Name: Het uitvoeren van vaginale lavage, Crystal Violet kleuring, en vaginale cytologische Evaluatie Mouse loopsheid Staging identificatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer vaginale lavage en Crystal Violet kleuring voor het bepalen van de voortplantingscyclus bij vrouwelijke muizen. Deze methode identificeert hormonale stadia door cytologische evaluatie van vaginale uitstrijkjes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Marc Leonard danken aan de Carleton Immersive Media Studio voor deskundige technische bijstand in videoproductie en bewerken en Dr Martin Bertrand van Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Laboratorium voor visueel model hulp. De auteurs zijn zeer erkentelijk het deskundig advies van Dr Marilyn Keaney en al haar toegewijde personeel aan de Universiteit van Ottawa Animal Care en veterinaire diensten. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) aan Salb, de CIHR Instituut voor Aging en strategische Training Initiative in Health Research / CIHR Training Program in Neurodegeneratieve lipidomics (TGF 96121) om Salb en SF, de Canadese Stichting voor Innovatie naar SF, Ontario Innovation Trust naar SF, en Autodesk onderzoek naar SF. ACM ontvangt een CIHR Banting en Best promotie award. NV ontvangt een post-professionele beurs van Institute of Aging en CIHR Training Program in neurodegeneratieve lipidomics.

