Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe
24 februari 2013
Olfactorische signalen bemiddelen veel verschillende gedragingen in insecten, en zijn vaak complexe mengsels bestaat uit tientallen tot honderden vluchtige verbindingen. Met gaschromatografie met meerkanaals opname in het insect antennelid lobe beschrijven we een werkwijze voor de identificatie van bioactieve verbindingen.
Het algemene doel van deze procedure is om biologisch effectieve odoranten in complexe zintuigen te identificeren door opnames in de bijenbrein. Dit wordt bereikt door eerst gedragseffectieve zintuigen te verzamelen en ten tweede de gaschromatograaf en multikanaals opnamesystemen voor te bereiden op het experiment. De derde stap is het voorbereiden en dissecteren van het bijenbrein voor de neurale opnames in de antenne van de antennelob.
Het experiment wordt vervolgens uitgevoerd door de elektroden in de antennelob in te brengen en de reacties op gepompte vluchtige stoffen te meten door analyse van de neurale activiteit in reactie op complexe zintuigen en hun individuele bestanddelen. Biologisch actieve odoranten verkregen door gaschromatografie kunnen worden geïdentificeerd. Dus het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere technieken zoals G-C-E-A-G, is de gevoeligheid van de antennebelasting neuronen en het vermogen om te karakteriseren hoe neuronen in de hersenen reageren op specifieke bloemvluchtige stoffen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat gecombineerde elektrofysiologische en chemische analytische stappen moeilijk te leren zijn vanwege de elektrofysiologische voorbereidingstechniek en de noodzakelijke stappen voor het verzamelen van headspace vluchtige stoffen. Hoewel deze techniek inzicht kan geven in de olfactorische verwerking van hommels, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals ziektefactoren zoals muggen of zoenluizen, of gewasongedierte zoals bladluizen of motten. Voor deze procedure is een referentie-elektrode gemaakt van wolfraamdraad op een micromanipulator op een tweede voorbereid.
Micro manipulator hebben een multikanaals elektrode, zoals een opgewonden draad, tede of siliconen multikanaals elektrode aangesloten op een voorversterker, hebben een gaschromatograaf met een uitgang op een afgeschermde BNC-tafel. De uitgang van de GC-detector is verbonden met de versterker en het data-acquisitiesysteem zodat zowel de neurale als GC-signalen gesynchroniseerd zijn. In dit voorbeeld is het GC-dragergas helium en bevindt zich in een DB vijf GC-kolom.
De GC gebruikt een split-list inlaat met de temperatuur ingesteld op 200 graden Celsius en heeft de temperatuur van de vlamionisatiedetector ingesteld op 230 graden Celsius. Nadat de monsters in de gc zijn verwarmd, wordt het effluent uit de kolom een op een gesplitst tussen de vlamionisatiedetector en de B-antenne met behulp van een glazen Y-connector. In dit voorbeeld wordt de GC gebruikt om vluchtige stoffen af te leveren die zijn verzameld door dynamische absorptie van Mimus Lewis eye bloemen, een alpine wilde bloem inheems in Californië.
Alternatief, in plaats van de gc te gebruiken, kunnen enkele vluchtige verbindingen of mengsels van verbindingen worden afgeleverd door luchtpulsen. Geschoten door een aparte glazen spuit die een stuk filterpapier bevat waarop de verbindingen zijn afgezet. De luchtpulsen worden afgeleid van een constante luchtstroom met behulp van een door een computer bestuurde elektromagneet geactiveerde klep.
Begin met de voorbereidingen door ongeveer een centimeter van het uiteinde van een pipettip van een milliliter af te snijden. Plaats een hommel in de basis van de pipettip en duw hem voorzichtig naar het andere uiteinde van de tip tot alleen het hoofd blootligt. Maak met gesmolten tandheelkundig was een mal rond het blootliggende hoofd.
De was moet zich aan de samengestelde ogen hechten om het hoofd volledig te immobiliseren, maar mag indien nodig de antenne niet raken. Gebruik kleine spelden om de antennes te immobiliseren. Maak vervolgens een vierkante venster-achtige incisie in de hoofdcapsule met behulp van een scherp mes zoals een micro-scalpel.
Begin met snijden direct achter de antenne en naast een van de samengestelde ogen. Snijd een rechte lijn tussen de ogen. Snijd vervolgens dorssaal totdat de hoofdcapsule naar het thorax curveert.
Vervolg de snede tot het andere uiteinde van de hoofdcapsule. Snijd ten slotte terug naar het begin om het vierkant te voltooien. Gebruik een pincet om de cuticula te verwijderen.
De cuticula naast de antenne moet worden verwijderd, anders zal deze de elektrode belemmeren zodra de hersenen worden blootgesteld. Super fuseer het weefsel onmiddellijk met insectensaline. Zorg ervoor dat de antennelobben goed worden blootgesteld.
Gebruik vervolgens een paar zeer fijne pincetten om de perineurale schede direct boven de antennelobben te verwijderen. Wees heel voorzichtig om de hersenen van de bij niet te puncteren met de pincetten. De bijenvoorbereiding is nu klaar voor elektrofysiologische opname.
Begin door de voorbereide bij aan een klem te bevestigen die is bevestigd aan een magnetische basis. Houd het superfused met insectensaline die wordt afgeleid van een reservoir met een stroomregelaar. Plaats nu de referentie-elektrode in het contralaterale hersenweefsel.
