Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van interactiepartners van grab two middels cDNA-expressiecloning en het observeren van veranderingen in groen fluorescent eiwit-getagd Grab two. Dit wordt bereikt door in een tweede stap eerst een cDNA-bibliotheek voor te bereiden uit bacteriële lysaten. De cDNA's worden getransfecteerd in menselijke embryonale niercellen, wat zal leiden tot de expressie van het reporterconstruct samen met de genen van belang.

Vervolgens worden de getransfecteerde platen geanalyseerd met de opera-microscoop om veranderingen in de lokalisatie van Grab2 in de cellen te visualiseren; de resultaten tonen via fluorescentiemicroscopie aan dat GFP-getagd Grab2 naar endosomen wordt gerekruteerd via de epidermale groeifactorreceptor. Het belangrijkste voordeel van deze techniek vergeleken met bestaande methoden, zoals het twee-hybride systeem, is dat interactiepartners van Grab2 geïdentificeerd kunnen worden in een fysiologische situatie waarin rekening wordt gehouden met de subcellulaire distributie van de interactiepartners.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om signaaltransductie door Grab two te identificeren, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere eiwitten van belang. De cDNA-bibliotheek wordt geleverd als enkele bacteriële klonen in glycerolvoorraden.

Gebruik in een 96-well formaat het re ray-commando in het picker-menu van de Hudson Rapid pick light. Pick bacteriële klonen van de bronplaat en inoculeer deze in 1,5 milliliters lb amp in een 96 deep well plaat. Sluit de deep well platen af met een gasdoorlatende seal en incubeer deze overnacht bij 37 degrees Celsius in een shaker. Centrifugeer de volgende dag de deep well platen met de bacteriën bij 2000 RPM gedurende 20 minuten.

Zuig met behulp van plaatadapters in een tafelcentrifuge het medium uit de wells, waarbij het bacteriële pellet intact blijft. Configureer vervolgens het dek van het Tecan Freedom Evo Automation-workstation zoals hier wordt getoond. Verdeel de oplossingen voor plasmidapreparatie over troggen één tot vijf en plaats een deep well-plaat op het dek.

Plaats een multi-well trough met alucian-oplossing naast de deep well plate en vul de tip racks met tips. Zet het vacuümmanifold in elkaar. De plasmid binding plate wordt in het manifold geplaatst en de plasmid filter plate wordt bovenop het manifold geplaatst. Resuspendeer de pellets met 250 µL van oplossing één.

De Resus-suspensiebuffer toevoegen door herhaaldelijk op te zuigen en uit te pipetteren. Het is essentieel voor het succes van deze procedure dat de pellets volledig zijn geresuspendeerd. Indien het pipetteren niet volstaat om het pellet volledig te resuspenderen, kan een schudapparaat worden gebruikt.

Zodra de pellets volledig zijn geresuspendeerd, worden de bacteriën gelyseerd door 250 µL lysisbuffer toe te voegen. Sluit de plaat af en keer deze om om volledige menging mogelijk te maken. Stel een timer in op twee minuten.

Voeg vervolgens 350 µL van oplossing drie toe, de neutralisatiebuffer. Sluit de plaat af en keer deze drie keer om.

Breng de bacteriële lysaten over naar de plasmid filterplaten. Pas gedurende vijf minuten vacuüm toe. Verwijder de filterplaat en plaats de bindingsplaat bovenop het vacuümsysteem.

Pas gedurende één minuut vacuüm toe. Voeg 500 µL extra wasbuffer toe en pas gedurende twee minuten vacuüm toe. Voeg 900 µL wasbufferoplossing vier toe en pas gedurende twee minuten vacuüm toe.

Voeg daarna opnieuw 900 µL wasbufferoplossing vier toe en pas gedurende 15 minuten vacuüm toe. Plaats de DNA-opvangplaat in het verzamelblok. Voeg 100 µL elutiebuffer toe aan de bindingsplaat en incubeer dit gedurende twee minuten.