1. Voorbereiden Reagentia <ol><li> Voor steriele vaginale lavage, autoclaaf dubbel gedestilleerd water (ddH 2 O) en bewaren in een goed afgesloten container bij kamertemperatuur totdat het nodig is. </li><li> Voor cytologisch onderzoek, voeg 0,1 g kristal violet poeder aan 100 ml ddH 2 O. Meng goed. Kristalviolet kleurstof (0,1%) worden opgeslagen in een hermetisch afgesloten verpakking bij kamertemperatuur totdat het nodig is. </li></ol> 2. Het verzamelen van vaginale cellen (vaginale lavage) <ol><li> Plaats een latex bol op het einde van een steriele 200 ul tip en stelt ongeveer 100 ul steriel ddH 2 O met de gradaties van de tip als een leidraad volume. </li><li> Til de muis uit haar kooi en plaats ze op de kooi hopper (deksel) met haar achterpoten / achterkant naar u toe. </li><li> Stevig vastpakken van de staart en verheffen de achterzijde. De muis zal nu alleen haar voorpoten grijpen de trechter. Op dit punt van de muis kan plassen. Zo ja, Wacht tot urineren stopt. Indien er urine links bij de ingang van het vaginale kanaal, kunt u de opening met een overmaat ddH 2 O met behulp van een aparte tip (dat wil zeggen, niet uw monstername tip) spoelen. </li><li> Plaats het uiteinde van de ddH 2 O gevulde tip bij de opening van de vagina zorg dat de opening niet doordringen vaginale (en cervicale) stimulatie schijndracht induceren in ratten 1,2. Recente rapporten suggereren muizen minder gevoelig hiertoe echter zorg moeten worden genomen om de mate van invasiviteit in herhaalde analyses 3 minimaliseren. </li><li> Zachtjes druk de lamp een kwart verdrijven de helft van de hoeveelheid water (~ 25-50 pl) bij de opening van vaginale kanaal. De vloeistof zal spontaan te zuigen in het kanaal zonder punt inbrengen. Langzaam laat de druk op de lamp. De vloeistof zal terug trekken in de punt. Vermijd het vrijgeven van de druk te snel om aspiratie van vloeistof te voorkomenin de lamp. Een tip gefiltreerd kunnen nuttig zijn voor dit doel. </li><li> Herhaal de vorige stap 4-5 keer met dezelfde tip, bol en vloeistof een voldoende aantal cellen te verkrijgen in een monster. </li><li> Plaats de vloeistof op glasplaatje, en laat de vlek volledig drogen bij kamertemperatuur. Na droging kunnen deze estrous uitstrijkjes direct worden gemerkt of bewaard en gekleurd later. </li></ol> 3. Cytologische kleuring met behulp van Crystal Violet * 4 <ol><li> Plaats de droge dia in een Coplin pot (of andere vergelijkbare kleuring schip) met de kristal violet kleuring voor 1 min. </li><li> Verwijderen om een tweede Coplin pot met ddH 2 O. Was de dia met ddH 2 O 1 minuut. Herhalen. </li><li> Verwijder de overtollige ddH 2 O van de randen van de dia met een lichte weefsel wisser, het vermijden van contact met de gekleurde uitstrijkjes. </li><li> Pipetteer ongeveer 15 pl glycerol bovenop het uitstrijkje en dekselslip. Als alternatief kunnen andere histologische montage reagentia worden gebruikt om een ​​permanente diffusievaste vlek verkrijgen. </li></ol> * De kleuring hier beschreven is het eenvoudigst kan worden uitgevoerd in een laboratorium. Andere methoden kunnen extra informatie. Bijvoorbeeld met behulp van Papanicolaou kleuring, kan de looptijd van kernhoudende epitheelcellen worden onderscheiden met minder rijpe cellen gekleurd turkoois en meer volwassen cellen roze-of oranje-gekleurd. Deze verschillen kunnen gebruikt worden om vroege of late stadium proestrus. 4 4. Vaginale Cytologie <ol><li> Onderzoek de uitstrijkjes onder een lichtmicroscoop te bepalen celtypes aanwezig. Microscopisch onderzoek moet onmiddellijk worden gedaan na kleuring als het kristal violet zal uit de cellen diffunderen na verloop van tijd, wanneer er gebruik glycerol voor afdekken. Microfoto worden gehouden op het moment van analyse cytologie documenteren. </li><li> Begin met het onderzoek van de entire uitstrijkje bij een lagere vergroting. Selecteer een representatieve gedeelte en verhuizen naar een hogere vergroting. Ziet verhoornde squamous epitheelcellen, leukocyten en / of kern epitheelcellen (representatieve resultaten, Figuur 1A-C). De verhouding van cellen die