Name: Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Ontdek een high-content imaging workflow om Grb2-signaalcomplexen te bestuderen in HEK293-cellen via expressieklonen. Deze methode maakt visualisatie van eiwitinteracties op subcellulair niveau mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Medical Research Council en de Marie-Curie International Reintegration Grant regeling (tot JKV).

1. Picking cDNA Expression Clones <ol><li> De cDNA-bibliotheek wordt als losse bacteriële klonen in glycerol voorraad in een 96-well formaat. Met de Rearray commando in het menu van de picker Norgen CP7200, kies bacteriële klonen van de bron plaat en ent in 1,5 ml LB / amp in een 96-deepwell (1 ml well) plaat. </li><li> Dicht de deepwell platen met een gasdoorlatend afdichting en incubeer overnacht bij 37 ° C in een shaker. </li></ol> 2. Bereiding van cDNA Expression Library <ol><li> Draai de deepwell platen die de bacteriën bij 2000 rpm gedurende 20 min met adapters plaat in een tafelcentrifuge. </li><li> Zuig de putjes van media, waarbij de bacteriële pellet intact. </li><li> Configureert het dek van het Lab Automation werkstation zoals getoond in figuur 2. Oplossingen voor plasmidebereiding worden verdeeld in bakken 1-5 en de deepwell plaat aan dek. Een trog met multiwell elutieoplossinggeplaatst naast de deepwell plaat. Tips worden geladen in de punt rekken. </li><li> Monteer de vacuum manifold. Het plasmide verbindingsplaat is geplaatst in het verdeelstuk en het plasmide filter plaat wordt boven op het verdeelstuk. </li><li> Resuspendeer pellets met 250 ul Oplossing 1 (Resuspensie buffer) door op en neer pipetteren. </li><li> Lyse de bacteriën door toevoeging van 250 pi Oplossing 2 (lysisbuffer). De plaat wordt afgesloten en omgekeerd om volledige menging. </li><li> Start 2 min. timer. </li><li> Voeg 350 ul Oplossing 3 (neutralisatie buffer). Sluit de plaat en omkeren 3 keer. </li><li> Breng de bacteriële lysaten het plasmide filterplaten. </li><li> Toepassing vacuum gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het filter en plaats de bindende plaat op de top van het spruitstuk. Toepassing vacuum gedurende 1 min. </li><li> Voeg 500 ul van extra wassen (AW) buffer. </li><li> Toepassing vacuum gedurende 2 minuten. </li><li> Voeg 900 ul van wasbuffer Oplossing 4. Toepassing vacuum gedurende 2 minuten. </li><li> Herhaal step 2.14. Toepassing vacuum nog 15 min. </li><li> Plaats DNA collectie plaat in het spruitstuk. Voeg 100 ul elutiebuffer de verbindingsplaat en incubeer gedurende 2 minuten. </li><li> Vacuüm gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de collectie plaat en meet DNA-concentratie met behulp van de NanoDrop 8000. Typisch een opbrengst van ~ 100 ng / ul te verwachten met deze methode. </li></ol> 3. Cel Zaaien <ol><li> HEK293 cellen getrypsineerd en geteld. </li><li> 2 x 10 4 cellen gedispenseerd in elk putje van een PerkinElmer Viewplate met de ThermoFisher 96-well multidrop. </li><li> Cellen worden overnacht geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 4. Transfectie <ol><li> Bereid een mix van 100 ng GFP-Grb2 plasmide DNA met 100 ng cDNA in 25 ul serumvrij medium per putje in een ronde bodem 96-well plaat. </li><li> Voeg 25 ul serumvrij medium met 0,5 pl per well Transfectin. </li><li> Meng en start timer for 30 min. </li><li> Breng 50 pl cDNA / Transfectin mix aan cellen met een zachte afgifte methode. Als alternatief kan de transfectie mix eerst verdeeld in platen en cellen toegevoegd geplaatst (reverse transfectie). </li><li> Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 5. Image Acquisition <ol><li> Start Opera software. Een scherm snapshot van het experiment instelling wordt getoond in figuur 3. Selecteer de &quot;Configuratie&quot; tabblad en selecteer 20x objectief en de juiste plaattype. Zorg ervoor dat &quot;kraag&quot; is ingesteld op de juiste waarde van het doel mogelijk te maken richten met verschillende soorten platen. </li><li> Selecteer de &quot;Microscoop&quot; tabblad. Definieer blootstelling 1 als FITC (488 laser) en blootstelling 2 als UV (365 laser). Activeer de UV-filter op beide blootstellingen en wijs blootstelling 1 tot en met camera 1 en blootstelling 2 tot camera 2. Stel belichtingstijden tot 800 msec voor blootstelling 1 en 40 msec voor blootstelling 2. </li><li> Selecteer de &quot;Microscoop&quot; tabblad. Definieer eXposure 1 als FITC (488 laser) en blootstelling 2 als UV (365 laser). Activeer de UV-filter op beide blootstellingen en wijs blootstelling 1 tot en met camera 1 en blootstelling 2 tot camera 2. Stel belichtingstijden tot 800 msec voor blootstelling 1 en 40 msec voor blootstelling 2. </li><li> Selecteer blootstelling 1. Stel richten hoogte 0 micron. Selecteer &quot;Focus&quot;. Eenmaal gefocust, bloot camera 1. Pas de focus hoogte om de belichting vliegtuig te optimaliseren en op &quot;Take hoogte&quot; klikken. Wijzig de belichtingstijden en laservermogen tot een maximum pixel intensiteit van ~ 3.000 te geven. Sla blootstellingsparameters. Herhaal dit voor blootstelling 2. </li><li> Selecteer &quot;Experiment Definitie&quot; tabblad. Maak lay-out en sublayout. Sleep de desbetreffende lay-out, de belichting, referentiebeeld, skewcrop bestand en sublayout. Opslaan experiment. </li><li> Selecteer &quot;Automatisch Experiment&quot; tab en het verwerven van beelden. </li></ol> 6. Image Analysis (Gebaseerd op ImageJ 1.46h versie.) <ol><li> Converteer de eigen PerkinElmer. Flex-bestanden te Tagged Image Format. Tif-bestand met behulp van deFlex2Volocity Acapella script. </li><li><ol><li> Beelden importeren in ImageJ een reeks afbeeldingen, resulterend in een stapel. </li><li> Zet de stapel in een 2-kanaals HyperStack door het selecteren van de afbeelding / HyperStack / Stack om HyperStack menu-item. Het aantal segmenten moet worden ingesteld op de helft van de geïmporteerde stapel. </li><li> Dupliceer de GFP kanaal met de Image / opdracht Dupliceren: kruis het dupliceren HyperStack selectievakje in en geef kanalen: 1-1. Hierna gebruikt de gedupliceerde stack. </li></ol></li><li> Selecteer Proces / Enhance Contrast met 0,01% verzadigde pixels, met behulp van stapel histogram en om te zetten in 8 bit met Image/Type/8-bit. </li><li> Definieer een 15 pixel straal lokale adaptieve segmentatie met behulp van de Bernsen algoritme met contrast drempel (parameter 1) q = 30. Vink de Witte voorwerpen op zwarte achtergrond selectievakje in de Afbeelding / Aanpassen / Auto Lokaal Drempel menu. </li><li> Segmentatie kwaliteitscontrole: het genereren van gesegmenteerde object contour overlay op de originele beelden. </li><li> Featuopnieuw extractie door het analyseren van deeltjes: meetgebied, gemiddelde en totale intensiteit van elke organel. Sla resultaat bestanden. </li><li> Open de eigenschappen resultaat bestand in R en het genereren van een histogram. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Onder normale omstandigheden Grb2 gelokaliseerd in de hele cel. Na stimulering van een groeifactor receptor is verplaatst naar de plasmamembraan en wordt vervolgens geïnternaliseerd in endosomen zoals weergegeven in figuur 4. De expressie van een celoppervlak receptor kan binden Grb2 voldoende is om deze translocatie induceren. In een typisch experiment screening is geen verandering in GFP-lokalisatie Grb2 waargenomen. Wanneer echter een eiwit tot expressie dat rekruten Grb2 een subcellulaire site, een verandering in lokalisatie die gemakkelijk gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Bijvoorbeeld, expressie van de EGFR resulteert in herlokalisatie van GFP-Grb2 aan endosoom structuren (Figuur4). Dus bij toepassing van een genoomwijde bibliotheek kan worden verwacht dat nieuwe Grb2-bindende eiwitten van het celoppervlak worden geïdentificeerd. Deze methode is niet beperkt tot de detectie van celoppervlakteproteïnen. Zo Dynamin2 induceert een verandering in subcellulaire lokalisatie van GFP-Grb2 getoond endosoom-like recruitment (Figuur 5). Dynamin2 bindt aan