Name: Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer hoe je biologisch actieve geurstoffen identificeert in de hommelhersenen met gaschromatografie en multikanaalopnames. Deze methode onthult hoe neuronen reageren op specifieke bloemvluchtige stoffen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie ​​IOS 1121692, en door de Universiteit van Washington Research Foundation.

1. Vluchtige Follection <ol><li> In dit voorbeeld worden vluchtige monsters van M. lewisii bloemen - een alpine wilde bloemen afkomstig uit Californië. Vluchtige stoffen worden verzameld via dynamische sorptie werkwijzen volgens Riffell et al.. 14. Kortom, deze werkwijze gebruikt een gesloten lus opvangsysteem waar bloemen bevinden zich in een Teflon zak. Met een inert vacuümpomp wordt de lucht rond de bloemen opgezogen door een &quot;trap&quot; uit een Pasteur pipet vol Porapak Q matrix. De retourlucht uit de pomp wordt gefilterd door geactiveerde kool. Na een bepaalde tijdsperiode, in ons geval 24 h wordt de Porapak Q matrix geëlueerd met een niet-polair oplosmiddel, typisch hexaan, het geconcentreerde extract verzamelen. Het extract wordt dan opgeslagen in -80 ° C tot analyse. Indien nodig kunnen de monsters vóór de analyse worden geconcentreerd onder een stroom stikstofgas. Tenzij het monster is al goed gekarakteriseerd, voert u een portie van het door eengaschromatograaf-massaspectrometer (GC-MS) voorafgaande identificeren vluchtige componenten met het monster. </li></ol> 2. Elektrofysiologische Voorbereiding <ol><li> Snij ongeveer 1 cm vanaf het einde van een 1.000 ul pipetpunt. Plaats een hommel (Bombus impatiens) in de basis van de pipetpunt en duw in de richting van het andere uiteinde van de tip tot alleen het hoofd wordt blootgesteld. </li><li> Smelt tandtechnische waspreparaten en schimmel het rond de blootgestelde hoofd, zorg ervoor dat de wax hecht op het samengestelde ogen voor de veiligheid en om de bij het hoofd volledig immobiel is. Zorg ervoor dat er geen wax te krijgen op de antenne van de honingbij. </li><li> Zodra het hoofd is veilig, een vierkant maken, raam-achtige, insnijding in het hoofd capsule met behulp van een scheermesje-breaker of de juiste maat scalpel om de cuticula te snijden. Met de blade-breaker, beginnen de dorsale zijde van het hoofd capsule, direct achter de antenne en grenzend aan een van de samengestelde ogen. Snijdeneen rechte lijn, van een verbinding met de contralaterale oog samengestelde oog. Na het snijden van een rechte lijn naar de andere samengestelde oog, het maken van een incisie dorsaal beginnen voordat het hoofd capsule bochten en eindigt nabij de thorax. Op dit punt begint te snijden naar de andere kant van de kop capsule. Ten slotte, wanneer een lijn is teruggebracht tot de andere kant, bezuinigen een lijn naar de uitgangspositie van de eerste incisie. Het is belangrijk verwijderen cuticula dat grenst aan de antenne, aangezien dit belemmert het inbrengen van de elektrode. </li><li> Zodra de cuticula wordt gesneden, gebruik een pincet om de bij cuticula, die dan zou moeten blootstellen van de bij hersenen en, nog belangrijker, de antennaal lobben te verwijderen. Onmiddellijk beginnen superfusing de hersenen met insect zoutoplossing, zodat de hersenen niet wordt uitgedroogde vorm. Nadat de hersenen wordt blootgesteld, zorgvuldig gebruik maken van een paar zeer fijne tang om de perineurale omhulsel te verwijderen direct boven de antennaal lobben. Wees voorzichtig niet tedoorboren de bij de hersenen met de tang. </li></ol> 3. Gaschromatografie met multi-channel recording <ol><li> De bee &quot;preparaat&quot; - gefixeerd in een buis met blootgestelde hersenen - is nu klaar voor elektrofysiologische opnames. Plaats de bij in een klem bevestigd aan een magnetische basis die zich op een lucht tafel. </li><li> Regelen van een infuuszak, stroomregelaar en buizen (gevuld met saline insect) zodat de zoutoplossing continu de hersenen superfuses. </li><li> Met behulp van een micromanipulator, insertareference elektrode, gemaakt van wolfraam draad, in het oog van de bijen. </li><li> Met een afzonderlijke micromanipulator Plaats de meerkanaals elektrode, zoals een spiraaldraad tetrode of silicium meerkanaals elektrode (Neuronexus Technologies) in de antennaal lobben van de honingbij. Deze electrode is verbonden met een voorversterker zoals S-3 TDT het systeem Z serie met de Z-bus bioamp processor van de TDT systeem. Uitvoer van de Gas Chromatogram de