aanwezig zal u toelaten om de oestrische stadium van de muis te bepalen op het moment van het nemen van monsters (representatieve resultaten, Figuur 1D-G) en haar directe hormonale status (discussie, figuur 2). </li></ol> 5. Representatieve resultaten Cytologie: Drie primaire celtypen kunnen worden gedetecteerd in vaginale uitstrijkjes: (1) kernhoudende epitheelcellen (Figuur 1A), (2) verhoornde squameuze epitheelcellen (Figuur 1B), en (3) leukocyten (Figuur 1C). Kernhoudende epitheliale cellen hebben een licht gekleurd cytoplasma, donkerder gekleurd plasmamembraan, en een ovaal kern ( <strong&gt; Figuur 1A). Verhoornde squameuze epitheelcellen zijn egaal gekleurd zijn, meer veelhoekig van vorm dan hun kern epitheel voorgangers, en missen een kern (Figuur 1B). Polymorfonucleaire leukocyten kunnen worden onderscheiden van epitheelcellen door hun onregelmatige vorm, donkergekleurde kernen polymorfe, van geringe omvang (figuur 1C, zwarte pijlen). Moet urine verontreiniging aanwezig in de uitstrijkjes worden urinezuurkristallen gemakkelijk gedetecteerd door hun kristallijne structuren sterk af te verwachten celtypen (figuur 3). Als dit gebeurt, en obscure detectie van overheersende celtype, moet het uitstrijkje worden weggegooid en niet gebruikt voor het organiseren van doeleinden. Staging: De relatieve verhouding van celtypen waargenomen in uitstrijkjes kan worden gebruikt om het stadium van de loopsheid van de muis identificeren op de dag van de bemonstering (Figuur 1D-G). Tijdens pro-oestrus, cellen zijn vrijwel uitsluitendclusters van ronde, goed gevormde gekiemd epitheelcellen (Figuur 1D, representatieve cel aangegeven door witte pijl). Tijdens oestrus, worden de cellen voornamelijk verhoornde plaveiselcellen epitheelcellen, aanwezig in dicht op elkaar gepakte clusters (figuur 1E, vertegenwoordiger cel aangegeven met pijlpunt). Tijdens metestrus, kleine donkergekleurde leukocyten overheersen (Figuur 1F, vertegenwoordiger cel aangegeven met zwarte pijl). Verhoornde squamous epitheliale cellen worden waargenomen, vaak in fragmenten (Figuur 1F representatief cel aangegeven door zwarte pijl). Tijdens diestrus, zeldzame verhoornde squameuze epitheelcellen kunnen nog (figuur 1G, vertegenwoordiger cel aangegeven met zwarte pijlpunt), maar leukocyten nog steeds de overhand hebben (figuur 1G, vertegenwoordiger cel aangegeven met zwarte pijl). Metestrus kunnen worden onderscheiden van diestrus door het verschijnen van kernhoudende epitheelcellen in diestrus ( <stron<html> g&gt; Figuur 1G representatief cel aangegeven door witte pijl). <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Cytologisch onderzoek van vaginale uitstrijkjes kan worden gebruikt om estrous fase worden drie belangrijkste celtypes worden gedetecteerd in vaginale uitstrijkjes:. (A) kern epitheelcellen, (B) cornified squameuze epitheelcellen en (C) leukocyten. De verhouding van deze celtypen in de uitstrijkjes kan worden gebruikt om muizen (D) proestrus, (E) estrus, (F) metestrus of (G) diestrus zoals beschreven in representatieve resultaten identificeren. Zwarte pijlpunten in E, F en G wijs representatieve cornified squamous epitheliale cellen. Zwarte pijlen in C, F en G wijzen op representatieve leykocytes. Witte pijlen in D en G hoogtepunt vertegenwoordiger kernhoudende epitheelcellen. . Jpg &quot;alt =&quot; Figuur 2 &quot;/&gt; Figuur 2. Vaginaal uitstrijkje cytologie weerspiegelt onderliggende endocriene evenementen. Details zijn ook aanwezig in discussie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4389/4389fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Urinezuurkristallen aanwezig kunnen volgende kristalviolet kleuring van urine-verontreinigde monsters zijn. (A) Kristallen transparant zijn en kunnen van verschillende grootte (pijlen en boxed regio vergroot in de (B)). Geen cellen aanwezig in dit gebied. Mocht urinezuur kristallen verontreiniging in gebieden gebruikt voor cytologische vlekken aanwezig zijn, kan het moeilijk zijn om nauwkeurig te identificeren celtypen aanwezig en het uitstrijkje moet worden weggegooid. Schaal bar = 50 um.

