Appetitieve Associatieve Olfactorische Learning in Drosophila Larven

Het doel van deze procedure is om hogere hersenfuncties te analyseren. In een eenvoudig model, DFA-larven, middels eetlust en associatief olfactoir leren. Dit wordt bereikt door eerst 30 gevoede larven in het derde stadium uit een voedingsbuisje te verzamelen.

Vervolgens worden de larven vijf minuten lang getraind op een Petrischaal met fructose als beloning en aan weerszijden een geurcontainer die octanol bevat als olfactorische stimulus. Daarna volgt een tweede trainingsfase van vijf minuten op een schaal zonder fructosebeloning en met geurcontainers aan weerszijden die amylacetaat bevatten. Na drie herhalingen van deze twee trainingsfasen worden de larven gedurende een test van vijf minuten zonder beloning blootgesteld aan geurcontainers aan tegenovergestelde zijden.

Uiteindelijk geeft de relatieve geurvoorkeur van een octanol ten opzichte van amylacetaat aan dat drosophila-larven een associatie kunnen vormen tussen olfactorische stimuli en een suikerbeloning, en dat dit kan worden gebruikt om associatief leren te bestuderen in een genetisch flexibel systeem. Deze methode, in combinatie met genetische interferentie van de neurale functie, kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van leren en geheugen, zoals welke neuronen de beloning signaleren, of welke neuronen noodzakelijk of voldoende zijn voor de acquisitie of het ophalen van een repetitief geheugen? Het demonstreren van de procedure zal anti a postop zijn.

Een promovendus uit mijn laboratorium maakt eerst 2,5% aros Petri-schalen zonder fructose. Om de fructose-schalen voor te bereiden, wordt de fructose toegevoegd aan het opgeloste aros, waarna het in de plaat wordt gegoten. Vervolgens wordt elk van deze schalen voorzien van een verschillend symbool om de experimentator te blinderen.

Het schaaltje met fructose is de conditioneringsbeloning en het gewone schaaltje is de niet-beloning. Bereid voor de conditioneringsstimuli in totaal drie aangepaste Teflon-geurcontainers voor met 10 µL pure 1-octanal. De deksels zijn voorzien van kleine gaatjes om verdamping van de geur mogelijk te maken.

Bereid vervolgens nog drie geurcontainers voor met 10 µL amylacetaat, verdund 1 op 50 in paraffineolie. Deze verdunning is even aantrekkelijk als de 10 µL puur octaal begin door 30 vliegen te verzamelen die voeden en niet dwalen, uit een voedingsvial.

Dit protocol kan op elk moment van de dag worden uitgevoerd. Het is onafhankelijk van circadiane ritmes. Breng de larven over naar een Petrischaal die een paar druppels kraanwater bevat en beweeg ze voorzichtig voor- en achteruit met een penseel.

Breng de larven vervolgens over naar een tweede Petrischaal waarin ook enkele druppels kraanwater aanwezig zijn. Controleer de larven op voedingspasta op hun lichaamswanden. Plaats de Petrischaal nu in de experimentele opstelling om de larven te trainen om geuren te associëren met een specifieke suikersignaal.

Plaats aan de linker- en rechterzijde van een van de twee typen schalen die als stimuli worden gebruikt een geurcontainer. In dit geval is er één octaal, maar de keuze is willekeurig aangezien de experimentator blind is voor de beloning. Plaats vervolgens de groep larven in het midden van de schaal.

Sluit het deksel en wacht vijf minuten terwijl de dieren worden blootgesteld aan de stimuli. Zorg ervoor dat de larven de oppervlaktespanning van de waterdruppel kunnen overwinnen, zodat ze niet vast komen te zitten en zich vrij kunnen bewegen. Plaats een nieuwe container met Amal-acetaat op een schone Petri-schaal.

Gebruik na vijf minuten een vochtige penseel om de larven over te brengen naar het tegenovergestelde type schaal, met de tegenovergestelde stimuli aan de linker- en rechterzijde. De geur is hier amylacetaat. Sluit na het overbrengen van de larven het deksel en laat de dieren vijf minuten verkennen.