detector via een afgeschermde BNC kabel kan worden aangesloten op de versterker en data acquisitie systeem, dat zowel de neurale en GC signaal gesynchroniseerd. </li><li> Wacht ongeveer 30-60 minuten voor de neurale opnames te stabiliseren. Zodra de spontane activiteit en golfvorm van eenheden in de opname kanalen geworden consistent met een geur spuit de bij stimuleren en de respons van de opname kanalen om de geur te observeren. </li><li> Opnemen extracellulaire spikes van neuronen door auto-drempelen de opname kanalen 3,5 tot 5 sigma van het signaal op de individuele opname kanalen. Handmatig drempelwaarde kan nodig zijn voor sommige kanalen om besmetting van elektrische ruis te voorkomen. De actiepotentialen van neuronen zal verschijnen als spanningspieken in de opname kanaal. Wanneer het kanaal spanning de drempel overschrijdt, het systeem buffers en slaat de enkele milliseconden vóór en na het overschrijden van de drempelwaarde, waardoor takinga snap-shot van de golfvorm, of spike. </li><li> Direct naast de lucht tabel is de GC. Voor het injecteren van de bloemen-extract in de GC, zorg ervoor dat de methode voor de temperatuurverhoging van de GC run correct is. In ons voorbeeld gebruiken we een methode temperatuur vanaf 50 ° C gedurende 4 min gevolgd door een verhoging van de temperatuur met een snelheid van 10 ° C / min. tot 220 ° C, waarna wij het GC gedurende 6 min. We gebruiken een DB-5 GC kolom (J &amp; W Scientific, Folsom, CA, USA), met helium als draaggas. De inlaat is splitless, met een temperatuur tot 200 ° C. De vlamionisatiedetector temperatuur op 230 ° C. </li><li> Injecteer het extract steekproef van de bloemen headspace in het verwarmde injectiepoort van de GC om de geadsorbeerde vluchtige stoffen vrijkomen in de GC-kolom. Het effluent uit de kolom wordt gesplitst 1:1 tussen de vlamionisatiedetector (FID) en de bij antenne met een glazen &quot;Y&quot; connector (J &amp; W Scientific). Begin recording van de elektrode als je een monster te injecteren in het GC. </li><li> Na de GC run is voltooid, laat de bereiding rusten gedurende 5 tot 15 minuten. Vervolgens injecteren een monster in de GC of stimuleren de preparatie met enkele vluchtige verbindingen of mengsels van verbindingen. In deze laatste werkwijze voor het stimuleren van de bereiding worden pulsen van lucht van een constante luchtstroom omgeleid door een glazen spuit met een stuk filtreerpapier waarop de verbindingen zijn gedeponeerd. De geur stimulus werd gepulseerd met een elektromagnetische klep geactiveerd door de software. </li><li> Als eenheid activiteit plotseling stopt of verandert, controleer dan de zoutoplossing druppelen en laat de voorbereiding rusten gedurende 15 minuten. Als de spontane activiteit niet weer bij het oude niveau wordt het preparaat moet worden weggegooid en een andere bijen gebruikt, indien beschikbaar. </li><li> Na het experiment vast de hersenen met 5% formaline gedurende 20 min met de probe nog in het weefsel. Vervolgens accijnzen de hersenenen plaats deze in 2% glutaaraldehyde gedurende 4 uur, en vervolgens doe een gegradeerde ethanol uitdroging serie en duidelijk de hersenen met methylsalicylaat. Op basis van de vaststelling en verrekening van het weefsel, de locaties in de AL waar de elektroden doorboord het weefsel moet duidelijk waarneembaar zijn door confocale microscopie. </li></ol> 4. Data-analyse <ol><li> Analyseer de verzamelde gegevens na het experiment te scheiden en identificeren van de opgenomen neurale eenheden. Gebruik typische softwareprogramma&#39;s (Offline Sorter, MClust, en SClust) te scheiden golfvormen, of &quot;spikes&quot;, gebaseerd op spike vormen, zoals piek of dal amplitude, piek halve breedte, enz., of verminderde maatregelen (principale componenten) 17 , 18 (figuur 2). Alleen die clusters van pieken die gescheiden in de driedimensionale ruimte (PC1-PC3) en statistisch verschillend zijn van elkaar (multivariate ANOVA p &lt;0,05) (Figuur 2) voor verdere analyse. Raadpleegcitaat # s 17 tot 19 voor de volledige beschrijving van tetrode opname en spike-sorteren methodieken. </li><li> Tijdstempel pieken in elke cluster, en exporteer deze gegevens voor analyse met behulp van MATLAB of Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) naar raster percelen en vuursnelheid reacties (figuren 2, 3A) te creëren. </li><li> Identificeer de retentietijden van vluchtige stoffen met behulp van de gelijktijdig opgenomen GC-gegevens. Gebruik de