de C-terminale SH3 domein van Grb2 en is betrokken bij dit complex endocytose van 9,10. Dus als uitgangspunt kan de identificatie van algemene eiwitbinding complexen en is niet beperkt tot de identificatie van interactiepartners voor het SH2-domein. Verschillende typen translocatie kan worden verwacht zoals lokalisatie naar de plasmamembraan te endosomen andere cytoplasmatische vesiculaire structuren of de kern. Derhalve wordt aanbevolen dat alle beelden ook gecontroleerd door oog. Echter, bij het screenen van grote hoeveelheden cDNA geautomatiseerdebeeldanalyse algoritme is meer praktisch. In dit geval wordt een combinatie van algoritmen wenselijk zoals spot detectie endosomen cytoplasma / nucleus detectie identificeren nucleaire shuttling en algemene morfologische algoritmes identificeren celvorm veranderingen te identificeren. Het gebruik van deze verschillende fenotypische detectiemethoden is besproken in meer detail elders 11. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Figuur 1. Algemeen schema van het experiment. Het experiment details een compleet high content workflow te beginnen met de versterking en de voorbereiding van de cDNA-bibliotheek, transfectie van cDNA vectoren plus reporterconstructen, beeldacquisitie en beeldanalyse met behulp van de gratis open software ImageJ. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Figure 2. Configuratie van de Tecan Deck. (1) Op de linkerkant, vijf 100 ml troggen moeten worden gevuld met buffers 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) en A4 (100 ml). Trog A4 moet eenmaal worden gevuld tijdens de procedure. (2) De vacuümbehuizing ligt op positie 14 in dit voorbeeld. (3) De plaat met deepwell bacteriële pellets ligt op positie 30, naast de elutiebuffer trog met 25 ml elutiebuffer. (4) Wegwerp tips voor de 8-kanaals head moeten worden geladen in de tip rekken aan de linkerzijde en tips voor de multichannel hoofd moeten worden ingevuld op positie 40. De Tecan FreedomEvo vloeistof handler die wordt gebruikt in dit experiment is uitgerust met 500 ul spuiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om groter bedrag bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> Figuur3. Automatisering van beeldacquisitie op de Opera LX. A) Selecteer het tabblad Configuratie (1). Laser activeren lijnen vereist voor het experiment (2). Selecteer de camera&#39;s voor beeldopname (3). Selecteer het plaattype en objectieflens voor de experiment (4). B) Selecteer de microscoop tab (1). Definieer de lichtbron en belichtingstijd voor blootstelling 1 (2,3). Focus op een goed en neem hoogte (4). C) Selecteer het Experiment tabblad Definitie (1). Sleep blootstelling, skewcrop, referentie, lay-out en sublayout bestanden (2). Sleep het experiment bestand (3). D) Selecteer Automatisch Experiment (1). Sleep experiment-bestand (2). Toekenning van passende barcode (3). Start beeldacquisitie door te klikken op de startknop (4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; Figuur 4. GFP-Grb2 translocatie van cDNA expressie. GFP-Grb2 verhuist van een overheersende cytoplasmatische lokalisatie naar endosoom structuren bij overexpressie van een transmembraan groeifactor receptor en vervolgens internaliseert te endosomen. Aan de linkerkant zijn microscopiebeelden van COS M6 cellen aangetoond dat tijdelijk waren getransfecteerd met GFP-Grb2 (boven) of GFP-Grb2 plus EGFR (onder). Co-expressie van de EGFR resulteert in verplaatsing van GFP-Grb2 aan endosoom structuren. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Figuur 5. Voorbeeld van cDNA-geïnduceerde translocatie van GFP-Grb2. De GTPase Dynamin2, die betrokken is bij Grb2 endocytose, verplaatst GFP-Grb2 aan endosoom structuren (omcirkeld). In dit experiment werd GFP-Grb2 gecotransfecteerd met DNM2 in HEK293T cellen. Cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 na 24 uur en beelden werden verkregen op Opera LX. Een zichtveld van de groene (GFP) kanaal en de UV (blue; Hoechst 33342) wordt weergegeven.