Wanneer deze tijd is verstreken, is de eerste trainingsronde voltooid. Voer op dezelfde wijze als bij de eerste ronde nog twee trainingsronden uit. Verplaats de dieren met een vochtig penseel en stel hen in totaal drie keer bloot aan elke combinatie van stimulus en beloning.

Plaats voor de experimentele testlocatie verse geurcontainers, één van elk stimulus, op tegenovergestelde posities in een ongecoate agros only Petri-schaal. Verplaats de getrainde dieren naar het midden van de schaal. Sluit het deksel en wacht vijf minuten.

Gebruik na vijf minuten een sjabloon onder de petrischaal waarin duidelijk drie zones zijn gedefinieerd (links, rechts en midden) en tel het aantal larven in elke zone. De middelste zone staat voor een score van geen voorkeur, waardoor de analyse restrictiever wordt en minder vatbaar is voor bias. Selecteer tenslotte om het experiment te voltooien 30 nieuwe derde-instapvoedingslarven en herhaal de training en testen met de tegenovergestelde combinatie van beloning en stimuli.

Ga verder met het gebruik van dezelfde geurcontainers. Er zijn verschillende controletests nodig om vast te stellen of transgene dieren een normale verwerking van geurstoffen vertonen voor de beloningsstimuli. De test voor de voorkeur voor naïeve geuren begint met het verzamelen en wassen van 30 larven, zoals gedaan is bij de training en het testen.

Plaats vervolgens de larven op een agro rose petrischaal met slechts één stimulusbuisje aan één zijde. Sluit het deksel en wacht vijf minuten. Tel vervolgens, met behulp van het sjabloon, het aantal larven aan de nabije zijde, in het midden en aan de verre zijde van de schaal ten opzichte van de stimulus.

Voer deze test uit voor elke stimulus die in het experiment wordt gebruikt om de naïeve suikervoorkeur te testen. Bereid halve-halve petrischalen voor door de helft van de agar in een petrischaal weg te snijden en de lege ruimte te vullen met gesmolten agar van het andere type. Let erop dat beide helften in volume overeenkomen en dat er geen scherpe rand ontstaat.

Dit kan oefening vereisen met de voorbereide half-half schaal op kamertemperatuur, geplaatst 30 naïef, na het schoonmaken van de voeding. Plaats vervolgens de starlarven in het centrum van de schaal. Sluit het deksel en wacht vijf minuten.

Tel vervolgens, met behulp van het sjabloon, het aantal larven aan weerszijden en tel de larven in het midden. De beschreven procedure werd gebruikt om trenchgenische larven te trainen en te testen. Met gebruik van de voorbeeldstimuli werden de gegevens bijgehouden als het aantal larven in verschillende regio's van de petrischalen.

Na vijf minuten buiten deze datapreferentie werden indices berekend en werden prestatie-indexen afgeleid uit de wederzijds getrainde groepen. Omdat de geteste larven transgeen waren, werd er ook een keuze aangeboden tussen een gevulde geurcontainer en lucht, evenals een keuze tussen pure aroma's en aroma's plus een suiker. Een onderzoek van de berekende indexen in een boxplot onthulde dat de dieren in staat waren te leren om één octanol van ML-acetaat te onderscheiden met fructose-aroma's als eetlustbevorderende bekrachtiger.

De dieren herkenden beide stimuli als attractanten en vertoonden een naïeve voorkeur voor fructose-aroma boven aero. Dit experimentele paradigma is succesvol toegepast bij een breed scala aan olfactorische en visuele stimuli, evenals een breed scala aan belonende en straffende stimuli. Dit paradigma, in combinatie met de vele krachtige genetische manipulaties die beschikbaar zijn in drosophila, is bijzonder nuttig bij het ontleden van neurale netwerken; zo kan bijvoorbeeld door genetische manipulatie van specifieke sets neuronen, gedefinieerd door gal four-expressiepatronen, de functionele rol van deze neuronen in het leerproces van de eetlust worden beoordeeld.

Deze procedure kan, samen met genetische interferentie van de neuronale functie, worden gebruikt om de neurale netwerken van het larvale brein die betrokken zijn bij leren en geheugen te analyseren. Vanwege de eenvoud van het larvale brein kan dit worden bereikt tot op het niveau van een enkele cel.