retentietijden van de vluchtige stoffen, door de top van de piek van het chromatogram te onderzoeken apparaat reageert op die tijdstippen. </li><li> Om individuele eenheid reacties te onderzoeken door de GC run, bak het aantal pieken in de 100 msec intervallen en onderzoekt het tijdsverloop van de vuursnelheid reacties met betrekking tot de retentietijd van eluting vluchtige stoffen. De binning van pieken in 100 msec intervallen levert voldoende gegevens of signalen over het tijdsverloop van de neuronale respons op een geurstof elueren van GC. </li><li> Om EXAmijnen bevolking reacties op de verschillende eluting vluchtige integreren de vuursnelheid reacties van individuele eenheden over een bemonsteringsperiode 3 sec, 1,5 sec vóór en 1,5 sec na de retentietijd van de vluchtige (figuur 3). Deze periode is kenmerkend voor de duur van een vluchtige eluerende van GC. We tonen vuursnelheid reacties van de eenheden door kleurcodering hen (rood is een hoge vuursnelheid reactie; blauw is een lage respons) en het regelen van hen als een activiteit matrix waarbij elke rij die de ensemble reactie op de GC effluent (kolommen) ( figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory%3A+converging+evidence+for+common+principles+across+phyla%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla.</a> Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).</li>
<li>Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effects+of+floral+scent+in+an+insect-plant+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).</li>
<li>Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).</li>
<li>Alarcón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+between+visitation+and+pollen-transport+networks+in+a+California+plant-pollinator+community%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community.</a> Oikos. 119, 35-44 (2010).</li>
<li>Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Year-to-year+variation+in+the+topology+of+a+plant-pollinator+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network.</a> Oikos. 117, 1796-1807 (2008).</li>
<li>Riffell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+consequences+of+innate+preferences+and+olfactory+learning+in+hawkmoth-flower+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).</li>
<li>De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore-infested+plants+selectively+attract+parasitoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids.</a> Nature. 393, 570(1998).</li>
<li>Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+reception+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature. 464, 66-71 (2010).</li>
<li>Turner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-prolonged+activation+of+CO2-sensing+neurons+disorients+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes.</a> Nature. 474, 87-91 (2011).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1725(2010).</li>
<li>Syed, Z., Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+measurements+from+a+moth+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological measurements from a moth olfactory system.</a> J. Vis. Exp. (49), e2489(2011).</li>
<li>Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attractant+of+the+codling+moth%3A+characterization+with+electroantennogram+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique.</a> Science. 174, 297-299 (1971).</li>
<li>Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+coding+of+behaviorally+significant+odor+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures.</a> Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.</li>
<li>Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+behavior+in+the+moth+Manduca+sexta+in+response+to+complex+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).</li>
<li>Raguso, R. A., Pellmyr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+headspace+analysis+of+floral+volatiles%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods.</a> Oikos. 81, 238-254 (1998).</li>
<li>Rodriguez-Saona, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore-induced+blueberry+volatiles+and+intra-plant+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling.</a> J Vis Exp. , e3440(2011).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. , e1098(2009).</li>
<li>Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+large-scale+neuronal+ensembles+with+silicon+probes+in+the+anesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat.</a> J Vis Exp. , e3282(2011).</li>