<ol><li>Adler, N. T., Zoloth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copulatory+behavior+can+inhibit+pregnancy+in+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats.</a> Science. 168, 1480-1482 (1970).</li>
<li>Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+copulatory+behavior+on+hormonal+change+in+the+female+rat+prior+to+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation.</a> Physiology. 5, 1003-1007 (1970).</li>
<li>Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating-induced+neuroendocrine+responses+during+pseudopregnancy+in+the+female+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse.</a> Journal of. 21, 30-39 (2009).</li>
<li>Hong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+mouse+estrus+cycle+in+response+to+BRCA1+inactivation+suggest+a+potential+link+between+risk+factors+for+familial+and+sporadic+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer.</a> Cancer research. 70, 221-228 (2010).</li>
<li>Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+menstrual+cycle%3A+basic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The menstrual cycle: basic biology.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).</li>
<li>Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferrin+expression+in+the+mouse+reproductive+tract+during+the+natural+estrous+cycle%3A+correlation+with+circulating+estradiol+and+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone.</a> Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).</li>
<li>Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+pituitary+concentrations+of+LH%2C+FSH%2C+and+prolactin+in+aging+C57BL%2F6+mice+at+various+times+of+the+estrous+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+aging%22%5BJournal%5D)">Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle.</a> Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).</li>
<li>Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+surge+in+pro-oestrous+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats.</a> Nature. 264, 461-463 (1976).</li>
<li>Rajendren, G., Gibson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+microscopic+study+of+synaptic+inputs+to+gonadotropin-releasing+hormone+cells+in+mouse+brain%3A+regional+differences+and+enhancement+by+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen.</a> Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).</li>
<li>Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+stimulating+hormone+is+required+for+ovarian+follicle+maturation+but+not+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility.</a> Nature. 15, 201-204 (1997).</li>
<li>Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH-induced+ovulation+in+intact+and+hypophysectomized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproduction+and+fertility%22%5BJournal%5D)">FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice.</a> Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).</li>
<li>Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+menstrual+cycle+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+reproduction+science%22%5BJournal%5D)">The normal menstrual cycle in women.</a> Animal reproduction science. , 124-229 (2011).</li>
<li>Appelgren, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+drug+interference+with+progesterone+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproduction+and%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis.</a> Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).</li>
<li>Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DHEA+and+metformin+on+corpus+luteum+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice.</a> Reproduction. 138, 571-579 (2009).</li>
<li>Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+control+of+corpus+luteum+formation%2C+function%2C+and+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression.</a> Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).</li>
<li>Rudolph, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+overt+menstruation+in+intact+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Induction of overt menstruation in intact mice.</a> PLoS One. 7, e32922(2012).</li>
<li>Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+anoestrus+in+mice+caged+in+groups%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+endocrinology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of anoestrus in mice caged in groups.</a> The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).</li>
<li>Lamond, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stimulation+derived+from+other+animals+of+the+same+species+on+oestrous+cycles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice.</a> The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).</li>
<li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL%2F6J+mice%3A+I.+Cycle+frequency%2C+length+and+vaginal+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).</li>
<li>Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+studies+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL%2F6J+mice%3A+II.+Cessation+of+cyclicity+and+the+duration+of+persistent+vaginal+cornification%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification.</a> Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).</li>
<li>Van Der Lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+physiologica+et+pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).</li>
<li>Van Der Lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+physiologica+et+pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).</li>
<li>Armaiz-Pena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+modulates+ovarian+carcinoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).</li>
<li>Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+the+Whitten+effect+in+female+mice+by+synthetic+analogs+of+male+urinary+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten. Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Ottawa Animal Care Comite en de Canadese Raad van Animal Care in te stellen.

