ig en anti-CD28 antilichamen werden zowel op het oppervlak van de magnetische korrels. De stimulerende capaciteit van de AAPC onderzoeken we samen gekweekt NKT-hybridoma &#39;s nachts met AAPC, geoogst en de kweeksupernatanten gemeten IL-2 door ELISA. We vonden dat CD1d-Ig based AAPC konden de NKT-hybridoma stimuleren op gelijk aan of hoger dan hun cellulaire tegenhangers (Figuur 3, gegevens niet getoond). Interessant vonden we dat onze muis NKT-hybridoma gestimuleerd door menselijke CD1d gebaseerde AAPC (Figuur 2B), die eenvoudige methode voor het testen van elke partij AAPC biedt. Vervolgens zochten we de mogelijkheden van verspreiding AAPC tonen, werden aldus humane T-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed. Eerste CD161 + CD3 + T celfractie werd verrijkt door magnetische korrels scheiding. Daarna werden de T-cellen gestimuleerd met tweewekelijkse α-GalCer-geladen AAPC. Belangrijker vonden we dat zelfs met een relatief lage initiële NKT-celpopulatie (0,03%), konden we de cellen uit te breiden tot ~ 67% Vα24 + + Vβ11 (figuur 3). We hebben uitgebreid NKT cellen uit de PBMC van vele gezonde vrijwilligers en kankerpatiënten en hebben gevonden dat α-GalCer loaded AAPC konden de NKT cellen uitbreiding populatie in beide groepen. Met name de uitbreiding tarief was zeer donor afhankelijk. Zoals verwacht hoe hoger de initiële populatie van Vα24 + cellen, hoe groter het percentage expansie. Bovendienbij gebruik van een uitgangspopulatie van 2 miljoen cellen CD161 + CD3 + T-cellen kan men&gt; 10 7 cellen te verkrijgen na twee expansie (tabel 1). Ongeveer 80-90% van de geëxpandeerde NKT cellen CD4 +, ~ 5% CD8 + en de resterende zijn waarschijnlijk CD4-CD8-dubbelnegatieve NKT cellen. Deze uitgebreide NKT cellen kunnen worden gebruikt voor functionele studies zie figuur 4A-C. We hebben gevonden dat onze ex vivo geëxpandeerd NKT cellen kunnen reageren op α-GalCer stimulatie en zijn krachtige producenten van IL-17A, TNF-α en IFN-γ. Er zij opgemerkt dat indien de initiële T-cel verrijking bevolking laag en een niet in staat is de tweede CD161 verrijkingsstap te voeren, de AAPC gemedieerde expansie niet de verwachte resultaten (zie figuur 4D, Donor 1) verkregen. Echter, indien het percentage van circulerende NKT cellen hoger is dan 0,1%, moet men nog steeds een aanzienlijke expansie verkrijgeni NKT cellen. Tezamen zijn deze gegevens aan dat CD1d based-AAPC kan worden gebruikt om effectief vergroten en stimuleren primaire humane NKT cellen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van CD1d: Ig-gebaseerde aAPCs extracellulaire gedeelten van de CD1d molecule worden gefuseerd aan het constante gebied van een immunoglobuline zware keten eiwit gescheiden door een korte aminozuur linker. Deze moleculen kunnen eenvoudig worden geladen lipide antigenen, zoals α-GalCer, eenvoudigweg door te incuberen met een overmaat van het lipide van belang. AAPC werden gemaakt door koppeling CD1d-Ig en anti-CD Abs aan magnetische korrels. In dit systeem wordt CD1d-Ig gebruikt om de cognate antigen-specifiek signaal levert via de TCR en anti-CD28 mAb geeft het co-stimulerende signaal. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. . FACS kleuring van oppervlakte-eiwitten op aAPCs A) aAPCs werden getest op de aanwezigheid van CD1d: IgG dimeer (via kleuring met PE-geconjugeerd anti-muis IgG1) en anti-CD28 antilichaam (met FITC-geconjugeerd anti-muis IgG2a) . Open histogrammen geven isotype controle; gevulde histogrammen geven de aangegeven antilichamen. CD1d-Ig uitdrukken AAPC kunnen stimuleren IL-2 productie door NKT cellen. B) De Vα14 + muis NKT cel hybridoma, DN32.D3, werd gekweekt samen met ofwel medium, oplosbaar antigeen (α-GalCer), gelost AAPC of α-GalCer-loaded AAPC. Kweeksupernatanten werden geoogst en standaard sandwich ELISA werd gebruikt om IL-2 productie te meten. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figuur 3. Uitbreiding NKT cellen door CD1d-Ig beklede kunstmatige antigen presenterende cellen. (A) Primaire CD3 + CD161 + dubbele positieve cellen werden geïsoleerd uit PBMC met magnetische scheiding. De gesorteerde cellen werden gestimuleerd met α-GalCer loaded, CD1d-Ig beklede AAPC gedurende 14 dagen. De cellen werden gekleurd voor Vα24 en Vβ11 volgende AAPC stimulatie. (B) primaire humane NKT cel gemedieerde lysis van B-cellymfoom lijn. C1R-CD1d NKT cellen geïncubeerd met cellen in de aangegeven verhoudingen in de aanwezigheid of afwezigheid van antigen, a-GalCer (100 ng / ml) in 96-well U-bodem platen gedurende 20-24 uur. NKT cel gemedieerde lysis werd bepaald door volgens standaard 51Cr-release assay. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figuur 4. Cytokine profielen van AAPC-geëxpandeerde NKT cellen. </strong&gt; Na stimulatie met α GalCer geladen AAPC gedurende twee weken, de uitgebreide NKT cellen (1 x 10 5 / putje) werden gekweekt samen met oplosbare α-GalCer, PMA / Ionomycine, anti-CD3/28 microbolletjes, of α-GalCer geladen AAPC (2 x 10 5 / putje) gedurende 48 uur. (A) IL-17A, (B) TNF-α en (C) IFN-γ productie werd gemeten door standaard ELISA cytokine. De getoonde gegevens zijn netto cytokine productie na aftrek van de negatieve controles (media en leeg kralen). (D) Primaire T-cellen werden geïsoleerd uit PBMC met magnetische korrels scheiding. De gesorteerde cellen werden gestimuleerd gedurende twee weken met de aanduiding a-GalCer geladen-AAPC. De cellen werden gekleurd met specifieke Abs voor Vα24 + en + Vβ11 en geanalyseerd door flowcytometrie.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het activeren en uitbreiden menselijke NKT cellen van bulk T-celpopulaties met kunstmatige antigen presenterende cellen (AAPC). Het gebruik van CD1d gebaseerde AAPC een gestandaardiseerde werkwijze voor het genereren van grote aantallen functionele NKT cellen.

Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

Natural killer T (NKT)-cellen zijn een unieke subset van T-cellen die markers vertonen die kenmerkend zijn voor zowel natural killer (NK)-cellen als T-cellen1. In tegenstelling tot ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van kunstmatige antigeenpresenterende cellen op basis van CD 1D, of A APC's, voor de expansie van NK T-cellen. Dit wordt bereikt door eerst eiwitten toe te voegen om de magnetische kralen te functionaliseren. In de tweede stap wordt de initiële NK T-celpopulatie uit het perifere bloed verrijkt.Vervolgens worden de verrijkte T-cellen gecocultureerd met de A A PC. In de laatste stap worden het fenotype en de functie van de A A PC-celpopulatie beoordeeld. Uiteindelijk kan de zuiverheid van de geëxpandeerde T-cel-subsets worden bepaald via flowcytometrische analyse. Het belangrijkste voordeel van APC's ten opzichte van huidige methoden die gebruikmaken van dendritische cellen is dat er bij dendritische cellen sprake kan zijn van een hoge donorvariabiliteit.aAPC's bieden een reproduceerbare, gestandaardiseerde kant-en-klare methode voor de expansie van NK T-cellen. We bedachten deze methode voor het eerst toen ik samenwerkte met dr. Schneck en collega's bij Johns Hopkins. Zij waren pioniers op het gebied van het gebruik van kunstmatige antigeenpresenterende complexen voor de expansie van klassieke CD8 T-cel-subsets.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. James East, postdoctoral fellow, en de zoon van Dr. Wendy, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Begin met het overbrengen van één milliliter dyna bead M four 50 epoxy beads in een geschroefde vial van vijf milliliter helder borosilicaatglas. Spoel de beads vervolgens met drie milliliter steriele bore eight buffer in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Voeg 100 micrograms menselijk CD 1D IG-dimeer en 20 micrograms van de gewenste co-stimulerende moleculen toe aan één milliliter calcium- en magnesiumvrije PBS. Plaats vervolgens het glazen vial met de beads op een magneet en aspireer de boraatbuffer. Voeg daarna het eiwitmengsel toe aan het glazen vial en sluit het dopje.Meng de oplossing onmiddellijk door het flaconje om te keren, dek vervolgens de dop af met parafilm en plaats het flaconje een nacht op een rotator bij vier graden Celsius tot de volgende dag. Plaats het glazen flaconje opnieuw op de magneet en verwijder het eiwitmengsel zorgvuldig, waarbij de kraaltjes worden vermeden. Was de kraaltjes drie keer door drie milliliter bead wash buffer toe te voegen en ze vijf minuten op de rotator bij vier graden Celsius te incuberen.Om te bevestigen dat de eiwitten stabiel op de beads zijn geladen, kleurt u een aliquot van de beads met antilichamen en analyseert u deze via flowcytometrische analyse. Draag vervolgens 5 × 10⁷ beads over naar een klein glazen buisje van 1,5 milliliter en spoel de beads met 1 milliliter steriele PBS. Doe dit vervolgens 48 tot 72 uur voor gebruik.Laad de gewassen beads met antigeen in één milliliter steriele PBS terwijl de beads worden geladen met antigeen. Verzamel de PBMC door eerst het gehepariniseerde donorbloed te verdunnen met een gelijk volume PBS bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 15 milliliter PHI op kamertemperatuur toe aan 50 milliliter conische buizen en breng langzaam 25 milliliter van het verdunde bloedmengsel aan bovenop de phi.Centrifuge de monsters vervolgens 30 minuten bij 700 ×g en kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld. Gebruik een Pasteurpipet om de lymfocyteninterface voorzichtig over te brengen naar een nieuwe conische buis van 50 ml. Was daarna de lymfocyten in 50 ml PBS, gooi het supernatant weg en breng de buizen van één enkele donor samen in één enkele buis.Nadat de PBMC opnieuw zijn gewassen met 20 milliliters PBS, telt u de cellen en resuspendeert u deze vervolgens in max buffer tot een concentratie van vijf keer 10 tot de macht zeven cellen per milliliter. Om de T-cel fractie te isoleren, incubeert u 100 microliters PAN T-cel verrijkingsoplossing uit de EP human T-cell enrichment kit met twee milliliters PBMC gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de oplossing vervolgens met 100 microliters magnetische beads gedurende nog eens 10 minuten bij kamertemperatuur.Vul het uiteindelijke volume van het oplosmiddel aan tot 2,5 milliliters en plaats de buis vervolgens in de magneet. Giet na vijf minuten snel de CD3-positieve fractie af in een conische buis van 15 milliliter. Was de cellen nu in vijf milliliters koude max-buffer en tel de levensvatbare cellen.Neem een aliquot af voor fact-kleuring om eerst de CD 1 61 positieve cellen te selecteren. Resuspendeer de verrijkte T-cellen in 980 microliters ijskoude max-buffer en incubeer de cellen