<ol><li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li>
<li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr%2FAbl+and+epidermal+growth+factor+receptor%3A+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li>
<li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li>
<li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feynman+trajectories%3A+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li>
<li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22in+Live+Cells.+ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li>
<li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li>
<li>Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789%2C+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li>
<li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Ash%2FGrb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li>
<li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li>
<li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+expression+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Expressieklonering is een krachtig hulpmiddel dat gebruikt is in het verleden nieuwe cellulaire componenten zoals virus receptoren en antigenen bloedcel 12 te identificeren. We beschrijven een methode voor de identificatie van nieuwe kandidaat signaaltransductie receptoren die binden aan Grb2 vergemakkelijken. Er zijn een paar kritische stappen in het protocol. <ol><li> Voor geautomatiseerde plasmide voorbereiding is het absoluut noodzakelijk om volledige resuspensie van de bacteriële pellet. Soms moet een strenge schudden stap of verder mengen met pipetten omvatten. </li><li> Na toevoeging van oplossing 2 en 3, volledige menging is essentieel en we hebben gevonden dat handmatig inverterende de gesloten plaat is efficiënter dan het gebruik van een geautomatiseerde shaker. Pipetteren dient vermeden te worden bij deze stap omdat het zou leiden tot afschuiven van het DNA. </li><li> In alle vacuum stappen men ervoor zorgen dat de vloeistof volledig wordt afgetaptvan de plaat. Anders lage opbrengsten te verwachten. </li><li> Na elutie is heel gebruikelijk dat eluaat vorm onderaan het plasmide verbindingsplaat verlaagt. Deze druppels moeten worden verzameld in de elutie plaat, dus het is aan te bevelen dat het plasmide binding plaat zorgvuldig wordt opgeheven en eventuele resterende druppels aan de onderkant worden zorgvuldig overgebracht naar het eluaat plaat. </li><li> Tijdens transfectie, de tijd van complexvorming is kritisch. We gewoonlijk voldoen aan 20-30 min. Langere tijden tot 1 uur zijn goed zonder vermindering in opbrengst, terwijl kortere tijden niet aanbevolen. </li><li> Voor de microscopie, de keuze van vergroting is belangrijk. Op de Opera LX-systeem hier wordt gebruikt, resolutie bij 20x is voldoende om beelden van hoge kwaliteit te krijgen. Als hogere resolutie vereist, het doel kan worden gewijzigd, maar om statistisch significante aantallen cellen te zijn een groter aantal velden en hogere Zoektijden vereist. In het algemeen streven wijten minste 100 cellen per putje afgebeeld te krijgen. </li></ol> De Grb2 translocatie assay is gebruikt door andere groepen kleine molecule inhibitoren van EGFR kinase activatie 6 identificeren. In dat geval wordt de EGFR ligand specifiek geactiveerd waardoor werving van Grb2 naar de plasmamembraan. Verstoring van deze interactie kan vervolgens worden onderzocht met kleine moleculen bestaan. Ook kan het mogelijk zijn dat siRNA schermen kunnen worden gebruikt om endogene genen in EGFR-signalering Grb2 of Grb2-bindende groeifactor receptoren zoals c-KIT of erytropoëtinereceptor identificeren. Zo zijn er verschillende mogelijke toepassingen voor deze techniek. Een analoge benadering kan worden toegepast op GFP-gemerkte reporter systemen voor andere adapter moleculen zoals Shc, Gab of IRS. Een groot voordeel van deze cel-gebaseerde test in zoogdiercellen is dat de identificatie van fysiologisch rel kunnenvante interacties. De assay is een indicatie voor eiwit complexvorming, maar nog belangrijker, de relevante interacties gecontroleerd op de juiste subcellulaire site. In dit verband deze techniek overwint artefacten andere eiwit-eiwit interactie methoden zoals yeast-two-hybrid of in vitro assays. Het moet echter worden opgemerkt, dat de indirecte interacties ook kan resulteren in Grb2 recruitment. Evenzo kan de transcriptionele opregulatie van bindingspartners worden geïnduceerd door cDNA expressie. Het onderscheid tussen deze mogelijkheden, moet het geschikte secundaire assays uitgevoerd om onderscheid te maken tussen directe en indirecte effecten binding. Kortom, de GFP-adapter molecuul translocatie test belooft een groot potentieel voor genoom-brede screening en drug discovery programma&#39;s.