Deze veranderingen in cel typologie zijn indicatief van de onderliggende endocriene evenementen. De proestrus fase van de loopsheid overeenkomt met de menselijke folliculaire fase van de menstruele cyclus 5 en wordt gedefinieerd door een pre-ovulatoire verhoging van de circulerende 17-β-oestradiol niveaus 6, alsmede een kleine stijging van prolactine 7 (figuur 2, pro-oestrus, linker paneel). De verhoging van 17-β-estradiol stimuleert indirect gonadotropin releasing hormone neuronen in de hypothalamus en septum dat op zijn beurt reactieve cellen te activeren op de hypofysevoorkwab om luteïniserend hormoon en follikelstimulerend hormoon vrij in de circulatie 8,9 (figuur 2 , Proestrus, linker paneel). In uitstrijkjes dieren genomen in proestrus cellen bijna uitsluitend ovaal kernhoudende epitheelcellen (Figuur 1D, fig. 2 Proestrus, rechter paneel). De piek van het follikel-stimulerend Hormeen niveau signalen ovulatie en toegang tot estrus 10,11. Tijdens oestrus, 17-β-oestradiol-spiegels afnemen en prolactine niveaus een piek 6,7 (figuur 2, Estrus, linker paneel). Vaginale uitstrijkjes worden gekenmerkt door bijna exclusieve detectie van onregelmatig gevormde cornified squamous epitheliale cellen vaak in groepjes (Figuur 1E, figuur 2 Estrus, rechter paneel). Inwerking metestrus samenvalt met een voortdurende stijging van progesteron niveaus 6 en komt overeen met het begin van menselijke luteale fase 12 (figuur 2 Metestrus, linkerpaneel). Zoals progesteron niveaus beginnen te stijgen en er een kleine stijging in 17-β-oestradiol in reactie op corpus luteum activatie 6,13,14 (figuur 2 Metestrus, linkerpaneel). De celtypes aanwezig in vaginale uitstrijkjes tijdens deze fase zijn gefragmenteerd, verhoornde epitheelcellen en kleinere donkerder gekleurd leukocyten (Figure 1F, fig. 2 Metestrus, rechter paneel). Tenslotte inwerkingtreding diestrus bij muizen voorkomt en circulerende progesteron piek 6, overeenstemmend met het menselijk late luteale fase 12. Regressie van het corpus luteum leidt tot een volgende scherpe daling van progesteron levels 15,16 (figuur 2, Diestrus, linker paneel). Leukocyten overheersen in uitstrijkjes tijdens diestrus. De frequentie van verhoornde epitheelcellen verlaagd en gekiemd epitheelcellen beginnen vlak voor overgang naar proestrus (Figuur 1G, figuur 2 Diestrus, rechter paneel) worden gedetecteerd. Samenvattend kan dit eenvoudige, routinematige protocol worden gebruikt om de dagelijkse hormonale schommelingen te schatten en oestrische fase in experimentele muizen vast te stellen zonder dat de voortplanting beschouwd indien de volgende voorzorgsmaatregelen worden getroffen. Bemonstering niet meer worden uitgevoerd dan eenmaal daags met de niet-invasieve protocol deschier ribed vergeleken met herhaalde penetratie van de vagina, aspiratie en agitatie. Dit kan vaginale irritatie leidt tot een ontstekingsreactie 17 waardoor leukocyten en andere celtypen aanwezig in uitstrijkjes die cytologisch onderzoek kunnen beïnvloeden. Bovendien, zelfs in kolonie gehuisvest vrouwen, is het normaal om uitgebreide diestrus en oestrus stadia te zien in verschillende muizen en inductie van anestrous 18 en deze identificatie is nuttig bij de interpretatie van hormonale effecten in de reproductieve, geslacht en ziekte studies. Variabiliteit in cycluslengte wordt geïntroduceerd met de leeftijd en van woningcorporaties verschillen binnen kolonies (individueel of in groep-behuizing) van de vrouwen 7,19-21. Vrouwtjes gehuisvest in vrouwelijke alleen-kolonies kunnen ophouden fietsen en voer een toestand van langdurige diestrus 18,22,23 maar fietsen kan hervat worden door blootstelling aan kooien voorbehandeld met mannelijke urine te fietsen 24,25 lokken. Dus om vast individual cycluslengtes voor een bepaalde muis wordt aanbevolen dat de niet-invasieve evaluatie beschreven dagelijks worden uitgevoerd met zorg tot twee volledige cycli waargenomen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td></tr><tr><td> 200 ul steriele pipet tips </td><td> Diamed </td><td> E340901 </td></tr><tr><td> Latex gloeilamp (1 ml) </td><td> Visser </td><td> 03-488-21 </td></tr><tr><td> Glazen objectglaasjes </td><td> Visser </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Kristalviolet kleurstof (25 g) </td><td> Visser </td><td> C581-25 </td></tr><tr><td> Lichte Tissue Ruitenwissers </td><td> VWR </td><td> 82003-820 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Visser </td><td> BP229-1 </td></tr><tr><td> Microscoop Dekglas (22x30) </td><td> Visser </td><td> 12-544A </td></tr></tbody></table>