vervolgens in 10 micrograms anti-CD 1 61 monoklonaal antilichaam gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Reconstitueer na het wassen van de cellen de pellet in 800 microliters max-buffer en 200 microliters anti-US IgG one microbeads.Incubeer deze oplossing nog 10 minuten bij vier graden Celsius. Terwijl de cellen incuberen met de microbeads, voegt u drie milliliters max buffer toe om een LS-kolom te equilibreren. Na het wassen van deze cellenfractie pipetteert u de cellen in drie milliliters max buffer langzaam in de kolom.Spoel de kolom nu drie keer met drie milliliter verse max-buffer. Voeg vervolgens nog drie milliliter verse max-buffer toe aan de kolom en breng de kolom over naar een conische buis van 15 milliliter. Druppel de gezuiverde CD 1 61-positieve CD 3-positieve cellen eruit en tel vervolgens de NKT-celverrijkte fractie.Begin deze stap door 10⁶ van de verrijkte CD161-positieve CD3-positieve T-cellen en 10⁶ AAPC's samen te kweken in 16 ml compleet medium. Platteer 160 µL van de co-cultuur per putje in een 96-wells U-bodemplaat van polystyreen met weefselcultuurbewerking en een dop met lage verdamping. Oogst en tel de cellen op dag 12 tot 14. Analyseer de populaties via flowcytometrische analyse en herhaal vervolgens de co-cultuur.De geëxpandeerde NKT-cellen zoals zojuist gedemonstreerd; vries de extra NKT-cellen in na de tweede expansironde. Om de functionaliteit van de A A PC-cellen te testen, co-kweek eerst 5 × 10⁴ NKT-cellen per well met 5 × 10⁵ A A PC in een eindvolume van 200 µL compleet medium in een 96-well U-bodemplaat. Oogst na 24 tot 48 uur het supernatant van de celkweek voor analyse via ELISA. Deze eerste figuur demonstreert dat de CD 1D IG-proteïnen stabiel zijn geïmmobiliseerd op het oppervlak van de magnetische kraaltjes, zoals hier wordt getoond.CD 1D IG en anti-CD 28-antilichamen worden beide tot expressie gebracht op het oppervlak van de magnetische kralen, zoals aangetoond in deze grafiek. Het V alpha 14-positieve muis NK T-cel hybridoma DN 30 2D drie werd gecocultureerd met ofwel medium oplosbare alpha-galactosylceramide-onbeladen A A PC of alpha-gal-beladen A A PC. De cultuursupernatanten werden vervolgens geoogst en de IL-2-productie werd gemeten via ELISA, wat een eenvoudige methode biedt voor het testen van elke batch antigeenpresenterende cellen. In dit experiment werden humane CD 1 61-positieve CD 3-positieve perifere bloed T-cellen verrijkt door middel van magnetische kraalscheiding.De cellen werden vervolgens gedurende 14 dagen één keer per week gestimuleerd met alpha galera geladen A A PC en geanalyseerd op V alpha 24 en V beta 11 expressie. Belangrijk is dat werd vastgesteld dat de cellen, zelfs met een relatief lage initiële NKT-celpopulatie van 0,03%, konden worden uitgebreid tot een populatie van ongeveer 67% V alpha 24 positieve V beta 11 positieve cellen. Hier werden C one R CD 1D cellen geïncubeerd met NKT-cellen in de aangegeven ratio's, in aanwezigheid of afwezigheid van Alpha Gal SER antigeen, in 96-wells U-bodemplaten gedurende 20 tot 24 uur.De door NKT-cellen gemedieerde cellysis van de B-cellymfomaleun werd vervolgens beoordeeld met een chroomrelease-assay. De in PC uitgebreide NKT-cellen waren in staat deze lymfoomcellijn te lyseren. In de aanwezigheid of afwezigheid van alfa-galactose zijn NKT-cellen uitgebreid uit de PBMC's van zowel gezonde vrijwilligers als kankerpatiënten, en de alfa-galactose is geladen.Een PC is in staat geweest om de NKT-celpopulaties van beide groepen uit te breiden. Bij gebruik van een startpopulatie van 2 miljoen CD161-positieve CD3-positieve T-cellen kunnen er na twee ronden van expansie meer dan 10⁷ cellen worden verkregen. De geëxpandeerde NKT-cellen kunnen worden gebruikt voor functionele studies, zoals hier wordt aangetoond.De ex vivo uitgebreide NKT-cellen blijven responsief voor stimulatie met Alpha GAL en zijn krachtige producenten van IL 17 A, TNF alpha en interferon gamma. Er moetlah worden opgemerkt dat indien de populatie bij de initiële T-celverrijking laag is en de tweede CD 1 61 verrijkingsstap niet kan worden uitgevoerd, de via A A PC gemedieerde expansie mogelijk niet de verwachte resultaten oplevert. Echter, als het percentage circulerende NKT-cellen hoger is dan 0,1%, zou er nog steeds een significante expansie van invariante NKT-cellen kunnen worden verkregen.Samen laten deze gegevens zien dat CD 1D-gebaseerde A A PC effectief kan worden gebruikt voor de expansie en stimulatie van primaire humane NK T-cellen na deze procedure. Andere methoden, zoals QPCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de kinetiek van NK T-celactivatie is na de ontwikkeling. Deze techniek plaveit de weg voor onderzoekers in het veld van de hepatologie om de rol van NKT-cellen bij leververvetting te onderzoeken.