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> cDNA bibliotheek </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gasdoorlatende afdichtingen </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin 96 Plasmide Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625,4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Vrijheid Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Met vacuüm manifold </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

een high-inhoud imaging workflow om grb2 signaalcomplexen studie door expression klonen

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signaaltransductie door groeifactorreceptoren essentieel is voor cellen proliferatie en differentiatie behouden en heeft strakke controle. Signaaltransductie geïnitieerd door de binding van een ligand aan een externe transmembraan receptor en de activering van stroomafwaartse signalering cascades. Een van de belangrijkste regulator van mitogene signalering is Grb2, een modulair eiwit bestaat uit een interne SH2 (Src homologie 2) domein geflankeerd door twee SH3 domeinen die enzymatische activiteit ontbreekt. Grb2 wordt constitutief geassocieerd met de GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via de N-terminale SH3 domein. De SH2 domein van Grb2 bindt aan groeifactorreceptoren op gefosforyleerde tyrosineresiduen aldus koppeling receptor activatie van de SOS-Ras-MAP kinase signalerende cascade. Daarnaast zijn andere rollen voor Grb2 als positieve of negatieve regulator van signalering en receptor endocytose beschreven. De modulaire samenstelling van Grb2 suggereert dat het kan koppelen aan verschillende receptoren en transduce signalen langs een veelheid van verschillende paden 1-3. Hier beschreven is een eenvoudige test die microscopie werving van Grb2 bewaakt naar de plasmamembraan. Het is een bewerking van een test waarmee veranderingen in subcellulaire lokalisatie van groen-fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Grb2 in reactie op een stimulus 4-6 meet. Plasmamembraan receptoren die Grb2 zoals geactiveerde Epidermale Groei Factor Receptor binden (EGFR) werven GFP-Grb2 aan het plasmamembraan op cDNA expressie en vervolgens verplaatsen naar endosomale compartimenten in de cel. Ter identificatie in vivo eiwitcomplexen van Grb2 Deze techniek kan worden gebruikt om een genoomwijde high-content scherm gebaseerd op veranderingen in Grb2 subcellulaire lokalisatie voeren. De bereiding van cDNA expressieklonen, transfectie en beeldacquisitie worden hieronder in detail beschreven. Vergeleken met andere genomische methoden voor eiwit interactie te identificeren partners, zoals gist-twee-hybrid, deze techniek kan de visualisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen de subcellulaire plaats van interactie met gewone microscopie gebaseerde bepaling. Vandaar dat beide kwaliteitskenmerken, zoals patronen van lokalisatie kan worden beoordeeld, en de kwantitatieve sterkte van de interactie.

Een high-content screening methode voor de identificatie van nieuwe signalering bevoegde transmembraanreceptoren beschreven. Deze methode is ontvankelijk voor grote schaal automatisering en maakt voorspellingen<em&gt; In vivo</em&gt; Eiwitbinding en de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen.

Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Signaaltransductie door groeifactorreceptoren is essentieel voor cellen om proliferatie en differentiatie in stand te houden en vereist een strikte controle. Signaal ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van interactiepartners van grab two middels cDNA-expressiecloning en het observeren van veranderingen in groen fluorescent eiwit-getagd Grab two. Dit wordt bereikt door in een tweede stap eerst een cDNA-bibliotheek voor te bereiden uit bacteriële lysaten. De cDNA's worden getransfecteerd in menselijke embryonale niercellen, wat zal leiden tot de expressie van het reporterconstruct samen met de genen van belang.Vervolgens worden de getransfecteerde platen geanalyseerd met de opera-microscoop om veranderingen in de lokalisatie van Grab2 in de cellen te visualiseren; de resultaten tonen via fluorescentiemicroscopie aan dat GFP-getagd Grab2 naar endosomen wordt gerekruteerd via de epidermale groeifactorreceptor. Het belangrijkste voordeel van deze techniek vergeleken met bestaande methoden, zoals het twee-hybride systeem, is dat interactiepartners van Grab2 geïdentificeerd kunnen worden in een fysiologische situatie waarin rekening wordt gehouden met de subcellulaire distributie van de interactiepartners.Hoewel deze methode kan worden gebruikt om signaaltransductie door Grab two te identificeren, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere eiwitten van belang. De cDNA-bibliotheek wordt geleverd als enkele bacteriële klonen in glycerolvoorraden.Gebruik in een 96-well formaat het re ray-commando in het picker-menu van de Hudson Rapid pick light. Pick bacteriële klonen van de bronplaat en inoculeer deze in 1,5 milliliters lb amp in een 96 deep well plaat. Sluit de deep well platen af met een gasdoorlatende seal en incubeer deze overnacht bij 37 degrees Celsius in een shaker. Centrifugeer de volgende dag de deep well platen met de bacteriën bij 2000 RPM gedurende 20 minuten.Zuig met behulp van plaatadapters in een tafelcentrifuge het medium uit de wells, waarbij het bacteriële pellet intact blijft. Configureer vervolgens het dek van het Tecan Freedom Evo Automation-workstation zoals hier wordt getoond. Verdeel de oplossingen voor plasmidapreparatie over troggen één tot vijf en plaats een deep well-plaat op het dek.Plaats een multi-well trough met alucian-oplossing naast de deep well plate en vul de tip racks met tips. Zet het vacuümmanifold in elkaar. De plasmid binding plate wordt in het manifold geplaatst en de plasmid filter plate wordt bovenop het manifold geplaatst. Resuspendeer de pellets met 250 µL van oplossing één.De Resus-suspensiebuffer toevoegen door herhaaldelijk op te zuigen en uit te pipetteren. Het is essentieel voor het succes van deze procedure dat de pellets volledig zijn geresuspendeerd. Indien het pipetteren niet volstaat om het pellet volledig te resuspenderen, kan een schudapparaat worden gebruikt.Zodra de pellets volledig zijn geresuspendeerd, worden de bacteriën gelyseerd door 250 µL lysisbuffer toe te voegen. Sluit de plaat af en keer deze om om volledige menging mogelijk te maken. Stel een timer in op twee minuten.Voeg vervolgens 350 µL van oplossing drie toe, de neutralisatiebuffer. Sluit de plaat af en keer deze drie keer om.Breng de bacteriële lysaten over naar de plasmid filterplaten. Pas gedurende vijf minuten vacuüm toe. Verwijder de filterplaat en plaats de bindingsplaat bovenop het vacuümsysteem.Pas gedurende één minuut vacuüm toe. Voeg 500 µL extra wasbuffer toe en pas gedurende twee minuten vacuüm toe. Voeg 900 µL wasbufferoplossing vier toe en pas gedurende twee minuten vacuüm toe.Voeg daarna opnieuw 900 µL wasbufferoplossing vier toe en pas gedurende 15 minuten vacuüm toe. Plaats de DNA-opvangplaat in het verzamelblok. Voeg 100 µL elutiebuffer toe aan de bindingsplaat en incubeer dit gedurende twee minuten.Pas gedurende 10 minuten vacuüm toe. Verwijder ten slotte de opvangplaat en meet de DNA-concentratie met de NanoDrop 8,000. Met deze methode kan doorgaans een opbrengst van ongeveer 100 ng/µL worden verwacht om deze procedure te starten.Nadat de hec 2 9 3 cellen zijn getrypsiniseerd en geteld, wordt een automatische dispenser gebruikt om 2 × 10⁴ cellen in elke put van een Perkin Elmer View plate aan te brengen. Incubeer de cellen overnacht bij 37 °C en 5% carbon dioxide ter voorbereiding op de transfectie.Gebruik de geautomatiseerde vloeistofhandler om het volgende mengsel in elke well van een 96-wells plaat met ronde bodem voor te bereiden: 100 nanograms GFP. Neem twee plasmid DNA met 100 nanograms CD NA in 25 microliters serumvrij medium. Voeg vervolgens 25 microliters serumvrij medium toe dat 0,5 microliters transfectine per well bevat, meng dit en start de timer voor 30 minuten.Breng na 30 minuten 50 µL van het cDNA-transfectiemengsel over naar de cellen. Gebruik hiervoor een zachte doseermethode. Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C en 5% CO2.Start de Opera-software om te beginnen met de beeldacquisitie. Selecteer het configuratietabblad en kies het 20x objectief en het juiste plaattype. Zorg ervoor dat de ring op het objectief op de juiste waarde is ingesteld om scherpstelling bij verschillende plaattypes mogelijk te maken.Selecteer vervolgens het microscoop-tabblad. Definieer belichting één als fite 4 88 laser en belichting twee als UV 365 laser. Activeer het UV-filter voor beide belichtingen en wijs de belichting toe.Eén naar camera één en belichting. Twee naar camera twee. Stel de belichtingstijden in op 800 milliseconden voor belichting één en 40 milliseconden voor belichting.Twee, selecteer belichting, stel de focushoogte in op nul micron. Selecteer focus zodra de focus is ingesteld. Belicht camera één.Pas de focushoogte aan om het belichtingsvlak te optimaliseren en klik op 'hoogte opnemen'. Sla de belichtingsparameters op en herhaal dit voor belichting twee. Selecteer het tabblad 'experimentdefinitie', maak een lay-out en een sublay-out aan.Sleep en laat de relevante lay-out, belichting, referentieafbeelding, scheefstand (skew), bijsnijdingsbestand en sublay-out op de juiste plek vallen. Sla het experiment op. Selecteer het tabblad voor automatische experimenten en neem beelden op onder normale omstandigheden.Grab two is gelokaliseerd in de gehele cel. Na stimulatie van een groeifactorreceptor transloceert het naar het plasmamembraan en wordt het vervolgens geïnternaliseerd in endosomen. In deze figuur toont het bovenste paneel COS-6-cellen die transiënt getransfecteerd zijn met GFP-grab two, waarbij de fluorescentie, zoals verwacht, over de gehele cel is verdeeld.Echter, in cellen die transient zijn getransfecteerd met GFP-Grb2 plus de celoppervlaktereceptor EGFR, relocateert Grb2 naar endosoomachtige structuren, zoals getoond in het onderste paneel. Wanneer een genome-wide library wordt toegepast, kan daarom worden verwacht dat nieuwe celoppervlakteproteïnen die aan Grb2 binden, kunnen worden geïdentificeerd. Deze methode is niet beperkt tot de detectie van celoppervlakteproteïnen.Zo induceert de GTPase DYNAMIN 2, die betrokken is bij Grb2-gemedieerde endocytose, een translocatie van Grb2. In dit experiment werd GFP-Grb2 samen met DNM2 getransfecteerd in HEK 293T-cellen. De relokalisatie van GFP-Grb2 naar endosoomachtige structuren wordt geïllustreerd door de cellen binnen de rode cirkels.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunoprecipitatie of biochemische assays, worden gebruikt om verdere vragen te beantwoorden, zoals of de interactie direct of indirect is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe expressieklonering kan worden gebruikt om subcellulaire eiwitinteracties te identificeren.

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Dit document beschrijft de methodologie om de chemotactische respons van leukocyten aan specifieke liganden bepalen en interacties tussen de receptoren op het celoppervlak en cytosolische eiwitten met behulp van live-cell imaging technieken.

Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Het doel van het huidige protocol was om een ​​methode die functioneel genomische analyses van mestcel secretie zal ontwikkelen. Het protocol is gebaseerd op kwantitatieve beoordeling van de release van een tl-reporter-gen cotrasfected met het gen van interesse en real-time analyses van de morfologie van de secretoire korrel's.

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Ontdek een high-content imaging workflow om Grb2-signaalcomplexen te bestuderen in HEK293-cellen via expressieklonen. Deze methode maakt visualisatie van eiwitinteracties op subcellulair niveau mogelijk.

Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Meer video's verkennen