het uitvoeren van vaginale lavage, crystal violet kleuring, en vaginale cytologische evaluatie mouse loopsheid staging identificatie

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Een snelle methode beoordelen voortplantingsstatus in knaagdieren is niet alleen nuttig in de studie van reproductieve dysfunctie, maar is ook vereist voor de productie van nieuwe muismodellen van de ziekte en onderzoek naar de hormonale regulatie van weefselafbraak (of regeneratie) na challenge pathologische. De muizen reproductieve (of oestrische) cyclus is verdeeld in 4 fasen: pro-oestrus, oestrus, metestrus, en diestrus. Gedefinieerd schommelingen in bloedspiegels van de ovariële steroïden 17-β-oestradiol en progesteron, luteïniserend de gonadotropines en follikel stimulerend hormonen en luteotropic prolactine signaalovergang door deze reproductieve fasen. Veranderingen in cel typologie binnen de murine vaginale kanaal weerspiegelen deze onderliggende endocriene gebeurtenissen. Dagelijkse beoordeling van de relatieve verhouding van kernhoudende epitheelcellen, verhoornde squameuze epitheelcellen en leukocyten in vaginale uitstrijkjes kan worden gebruikt om muizen oestrische identificerenstadia. De mate van invasiviteit echter werkzaam in het verzamelen van deze monsters kunnen reproductieve status veranderen en ontlokken een ontstekingsreactie die cytologische beoordeling van uitstrijkjes kunnen verwarren. Hier beschrijven we een eenvoudige, niet-invasieve protocol dat gebruikt kan worden om de fase van de loopsheid van een vrouwelijke muis te bepalen zonder dat haar voortplantingscyclus. We detail hoe onderscheid te maken tussen de vier stadia van de oestrische cyclus van verzameling en analyse van de overheersende cel typologie in vaginale uitstrijkjes en laten we zien hoe deze veranderingen kunnen worden geïnterpreteerd met betrekking tot endocriene status.

Hier beschrijven we hoe u de fase van het murine reproductieve (pro-oestrus, oestrus, metestrus of diestrus) door een eenvoudige, niet-invasieve verzamelen en cytologische beoordeling van de vaginale uitstrijkjes te identificeren. Verder hebben we beschrijven hoe vaginale cytologie weerspiegelt circulerende hormoonspiegels ten grondslag liggen aan de transitie door de murine voortplantingscyclus.

Het uitvoeren van vaginale lavage, Crystal Violet kleuring, en vaginale cytologische Evaluatie Mouse loopsheid Staging identificatie

Een snelle methode voor het beoordelen van de reproductieve status bij knaagdieren is niet alleen nuttig bij het bestuderen van reproductieve disfunctie, maar is ook vereist voor de ...