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Natural Killer T-cellen (NKT) zijn bepalend voor de immuunrespons op kanker, regulering van autioimmunity, goedkeuring van de infectie, en de ontwikkeling van artheriosclerotic plaques. In dit interview, Mitch Kronenberg bespreekt zijn laboratorium zijn inspanningen om het mechanisme waardoor NKT-cellen worden geactiveerd door glycolipide antigenen te begrijpen.

Interview: glycolipide antigeen presentatie door CD1d en het therapeutisch potentieel van NKT-cel activatie

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

This video describes a protocol for isolating rare-antigen-specific CD8+ T cells using magnetic nanoparticle-based artificial antigen-presenting cells (aAPCs) functionalized with antigenic peptide-loaded MHC-Igs and anti-CD28 antibodies. Interaction of the aAPCs with CD8+ T cells specifically expressing the antigenic peptide-targeting T cell receptors, followed by their expansion in vitro, results in the enrichment and expansion of this CD8+ T cell population.

Nanoparticle-Based Enrichment and Expansion of Antigen-Specific CD8+ T Cells

T cellen die een CD19-antigen specifieke chimere receptor (CAR) worden toegediend als onderzoek behandeling van B-cel maligniteiten in de eerste-in-humane gentherapie trials. We beschrijven genetische modificatie van T cellen met behulp van...

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

Richtlijnen gepresenteerd voor het genereren van killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen, KaAPC, een efficiënt hulpmiddel voor in vitro depletie van humane antigeen-specifieke T-cellen en een alternatieve oplossing voor cellulaire immunotherapie voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten in een antigen specifieke manier, zonder afbreuk te doen aan de resterende immuunsysteem.

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient In Vitro Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

We beschrijven een snel en robuust protocol om invariante natural killer T (iNKT) cellen uit muizen milt te verrijken en in vitro uit te breiden tot geschikte aantallen voor in vitro en in vivo studies.

Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies

Hier presenteren we een methode om perifere bloed natural killer (PBNK), NK-cellen uit leverweefsels en chimere antigeenreceptor (CAR) -NK-cellen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (CB) uit te breiden. Dit protocol demonstreert de uitbreiding van NK- en CAR-NK-cellen met behulp van 221-mIL-21-feedercellen naast de geoptimaliseerde zuiverheid van geëxpandeerde NK-cellen.

Natural Killer (NK) en CAR-NK-celuitbreidingsmethode met behulp van membraangebonden-IL-21-gemodificeerde B-cellijn

Hier presenteren we een methode om menselijke iPSC-afgeleide chimere antigeenreceptor (CAR)-tot expressie brengende natural killer-cellen te differentiëren en uit te breiden met verbeterde doding tegen verschillende maligniteiten. Dit protocol demonstreert de differentiatie en uitbreiding van voor natural killer (NK) geoptimaliseerde iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen en de meting van antitumoractiviteit tegen verschillende tumorcellijnen.

Vooruitgang in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide chimere antigeenreceptor-expressie natuurlijke killercellen

Leer hoe u kunstmatige antigeen presenterende cellen (AAPC) gebruikt voor de activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen uit perifeer bloed. Deze gestandaardiseerde methode genereert grote aantallen functionele NKT-cellen.

Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

Meer video's verkennen