Plaats vervolgens de multikanaals elektrode in de antennelobben van de bij. Wanneer de elektroden op hun plaats zitten. Wacht 30 tot 60 minuten tot de opnames zijn gestabiliseerd.
Gedurende deze tijd bereid u voor op de extracellulaire spikes van neuronen door ook drempels te stellen. Manuele drempelstelling kan voor sommige kanalen vereist zijn vanwege ruis in de opnamekanalen. Controleer vervolgens of de temperatuuraandoening van de GC-run correct is.
In dit voorbeeld begint de temperatuur bij 50 graden Celsius gedurende vier minuten en stijgt vervolgens 10 graden per minuut tot een eindtemperatuur van 220 graden Celsius, of wordt gedurende zes minuten vastgehouden. Wanneer de golfvormen van de eenheden in de opnamekanalen consistent zijn geworden, worden de neurale opnames als stabiel beschouwd. Eenmaal gestabiliseerd, laadt u de spuit met het florale headspace-geur en injecteert u de geur in de hoofdinspuitpoort van de gc.
Begin dan onmiddellijk met opnemen vanaf de elektroden nadat de GC-run is voltooid. Laat de voorbereiding vijf tot 15 minuten rusten. Injecteer vervolgens een ander monster in de GC of stimuleer de voorbereiding met behulp van enkele vluchtige stoffen of mengsels van verbindingen.
Als op elk moment de spontane activiteit plotseling stopt of verandert, controleert u de zoutoplossing en laat u de voorbereiding 15 minuten rusten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het identificeren van biologisch effectieve geurstoffen bij insecten, specifiek door opnames in de hersenen van hommels. De methode omvat het verzamelen van gedragsrelevante geuren en het analyseren van de neurale reacties op deze complexe mengsels.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Gedragsbiologie
- Reukonderzoek
Achtergrond
- Insecten gebruiken reuksignalen voor verschillende gedragingen.
- Reuksignalen zijn vaak complexe mengsels van vluchtige verbindingen.
- Het begrijpen van deze signalen kan inzicht geven in het gedrag van insecten.
- Gaschromatografie is een belangrijke techniek voor het analyseren van deze verbindingen.
Doel van het onderzoek
- Biologisch actieve geurstoffen in complexe geuren identificeren.
- Neural activiteit meten als reactie op specifieke bloemenvluchtige stoffen.
- Het begrip verbeteren van hoe insecten reukinformatie verwerken.
Gebruikte methoden
- Verzameling van gedragseffectieve geuren.
- Voorbereiding van gaschromatograaf en meerkanaals opnamesystemen.
- Dissectie van de hommelhersenen voor neurale opnames.
- Inbrengen van elektroden in de antennekwab om reacties te meten.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van biologisch actieve geurstoffen door middel van gaschromatografie.
- Demonstratie van de gevoeligheid van neuronen in de antennekwab.
- Karakterisering van neurale reacties op complexe geuren.
- Vergelijking van deze techniek met andere methoden, waarbij de voordelen worden benadrukt.
Conclusies
- De methode identificeert effectief geurstoffen die het gedrag van insecten beïnvloeden.
- Neural opnames geven waardevolle inzichten in reukverwerking.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verder onderzoek in reukonderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Identifying bioactive volatiles that drive insect behavior is critical for agricultural biotechnology and vector control programs. The GCMR technique enables high-sensitivity detection of behaviorally active compounds by linking chemical analysis with neural responses in the insect brain. This supports target validation and assay development for pest management and pollinator attraction strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying volatiles that elicit significant neural responses in the antennal lobe.
- Operational Value: Provides biological de-risking through functional validation of odorant activity in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing behaviorally active compounds from inactive constituents in complex mixtures.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (bumblebee antennal lobe) for downstream screening of volatile libraries.
- Quantitative Outputs: Delivers measurable neural activity readouts that enable compound comparison and hit selection.
- Platform Reuse: Supports scalability across insect models including disease vectors and crop pests.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to identification of attractants or repellents for vector insects such as mosquitoes and kissing bugs.
- Translational Continuity: Bridges discovery through neural response confirmation to preclinical evaluation of volatile efficacy.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how specific volatiles are processed in the olfactory center, reducing ambiguity in behavioral outcome prediction.
Pipeline & Workflow Integration
The GCMR method fits within the discovery continuum from early target identification to lead optimization, particularly for behavior-modulating compounds in agricultural and public health applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking volatile exposure to neural activation patterns in the antennal lobe.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through synchronized GC and multi-channel neural recording.
- Analytics: Provides spike sorting and thresholding outputs that allow quantification of unit-specific responses to individual volatiles.
- Translational Research: Connects neural response data to behavioral relevance in pollination, herbivory, and disease transmission contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening volatile libraries across multiple insect species and ecological contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by detecting responses at the level of convergent neural processing.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized brain preparation, saline perfusion, and electrode stabilization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by prioritizing volatiles with robust neural responses, reducing investment in inactive compounds.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of lead volatiles based on neural efficacy and behavioral correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, electrophysiology, and gas chromatography synchronization.
- Dependent on multi-channel electrode systems, pre-amplifiers, and data acquisition capable of simultaneous GC and neural signal capture.
- Necessitates cross-team standardization for electrode placement, thresholding, and odor delivery consistency.
- Adaptation across model systems may require adjustments in brain exposure techniques and saline composition.
- Practical limitations include preparation stability duration and susceptibility to spontaneous activity loss during prolonged experiments.