<li>Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+representation+of+olfactory+mixtures+in+the+honeybee+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe.</a> European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).</li>
<li>Stökl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deceptive+pollination+system+targeting+drosophilids+through+olfactory+mimicry+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast.</a> Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).</li>
<li>Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elektrophysiologische+untersuchungen+von+chemo-+und+mechanorezeptoren+der+antenne+des+seidenspinners+Bombyx+mori+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).</li>
<li>Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroantennographic+detector%3A+a+selective+and+senstitive+tool+in+the+gas+chromatographic+analysis+of+insect+pheromones%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones.</a> Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).</li>
<li>Schneider, D., Boeckh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rezeptorpotential+und+nervenimpulse+einzelner+olfaktorischer+sensillen+der+insektenantenne%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).</li>
<li>Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+perception+of+oilseed+rape+Brassica+napus+%28Brassicaceae%29+volatiles+by+the+cabbage+seed+weevil+Ceutorhynchus+assimilis+%28Coleoptera%2C+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).</li>
<li>Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+natural+stimuli+in+the+rodent+main+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb.</a> Neuron. 50, 937-949 (2006).</li>
<li>Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+patterns+and+their+functional+implications+in+the+antennal+lobe+of+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> PLoS ONE. 6, e23382(2011).</li>
<li>Syed, Z., Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+olfactory+response+of+Culex+mosquitoes+to+a+human-+and+bird-derived+attractant%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Insect olfactorische-gemedieerde gedrag rijden veel verschillende processen, waaronder reproductie, host-selectie van locaties, en de identificatie van geschikte voedselbronnen. De studie van deze processen vereist het vermogen om de vluchtige stoffen die uit de bron, en het vermogen om die verbindingen die bemiddelen het gedrag identificeren identificeren. Complicerende zaken is dat geuren bestaan ​​uit tientallen tot honderden verschillende verbindingen die samen een unieke geur die anders wordt ervaren dan de afzonde...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van item </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Porapak Type Q 80 tot 100 mesh </td><td> Waters </td><td> WAT027060 </td><td></td></tr><tr><td> Reynolds Oven Tassen </td><td> Reynolds </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GC </td><td> Agilent </td><td> 7820A </td><td></td></tr><tr><td> GC kolom </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, Californië, USA </td><td> DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 urn) </td><td></td></tr><tr><td> Analytische helium draaggas </td><td> Praxair </td><td> HE K </td><td> 1 cc / min </td></tr><tr><td> 16-kanaals silicium elektrode </td><td> Neuronexus Technologieën </td><td> a4x4-3mm50-177 </td><td></td></tr><tr><td> Fijne draad NiCr, 0,012 mm diameter) </td><td> Sandvik Kanthal HP Reid </td><td> PX000004 </td><td> Voor het maken van custom tetrodes en stereotrodes </td></tr><tr><td> Pre-versterker </td><td> Tucker-Davis System </td><td> PZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> Versterker </td><td> Tucker-Davis System </td><td> RZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> Data acquisitie systeem - OpenEx suite </td><td> Tucker-Davis System </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Online spike-sortering software - SpikePac </td><td> Tucker-Davis System </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Offline spike-sortering software - Mclust Spike-sorteren toolbox </td><td> David Redish, Afdeling Neurowetenschappen, Universiteitof Minnesota </td><td> Gratis te downloaden op <a href="http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html" target="_blank">http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html</a> </td><td> MATLAB toolbox </td></tr></tbody></table>