Alle procedures die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn verricht in overeenstemming met de richtlijnen en regelgeving vastgesteld door het Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa en de Canadian Council on Animal Care. Een snelle methode om de reproductieve status van knaagdieren te beoordelen is niet alleen nuttig bij de studie naar reproductieve dysfunctie, maar is ook vereist voor de productie van nieuwe muismodellen voor ziekten en onderzoek naar de hormonale regulatie van weefseldegeneratie of -regeneratie na een pathologische uitdaging. Hier beschrijven we hoe het stadium van de reproductieve cyclus van vrouwelijke muizen op een willekeurige dag kan worden geïdentificeerd door middel van een eenvoudige, niet-invasieve cytologische beoordeling van het dominante celtype in vaginale uitstrijkjes.De spiegelende reproductieve cyclus of oestruscyclus is onderverdeeld in vier fasen. Proestrus, oestrus, metestrus en diestrus definiëren de fluctuaties in de circulerende spiegels van de ovariële steroïden 17 beta estradiol en progesteron, de gonadotropines luteïniserend hormoon en follikelstimulerend hormoon, waarbij het luteotropine prolactine de overgang tussen deze reproductieve fasen signaleert. De proestrusfase van de oestruscyclus komt overeen met de folliculaire fase van de menselijke menstruatiecyclus en wordt gekenmerkt door een pre-ovulatoire stijging van de circulerende 17 beta estradiol-spiegels, evenals een kleine piek in prolactine.De stijging van 17 beta estradiol wordt gevolgd door een toename van de circulerende spiegels van luteïniserend hormoon en follikelstimulerend hormoon. De piek in de spiegels van follikelstimulerend hormoon signaleert de ovulatie en de overgang naar ES. Tijdens ES-stress dalen de spiegels van 17 beta estradiol in prolactinespiegels.De piek van de overgang naar met estrus valt samen met een kleine stijging van de circulerende spiegels van het follikelstimulerend hormoon en komt overeen met het begin van de luteale fase bij de mens. De progesteronspiegels beginnen te stijgen en er is een tweede kleine stijging in de spiegels van 17 bèta-oestradiol. Als reactie op de activering van het corpus luteum vindt de overgang naar diestrus bij muizen plaats wanneer de circulerende progesteronspiegels hun piek bereiken, wat overeenkomt met de menselijke fase.Late luteale fase. Regressie van het corpus luteum leidt tot een daaropvolgende scherpe daling van de progesteronspiegels en overgang naar prote. Veranderingen in de celtypologie weerspiegelen deze onderliggende endocriene gebeurtenissen in de relatieve verhouding van epitheelcellen.Gekwantificeerde cellen en leukocyten gedetecteerd in vaginale uitstrijkjes kunnen worden gebruikt om elk van de estrusfasen te identificeren. Hallo, mijn naam is Ashley McLean. Ik ben een onderzoeker in het laboratorium voor neurale regeneratie onder leiding van Dr. Stephanie Bennett aan de Universiteit van Ottawa.En ik ben Nicholas Valenzuela. Ik werk samen met Dr. Steven Phi bij de Carlton Immersive Media Studio aan de Carlton University in Ottawa. In deze video beschrijven we een eenvoudig protocol dat gebruikt kan worden voor de bepaling van de EST extra cycle stage.In dit protocol wordt in detail beschreven hoe u onderscheid kunt maken tussen de vier reproductieve stadia van de muis — proestrus, oestrus, metestrus en diestrus — door de predominante celtypologie en vaginale uitstrijksels te beoordelen. Laten we beginnen. Voor dit protocol moet u twee zaken voorbereiden: geautoclaveerd dubbel gedestilleerd water en een 0,1% kristalvioletoplossing.De kleuringsoplossing kan worden bewaard in een goed afgesloten container bij kamertemperatuur tot het nodig is. Begin met het plaatsen van een latex ballonnetje op het uiteinde van een steriele 200 µL tip en zuig ongeveer honderd µL van het steriele dubbel gedestilleerde water op. Gebruik de schaalverdeling op de tip als richtlijn voor het volume.Plaats de muis op de hopper zodanig dat haar achterkant naar u toe is gericht. Pak haar staart stevig vast en til haar achterlijf voorzichtig op. De muis zal haar voorpoten gebruiken om de hopper vast te pakken.Op dit punt kan de muis urineren. Spoel in dat geval de regio af met dubbel gedestilleerd water met een aparte tip. Plaats het uiteinde van de tip gevuld met dubbel gedestilleerd water bij de opening van het vaginale kanaal.Druk de peer voorzichtig in en breng een kwart tot de helft van het watervolume in het vaginale kanaal aan. Laat vervolgens langzaam de druk op de peer los, zodat de vloeistof terug in de tip wordt gezogen. Herhaal deze stap vier tot vijf keer met dezelfde tipveer en vloeistof.Voorkom dat de druk te snel wordt weggenomen om te verhinderen dat er vloeistof in het reservoir wordt opgezogen. Een