Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen
30 oktober 2012
Een high-content screening methode voor de identificatie van nieuwe signalering bevoegde transmembraanreceptoren beschreven. Deze methode is ontvankelijk voor grote schaal automatisering en maakt voorspellingen In vivo Eiwitbinding en de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om interactiepartners van grab two te identificeren door CD NA expressiecloning en observatie van veranderingen in groen fluorescerend eiwit getagd Grab two. Dit wordt bereikt door eerst een CD NA-bibliotheek voor te bereiden uit bacteriële lysaten als tweede stap. De CDNa's worden getransfecteerd in menselijke embryonale niercellen, wat zal resulteren in expressie van het reporterconstruct samen met de genen van belang.
Vervolgens worden de getransfecteerde platen geanalyseerd op de opera microscoop om veranderingen in grab two lokalisatie door de cellen heen te visualiseren, resultaten worden verkregen die epidermale groeifactor receptor gemedieerde rekrutering van GFP getagd laten zien. Grab two naar endosomen op basis van fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met bestaande methoden zoals deze twee hybride is dat interactiepartners van grab two kunnen worden geïdentificeerd in een fysiologische situatie waarbij rekening wordt gehouden met de subcellulaire distributie van de interactiepartners.
Hoewel deze methode kan worden gebruikt om signaaloverdracht door Grab two te identificeren. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals andere eiwitten van belang. De CDNA-bibliotheek wordt verstrekt als enkele bacteriële klonen in glycerolstocks.
In een 96-well formaat met behulp van de re ray opdracht in het pickermenu van de Hudson Rapid pick light. Kies bacteriële klonen van de bronplaat en inoculeer in 1,5 milliliter lb amp in een 96 diepe welplaat. Zegel de diepe welpjes laat met een gasdoorlatende zegel en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius in een shaker Op de volgende dag, draai de diepe welpjes die de bacteriën bevatten 2000 RPM gedurende 20 minuten.
Gebruik plaatadapters in een tafelcentrifuge, aspireer media uit de wells en laat de bacteriële pellet intact. Configureer vervolgens het dek van de Tecan Freedom Evo Automation werkstation zoals hier getoond. Verdeel oplossingen voor plasmidevoorbereiding in troggen een tot vijf en plaats een diepe welplaat op het dek.
Plaats een multi-well trog met alucian oplossing naast de diepe welplaat laad tips in de tip racks. Monteer de vacuüm manifold. De plasmide binding plaat wordt geplaatst in de manifold en de plasmide filter plaat wordt geplaatst op de manifold. Ressuspenseer pellets met 250 microliter oplossing een.
De Ressuspensie buffer door up en down te pipetten. Ervoor zorgen dat de pellets volledig resuspendeerd zijn is cruciaal voor het succes van deze procedure. Een shaker kan worden gebruikt als een up en down pipetten de pellet niet volledig resuspendeert.
Zodra de pellets volledig resuspendeerd zijn, legt u de bacteriën door 250 microliter oplossing toe te voegen aan de lysis buffer. Verzegel de plaat en draai om om volledige menging te laten plaatsvinden. Zet een timer voor twee minuten.
Voeg vervolgens 350 microliter oplossing drie toe. De neutralisatie buffer. Verzegel de plaat en draai drie keer om.
Breng de bacteriële lysaten over naar de plasmide filter platen. Pas vacuüm toe gedurende vijf minuten. Verwijder de filter plaat en plaats de binding plaat bovenop de manifold.
Pas vacuüm toe gedurende één minuut. Voeg 500 microliter extra wasbuffer toe en pas vacuüm toe gedurende twee minuten. Voeg 900 microliter wasbuffer oplossing vier toe en pas vacuüm toe gedurende twee minuten.
Voeg daarna nogmaals 900 microliter wasbuffer oplossing vier toe en pas vacuüm toe gedurende 15 minuten. Plaats de DNA collectie plaat binnen de manifold. Voeg 100 microliter Elucian buffer toe aan de binding plaat en incubeer gedurende twee minuten.
Pas vacuüm toe gedurende 10 minuten. Verwijder ten slotte de collectie plaat en meet DNA concentratie met behulp van de NanoDrop 8.000. Typisch kan een opbrengst van ongeveer 100 nanogram per microliter worden verwacht met deze methode om deze procedure te starten.
Nadat hec 2 9 3 cellen worden trypsiniseerd en geteld. Gebruik een geautomatiseerde dispenser om tweemaal 10 tot de vier cellen in elke well van een Perkin Elmer View plaat te doseren, incubeer cellen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor transfectie.
Gebruik de geautomatiseerde vloeistofhandler om de volgende mix voor te bereiden in elke well van een ronde bodem 96, well plaat 100 nanogram van GFP. Grab two plasmide DNA met 100 nanogram van CD NA in 25 microliter serumvrij medium. Voeg vervolgens 25 microliter serumvrij medium toe dat 0,5 microliter transfect in per well mix bevat en start de timer voor 30 minuten.