identificatie van olfactorische vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-recordings (gcmr) in de insect antennaal lobe

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

Alle organismen bewonen een wereld vol van zintuiglijke prikkels die hun gedrags-en fysiologische reactie op hun omgeving te bepalen. Reukzin is vooral belangrijk in insecten, die hun olfactorische systemen te reageren op en onder complexe geur stimuli. Deze geuren roepen gedragingen die bemiddelen processen, zoals reproductie en habitat selectie 1-3. Bovendien, chemische detectie door insecten bemiddelt gedragingen die zeer belangrijk zijn voor de landbouw en de menselijke gezondheid, met inbegrip van bestuiving 4-6, herbivorie van voedingsgewassen 7 en overdracht van ziektes 8,9. Identificatie van olfactorische signalen en hun rol in insecten gedrag is dus belangrijk voor het begrijpen van zowel ecologische processen en menselijke voedselbronnen en welzijn. Tot op heden heeft de identificatie van vluchtige stoffen die insecten gedrag sturen is moeilijk en vaak vervelend. Huidige technieken omvattengaschromatografie gekoppelde electroantennogram opname (GC-EAG), en gaschromatografie gekoppelde enkele sensillen opnamen (GC-SSR) 10-12. Deze technieken bleken vitaal belang in de identificatie van bioactieve verbindingen. We hebben een methode ontwikkeld die gaschromatografie gekoppeld aan multi-channel elektrofysiologische opnamen (aangeduid als &#39;GCMR&#39;) van neuronen in de antennaal kwab (AL; van het insect primaire olfactorische centrum) maakt gebruik van 13,14. Deze state-of-the-art techniek stelt ons in staat om door te dringen hoe geur informatie is vertegenwoordigd in het insect hersenen. Bovendien, omdat neurale respons op geuren op dit niveau van verwerking geur zeer gevoelig vanwege de mate van convergentie van de antenne receptor neuronen in AL neuronen zal AL opnamen de detectie van actieve bestanddelen van natuurlijke geuren efficiënt en met hoge gevoeligheid. Hier beschrijven we GCMR en een voorbeeld geven van het gebruik ervan. Een aantal algemene stappen zijn INVOLmj in de detectie van bioactieve vluchtige en insecten reactie. Vluchtige stoffen moeten eerst worden verzameld uit bronnen van belang (in dit voorbeeld gebruiken we bloemen uit het geslacht Mimulus (Phyrmaceae)) en gekarakteriseerd als dat nodig is met behulp van standaard GC-MS technieken 14-16. Insecten worden bereid voor onderzoek met minimale dissectie, waarna een registratie-elektrode wordt in de antennelid kwab en meerkanaals neurale opname begint. Post-verwerking van de neurale gegevens blijkt dan welke specifieke geurstoffen belangrijke neurale reacties veroorzaken door het zenuwstelsel van een insect. Hoewel het voorbeeld we hier specifiek is voor bestuiving studies kunnen GCMR worden uitgebreid met een groot aantal studie organismen en vluchtige bronnen. Zo kan deze methode worden gebruikt bij de identificatie van geurstoffen aantrekken of afstoten vector insecten en plagen. Bovendien kan GCMR ook worden gebruikt om lokstof identificeren voor nuttige insecten zoals pollinators. De techniek kan worden uitgebreid naar niet-insect vakken.

In de assay met de GCMR M. lewisii bloemengeur, we injecteren 3 pl van het extract in de GC. Het totale aantal vluchtige elueren door de GC typisch 60-70 vluchtige stoffen. De geur van M. lewisii bestaat voornamelijk uit monoterpenoids, zoals β-myrceen (acyclisch) en α-pineen, waarbij de rest van de geur uit zes koolstof-vluchtige, zoals 2-hexanol en sesquiterpenoiden dat &lt;1% van de headspace omvatten. GCMR maakt gebruik van de gevoeligheid van neuronen...

Olfactorische signalen bemiddelen veel verschillende gedragingen in insecten, en zijn vaak complexe mengsels bestaat uit tientallen tot honderden vluchtige verbindingen. Met gaschromatografie met meerkanaals opname in het insect antennelid lobe beschrijven we een werkwijze voor de identificatie van bioactieve verbindingen.

Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe

Alle organismen leven in een wereld vol sensorische stimuli die hun gedragsmatige en fysiologische reactie op hun omgeving bepalen. Olfactie is ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van biologisch effectieve geurstoffen in complexe geuren via registraties in de hersenen van de hommel. Dit wordt bereikt door eerst gedragsmatig effectieve geuren te verzamelen en vervolgens de gaschromatograaf en de multichannel-registratiesystemen voor het experiment voor te bereiden. De derde stap is het prepareren en dissekeren van de hommelhersenen voor de neurale registraties in de antennale lobus.Het experiment wordt vervolgens uitgevoerd door de elektroden in een antennelob te plaatsen en de responsen op gepofte vluchtige stoffen te meten door analyse van de neurale activiteit als reactie op complexe geuren en hun individuele bestanddelen. Biologisch actieve geurstoffen verkregen via gaschromatografie kunnen worden geïdentificeerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere technieken zoals G-C-E-A-G is dus de gevoeligheid van de antennelastneuronen en het vermogen om te karakteriseren hoe neuronen in de hersenen reageren op specifieke florale vluchtige stoffen.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de gecombineerde elektrofysiologische en chemische analytische s

identification-olfactory-volatiles-using-gas-chromatography-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Elektrofysiologische reacties van olfactorische sensorische neuronen aan geurstoffen kan worden gemeten bij insecten met behulp van enkele sensillum opnames. In deze video artikel zullen we laten zien hoe je een sensillum opnamen in de antennes van de azijn fly uit te voeren...

