Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van kunstmatige antigeenpresenterende cellen op basis van CD 1D, of A APC's, voor de expansie van NK T-cellen. Dit wordt bereikt door eerst eiwitten toe te voegen om de magnetische kralen te functionaliseren. In de tweede stap wordt de initiële NK T-celpopulatie uit het perifere bloed verrijkt.

Vervolgens worden de verrijkte T-cellen gecocultureerd met de A A PC. In de laatste stap worden het fenotype en de functie van de A A PC-celpopulatie beoordeeld. Uiteindelijk kan de zuiverheid van de geëxpandeerde T-cel-subsets worden bepaald via flowcytometrische analyse. Het belangrijkste voordeel van APC's ten opzichte van huidige methoden die gebruikmaken van dendritische cellen is dat er bij dendritische cellen sprake kan zijn van een hoge donorvariabiliteit.

aAPC's bieden een reproduceerbare, gestandaardiseerde kant-en-klare methode voor de expansie van NK T-cellen. We bedachten deze methode voor het eerst toen ik samenwerkte met dr. Schneck en collega's bij Johns Hopkins. Zij waren pioniers op het gebied van het gebruik van kunstmatige antigeenpresenterende complexen voor de expansie van klassieke CD8 T-cel-subsets.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. James East, postdoctoral fellow, en de zoon van Dr. Wendy, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Begin met het overbrengen van één milliliter dyna bead M four 50 epoxy beads in een geschroefde vial van vijf milliliter helder borosilicaatglas. Spoel de beads vervolgens met drie milliliter steriele bore eight buffer in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Voeg 100 micrograms menselijk CD 1D IG-dimeer en 20 micrograms van de gewenste co-stimulerende moleculen toe aan één milliliter calcium- en magnesiumvrije PBS. Plaats vervolgens het glazen vial met de beads op een magneet en aspireer de boraatbuffer. Voeg daarna het eiwitmengsel toe aan het glazen vial en sluit het dopje.

Meng de oplossing onmiddellijk door het flaconje om te keren, dek vervolgens de dop af met parafilm en plaats het flaconje een nacht op een rotator bij vier graden Celsius tot de volgende dag. Plaats het glazen flaconje opnieuw op de magneet en verwijder het eiwitmengsel zorgvuldig, waarbij de kraaltjes worden vermeden. Was de kraaltjes drie keer door drie milliliter bead wash buffer toe te voegen en ze vijf minuten op de rotator bij vier graden Celsius te incuberen.

Om te bevestigen dat de eiwitten stabiel op de beads zijn geladen, kleurt u een aliquot van de beads met antilichamen en analyseert u deze via flowcytometrische analyse. Draag vervolgens 5 × 10⁷ beads over naar een klein glazen buisje van 1,5 milliliter en spoel de beads met 1 milliliter steriele PBS. Doe dit vervolgens 48 tot 72 uur voor gebruik.

Laad de gewassen beads met antigeen in één milliliter steriele PBS terwijl de beads worden geladen met antigeen. Verzamel de PBMC door eerst het gehepariniseerde donorbloed te verdunnen met een gelijk volume PBS bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 15 milliliter PHI op kamertemperatuur toe aan 50 milliliter conische buizen en breng langzaam 25 milliliter van het verdunde bloedmengsel aan bovenop de phi.

Centrifuge de monsters vervolgens 30 minuten bij 700 ×g en kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld. Gebruik een Pasteurpipet om de lymfocyteninterface voorzichtig over te brengen naar een nieuwe conische buis van 50 ml. Was daarna de lymfocyten in 50 ml PBS, gooi het supernatant weg en breng de buizen van één enkele donor samen in één enkele buis.

Nadat de PBMC opnieuw zijn gewassen met 20 milliliters PBS, telt u de cellen en resuspendeert u deze vervolgens in max buffer tot een concentratie van vijf keer 10 tot de macht zeven cellen per milliliter. Om de T-cel fractie te isoleren, incubeert u 100 microliters PAN T-cel verrijkingsoplossing uit de EP human T-cell enrichment kit met twee milliliters PBMC gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de oplossing vervolgens met 100 microliters magnetische beads gedurende nog eens 10 minuten bij kamertemperatuur.

Vul het uiteindelijke volume van het oplosmiddel aan tot 2,5 milliliters en plaats de buis vervolgens in de magneet. Giet na vijf minuten snel de CD3-positieve fractie af in een conische buis van 15 milliliter. Was de cellen nu in vijf milliliters koude max-buffer en tel de levensvatbare cellen.

Neem een aliquot af voor fact-kleuring om eerst de CD 1 61 positieve cellen te selecteren. Resuspendeer de verrijkte T-cellen in 980 microliters ijskoude max-buffer en incubeer de cellen vervolgens in 10 micrograms anti-CD 1 61 monoklonaal antilichaam gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Reconstitueer na het wassen van de cellen de pellet in 800 microliters max-buffer en 200 microliters anti-US IgG one microbeads.