Na 30 minuten, breng 50 microliter van de CDNA transfect in mix naar cellen over. Gebruik een zachte doseermethode. Incubeer cellen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Om te beginnen met beeldverwerving, start de opera software. Selecteer het configuratietabblad en selecteer het 20 keer objectief en het juiste plaattype. Zorg ervoor dat de collar ingesteld is op de juiste waarde op het objectief om focussen met verschillende plaattypen mogelijk te maken.
Selecteer vervolgens het microscooptabblad. Definieer blootstelling een als fite 4 88 laser en blootstelling twee als UV 365 laser. Activeer de UV filter op beide blootstellingen en wijs blootstelling toe.
Een aan camera een en blootstelling. Twee aan camera twee. Stel de blootstellingstijden in op 800 milliseconden voor blootstelling een en 40 milliseconden voor blootstelling twee.
Selecteer blootstelling een, stel focus hoogte in op nul micrometer. Selecteer focus eenmaal gefocust. Blootstel camera een.
Pas de focushoogte aan om het blootstellingsvlak te optimaliseren en klik op hoogte nemen. Sla blootstelling parameters op, herhaal voor blootstelling twee, selecteer experiment definitie tab, maak lay-out en sub lay-out.
Sleep en plaats de relevante lay-out, blootstelling, referentie afbeelding, scheefheid, crop file en sub lay-out. Sla het experiment op. Selecteer automatisch experiment tabblad en verwerf afbeeldingen onder normale omstandigheden.
Grab two is gelokaliseerd door de hele cel heen. Bij stimulatie van een groeifactor receptor, translozeert het naar het plasmamembraan en wordt vervolgens geïnternaliseerd in endosomen. In deze figuur toont het b
Overzicht
Dit artikel beschrijft een screeningsmethode met hoge inhoud voor het identificeren van nieuwe signaalbekwame transmembraane receptoren, geschikt voor grootschalige automatisering. De methode maakt voorspellingen mogelijk met betrekking tot in vivo eiwitbinding en de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Signaaltransductie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal voor het verduidelijken van cellulaire signaalroutes.
- Traditionele methoden reflecteren mogelijk niet nauwkeurig fysiologische omstandigheden.
- Screening met hoge inhoud maakt geautomatiseerde en efficiënte analyse mogelijk.
- GFP-labeling biedt visuele inzichten in eiwitlokalisatie.
Doel van Studie
- Om interactiepartners van Grab2 te identificeren met behulp van CDNA-expressieklonen.
- Om veranderingen in Grab2-lokalisatie te observeren als reactie op stimuli.
- Om bestaande methoden te verbeteren door een fysiologische context voor eiwitinteracties te bieden.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van een CDNA-bibliotheek uit bacteriële lysaten.
- Transfectie van menselijke embryonale niercellen met reporterconstructen.
- Analyse van getransfecteerde cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- Automatisering van plasmidevoorbereiding en celtransfectieprocessen.
Belangrijkste Resultaten
- GFP-gelabeld Grab2 is gelokaliseerd in de hele cel en transloceert naar het plasmamembraan bij stimulatie.
- Interactie met epidermale groeifactorreceptor leidt tot internalisatie in endosomen.
- De methode identificeert met succes eiwitinteracties in een fysiologische context.
- Resultaten wijzen op mogelijke toepassingen voor andere eiwitten van belang.
Conclusies
- De screeningsmethode met hoge inhoud is effectief voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- Deze benadering kan worden toegepast op verschillende signaalroutes buiten Grab2.
- Automatisering verhoogt de efficiëntie en schaalbaarheid van het screeningsproces.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
High-content imaging of Grb2 signaling complexes via expression cloning enables direct visualization of protein-protein interactions in mammalian cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This workflow provides quantitative and spatially resolved data on signaling complex formation, enhancing predictive confidence at the discovery-to-lead inflection point. The approach is broadly applicable for portfolio triage and prioritization of signaling pathway targets in oncology and cell signaling research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping Grb2 interaction networks in a physiological context.
- Supports biological de-risking by visualizing subcellular localization and complex formation in live mammalian cells.
- Facilitates functional target validation through quantitative assessment of protein recruitment and relocalization.
- Improves predictive confidence for advancing signaling pathway targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for high-content screening of protein-protein interactions.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative imaging outputs across cDNA libraries.
- Enables scalable, genome-wide identification of novel Grb2-binding proteins for downstream evaluation.
- Supports reliable compound or genetic perturbation screening by providing robust localization readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant signaling pathways by modeling Grb2 recruitment in mammalian cells.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling follow-up biochemical confirmation.
- De-risks mechanistic assumptions prior to in vivo model investment.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to Grb2 signaling dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This high-content imaging workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased screening strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing Grb2 complex formation in response to diverse stimuli.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput identification of interaction partners.
- Analytics: Delivers quantitative localization and recruitment metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and mechanistic continuity into preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and expression cloning platform adaptable to other signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales protein interaction screening in mammalian systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of signaling pathway assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content imaging, cell culture, and molecular cloning.
- Needs access to automated liquid handling, fluorescence microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation criteria.
- Adaptable to various mammalian cell lines and signaling proteins with appropriate construct design.
- Dependent on robust image acquisition and quantitative analysis pipelines for reliable outputs.