Pas gedurende 10 minuten vacuüm toe. Verwijder ten slotte de opvangplaat en meet de DNA-concentratie met de NanoDrop 8,000. Met deze methode kan doorgaans een opbrengst van ongeveer 100 ng/µL worden verwacht om deze procedure te starten.

Nadat de hec 2 9 3 cellen zijn getrypsiniseerd en geteld, wordt een automatische dispenser gebruikt om 2 × 10⁴ cellen in elke put van een Perkin Elmer View plate aan te brengen. Incubeer de cellen overnacht bij 37 °C en 5% carbon dioxide ter voorbereiding op de transfectie.

Gebruik de geautomatiseerde vloeistofhandler om het volgende mengsel in elke well van een 96-wells plaat met ronde bodem voor te bereiden: 100 nanograms GFP. Neem twee plasmid DNA met 100 nanograms CD NA in 25 microliters serumvrij medium. Voeg vervolgens 25 microliters serumvrij medium toe dat 0,5 microliters transfectine per well bevat, meng dit en start de timer voor 30 minuten.

Breng na 30 minuten 50 µL van het cDNA-transfectiemengsel over naar de cellen. Gebruik hiervoor een zachte doseermethode. Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C en 5% CO2.

Start de Opera-software om te beginnen met de beeldacquisitie. Selecteer het configuratietabblad en kies het 20x objectief en het juiste plaattype. Zorg ervoor dat de ring op het objectief op de juiste waarde is ingesteld om scherpstelling bij verschillende plaattypes mogelijk te maken.

Selecteer vervolgens het microscoop-tabblad. Definieer belichting één als fite 4 88 laser en belichting twee als UV 365 laser. Activeer het UV-filter voor beide belichtingen en wijs de belichting toe.

Eén naar camera één en belichting. Twee naar camera twee. Stel de belichtingstijden in op 800 milliseconden voor belichting één en 40 milliseconden voor belichting.

Twee, selecteer belichting, stel de focushoogte in op nul micron. Selecteer focus zodra de focus is ingesteld. Belicht camera één.

Pas de focushoogte aan om het belichtingsvlak te optimaliseren en klik op 'hoogte opnemen'. Sla de belichtingsparameters op en herhaal dit voor belichting twee. Selecteer het tabblad 'experimentdefinitie', maak een lay-out en een sublay-out aan.

Sleep en laat de relevante lay-out, belichting, referentieafbeelding, scheefstand (skew), bijsnijdingsbestand en sublay-out op de juiste plek vallen. Sla het experiment op. Selecteer het tabblad voor automatische experimenten en neem beelden op onder normale omstandigheden.

Grab two is gelokaliseerd in de gehele cel. Na stimulatie van een groeifactorreceptor transloceert het naar het plasmamembraan en wordt het vervolgens geïnternaliseerd in endosomen. In deze figuur toont het bovenste paneel COS-6-cellen die transiënt getransfecteerd zijn met GFP-grab two, waarbij de fluorescentie, zoals verwacht, over de gehele cel is verdeeld.

Echter, in cellen die transient zijn getransfecteerd met GFP-Grb2 plus de celoppervlaktereceptor EGFR, relocateert Grb2 naar endosoomachtige structuren, zoals getoond in het onderste paneel. Wanneer een genome-wide library wordt toegepast, kan daarom worden verwacht dat nieuwe celoppervlakteproteïnen die aan Grb2 binden, kunnen worden geïdentificeerd. Deze methode is niet beperkt tot de detectie van celoppervlakteproteïnen.

Zo induceert de GTPase DYNAMIN 2, die betrokken is bij Grb2-gemedieerde endocytose, een translocatie van Grb2. In dit experiment werd GFP-Grb2 samen met DNM2 getransfecteerd in HEK 293T-cellen. De relokalisatie van GFP-Grb2 naar endosoomachtige structuren wordt geïllustreerd door de cellen binnen de rode cirkels.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunoprecipitatie of biochemische assays, worden gebruikt om verdere vragen te beantwoorden, zoals of de interactie direct of indirect is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe expressieklonering kan worden gebruikt om subcellulaire eiwitinteracties te identificeren.