Incubeer deze oplossing nog 10 minuten bij vier graden Celsius. Terwijl de cellen incuberen met de microbeads, voegt u drie milliliters max buffer toe om een LS-kolom te equilibreren. Na het wassen van deze cellenfractie pipetteert u de cellen in drie milliliters max buffer langzaam in de kolom.

Spoel de kolom nu drie keer met drie milliliter verse max-buffer. Voeg vervolgens nog drie milliliter verse max-buffer toe aan de kolom en breng de kolom over naar een conische buis van 15 milliliter. Druppel de gezuiverde CD 1 61-positieve CD 3-positieve cellen eruit en tel vervolgens de NKT-celverrijkte fractie.

Begin deze stap door 10⁶ van de verrijkte CD161-positieve CD3-positieve T-cellen en 10⁶ AAPC's samen te kweken in 16 ml compleet medium. Platteer 160 µL van de co-cultuur per putje in een 96-wells U-bodemplaat van polystyreen met weefselcultuurbewerking en een dop met lage verdamping. Oogst en tel de cellen op dag 12 tot 14. Analyseer de populaties via flowcytometrische analyse en herhaal vervolgens de co-cultuur.

De geëxpandeerde NKT-cellen zoals zojuist gedemonstreerd; vries de extra NKT-cellen in na de tweede expansironde. Om de functionaliteit van de A A PC-cellen te testen, co-kweek eerst 5 × 10⁴ NKT-cellen per well met 5 × 10⁵ A A PC in een eindvolume van 200 µL compleet medium in een 96-well U-bodemplaat. Oogst na 24 tot 48 uur het supernatant van de celkweek voor analyse via ELISA. Deze eerste figuur demonstreert dat de CD 1D IG-proteïnen stabiel zijn geïmmobiliseerd op het oppervlak van de magnetische kraaltjes, zoals hier wordt getoond.

CD 1D IG en anti-CD 28-antilichamen worden beide tot expressie gebracht op het oppervlak van de magnetische kralen, zoals aangetoond in deze grafiek. Het V alpha 14-positieve muis NK T-cel hybridoma DN 30 2D drie werd gecocultureerd met ofwel medium oplosbare alpha-galactosylceramide-onbeladen A A PC of alpha-gal-beladen A A PC. De cultuursupernatanten werden vervolgens geoogst en de IL-2-productie werd gemeten via ELISA, wat een eenvoudige methode biedt voor het testen van elke batch antigeenpresenterende cellen. In dit experiment werden humane CD 1 61-positieve CD 3-positieve perifere bloed T-cellen verrijkt door middel van magnetische kraalscheiding.

De cellen werden vervolgens gedurende 14 dagen één keer per week gestimuleerd met alpha galera geladen A A PC en geanalyseerd op V alpha 24 en V beta 11 expressie. Belangrijk is dat werd vastgesteld dat de cellen, zelfs met een relatief lage initiële NKT-celpopulatie van 0,03%, konden worden uitgebreid tot een populatie van ongeveer 67% V alpha 24 positieve V beta 11 positieve cellen. Hier werden C one R CD 1D cellen geïncubeerd met NKT-cellen in de aangegeven ratio's, in aanwezigheid of afwezigheid van Alpha Gal SER antigeen, in 96-wells U-bodemplaten gedurende 20 tot 24 uur.

De door NKT-cellen gemedieerde cellysis van de B-cellymfomaleun werd vervolgens beoordeeld met een chroomrelease-assay. De in PC uitgebreide NKT-cellen waren in staat deze lymfoomcellijn te lyseren. In de aanwezigheid of afwezigheid van alfa-galactose zijn NKT-cellen uitgebreid uit de PBMC's van zowel gezonde vrijwilligers als kankerpatiënten, en de alfa-galactose is geladen.

Een PC is in staat geweest om de NKT-celpopulaties van beide groepen uit te breiden. Bij gebruik van een startpopulatie van 2 miljoen CD161-positieve CD3-positieve T-cellen kunnen er na twee ronden van expansie meer dan 10⁷ cellen worden verkregen. De geëxpandeerde NKT-cellen kunnen worden gebruikt voor functionele studies, zoals hier wordt aangetoond.

De ex vivo uitgebreide NKT-cellen blijven responsief voor stimulatie met Alpha GAL en zijn krachtige producenten van IL 17 A, TNF alpha en interferon gamma. Er moetlah worden opgemerkt dat indien de populatie bij de initiële T-celverrijking laag is en de tweede CD 1 61 verrijkingsstap niet kan worden uitgevoerd, de via A A PC gemedieerde expansie mogelijk niet de verwachte resultaten oplevert. Echter, als het percentage circulerende NKT-cellen hoger is dan 0,1%, zou er nog steeds een significante expansie van invariante NKT-cellen kunnen worden verkregen.

Samen laten deze gegevens zien dat CD 1D-gebaseerde A A PC effectief kan worden gebruikt voor de expansie en stimulatie van primaire humane NK T-cellen na deze procedure. Andere methoden, zoals QPCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de kinetiek van NK T-celactivatie is na de ontwikkeling. Deze techniek plaveit de weg voor onderzoekers in het veld van de hepatologie om de rol van NKT-cellen bij leververvetting te onderzoeken.