Single Sensillum Opnamen in de Insecten Drosophila melanogaster En Anopheles gambiae</em

Multielectrode array (MEA) opnames een methode voor het bestuderen van de elektrische activiteit van grote groepen neuronen. Hier presenteren we de details van een MEA voorbereiding om op te nemen van de muis vomeronasale epitheel, terwijl tegelijkertijd het stimuleren van het weefsel.

Multielectrode Array Opnames van de Vomeronasal Epithelium

Insect olfactorische systemen bieden unieke mogelijkheden voor het opnemen van geurstof-geïnduceerde responsen in de vorm van electroantennograms (EAG) en enkele sensillum opnames (SSR), die de antwoorden worden samengevat van alle geurstof receptor neuronen (ORNs) gelegen op de antenne en van die ondergebracht in afzonderlijke sensilla, respectievelijk.

Elektrofysiologische metingen van een Moth olfactorisch systeem

Werkwijze snel scherm waardplant vluchtige door meting van de elektrofysiologische reactie van volwassen navel orangeworm...

Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

We tonen variaties van de extracellulaire multi-unit opname techniek om geur-reacties van de consument te karakteriseren in de eerste drie fasen van de ongewervelde olfactorische pad. Deze technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast aan ensemble activiteit onderzocht andere neurale systemen.

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

We beschrijven een protocol voor het gebruik van insectantennes in de vorm van elektroantennogrammen (EAG's) op autonome robots. Ons experimentele ontwerp maakt stabiele opnames binnen een dag mogelijk en lost individuele geurvlakken op tot 10 Hz op. De efficiëntie van EAG-sensoren voor olfactorische zoekopdrachten wordt gedemonstreerd bij het besturen van een robot naar een geurbron.

Met behulp van Insect Electroantennogram Sensoren op autonome robots voor olfactorische zoekopdrachten

Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geurstoffen met lage volatiliteit voor single-sensillum-opname van Drosophila- olfactorische receptorneuronen kunnen optreden die reageren op lang-keten-cutulaire feromonen.

Elektrofysiologische opname van<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in reactie op geurstoffen met lage volatiliteit

Minderjarige werknemers van de mier soorten Colobopsis explodens worden ontleed om te isoleren van de inhoud van de wasachtige opgeslagen in hun hypertrophied mandibulaire klier reservoirs voor latere oplosmiddel-extractie en analyse met gaschromatografie-massaspectrometrie. De aantekening en de identificatie van vluchtige bestanddelen met behulp van de open-source software MetaboliteDetector wordt ook beschreven.

Isolatie van de mandibulaire klier Reservoir inhoud van Borneose ' exploderende mieren (Formicidae) voor Volatilome analyse door GC-MS en MetaboliteDetector

Dit witboek beschrijft een gedetailleerde en zeer effectieve protocol voor één sensillum opnamen van de sensilla basiconica op de ook voor insecten monddelen.

Enkele Sensillum opnames voor Locust Palp Sensilla Basiconica

Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van de bloemige geur vluchtige stoffen uit bloeiende bloemen, met behulp van een niet-destructieve bemonsteringsprocedure.

Snelle verzameling van bloemige geur volatiles met een headspace vluchtige collectie techniek voor GC-MS thermische desorptie bemonstering

Fysiologisch, worden odorant receptoren geactiveerd door odorant moleculen in de fase van de damp ingeademd. Echter, meest in vitro systemen gebruiken vloeibare fase odorant stimulatie. Hier presenteren we een methode waarmee in vitro bewaking in real-time van odorant receptor activering op odorant stimulatie in damp fase.

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Leer hoe je biologisch actieve geurstoffen identificeert in de hommelhersenen met gaschromatografie en multikanaalopnames. Deze methode onthult hoe neuronen reageren op specifieke bloemvluchtige stoffen.

Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe (Video) | JoVE Journal

Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe

Meer video's verkennen