filtertip kan hiervoor nuttig zijn. Plaats de muis terug in haar kooi en breng de vloeistof over op het glazen dekglas.Laat het objectglas volledig drogen bij kamertemperatuur. Zodra ze droog zijn, kunnen deze extra uitstrijkjes onmiddellijk of op een later tijdstip worden gekleurd. Plaats het aan de lucht gedroogde objectglas gedurende één minuut in de kristalvioletkleuring.Was het objectglas gedurende één minuut met dubbel gedestilleerd water. Herhaal dit en verwijder het overtollige dubbel gedestilleerde water van het objectglas met een zachte tissue-doek. Breng, terwijl het gebied met het gekleurde uitstrijkje wordt vermeden, ongeveer 20 µL glycerol aan op het uitstrijkje en plaats daarop een dekglas.Onderzoek de gekleurde uitstrijkjes zo spoedig mogelijk met lichtmicroscopie, aangezien de kleuring na verloop van tijd vanuit de cellen in het glycerolmontagemedium zal diffunderen. Begin met het onderzoeken van het gehele uitstrijkje bij een lagere vergroting. Selecteer een representatief gebied en schakel over naar een hogere vergroting.Tijdens de Pro Astra-fase zijn de cellen vrijwel uitsluitend genucleerde epitheelcellen. Tijdens de extra fase zijn de cellen die u ziet voornamelijk plaveiselvormige verhoornde epitheelcellen, die gewoonlijk dicht opeengepakte clusters vormen. Deze cellen zijn onregelmatig van vorm en hebben geen zichtbare kern.Tijdens het met-oestrusstadium worden nog zeldzame verhoornde plaveiselcelepitheelcellen waargenomen, maar er is nu een dominantie van kleinere, donkerder gekleurde leukocyten. Tijdens het diestrusstadium zijn er weinig tot geen verhoornde plaveiselcelepitheelcellen aanwezig. De resterende leukocyten zijn in grote aantallen aanwezig.Er worden genucleerde epitheelcellen waargenomen, zowel als individuele cellen als in clusters. Een probleem dat u kunt tegenkomen is urine die uw uitstrijkje contamineert. Mocht dit gebeuren, dan dient u het uitstrijkje weg te gooien en niet te gebruiken voor de stadiëring.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe vaginale spoelingen moeten worden uitgevoerd. Verzamel monsters, kleur deze monsters en beoordeel de celtypologie om het stadium van de oestruscyclus van vrouwelijke muizen op het moment van analyse te bepalen. Samenvattend: tijdens de preovulatoire fase bij PROE's wordt een piek in de circulerende 17 beta-estradiolspiegels weerspiegeld door een predominantie van goed gevormde geprokerneerde epitheelcellen in de vaginale uitstrijkjes.Een daaropvolgende piek in de spiegels van het follikelstimulerend hormoon signaleert de ovulatie en de overgang naar de oestrus, waarbij verhoornde plaveiselepitheelcellen domineren in de uitstrijkingen. Tijdens de metrus stijgen de progesteronspiegels. De celtypen die tijdens dit tijdstip in vaginale uitstrijkingen aanwezig zijn, zijn gefragmenteerde verhoornde epitheelcellen en kleinere, donkerder gekleurde leukocyten.Tijdens de diestrus, met een piek in progesteron, beginnen gekerneerde epitheelcellen te verschijnen. Leukocyten zijn nog steeds aanwezig. Om er zeker van te zijn dat een vrouwelijke muis een regelmatige cyclus heeft en om de lengte van de oestruscyclus vast te stellen, moeten deze beoordelingen dagelijks worden uitgevoerd en over twee volledige cycli worden geëvalueerd; het is normaal om verlengde diestrus- en oestrusfasen bij verschillende muizen te zien.We hopen dat dit u helpt bij uw studies die gericht zijn op gender en hormonen, en we wensen u veel succes met uw experimenten.

performing-vaginal-lavage-crystal-violet-staining-vaginal-cytological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Belangrijke technieken om te worden gebruikt bij de evaluatie...

Protocollen voor Vaginale Inenting en Sample Collection in het experimenteel muismodel van Candida Vaginitis

Source: Morrill, S. R., et al. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a protocol for modeling vaginal colonization in mice using antibiotic-resistant anaerobic bacteria. It begins with hormonal treatment to increase epithelial susceptibility, followed by vaginal inoculation and co-inoculation under anaerobic conditions. The procedure concludes with post-inoculation sampling and culture to evaluate bacterial colonization...

Modeling Murine Vaginal Colonization by Anaerobic Bacteria

Het doel van dit protocol is voor de menselijke groep B Streptococcus (GBS) vaginale kolonisatie na te bootsen in een muismodel. Deze werkwijze kan worden gebruikt om immuunreacties van de gastheer en bacteriële factoren die GBS vaginale persistentie te onderzoeken, alsmede therapeutische strategieën testen.

Een muizenmodel van groep B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginale Kolonisatie

Veel behandelingen en genetische mutaties van invloed op de timing van seksuele rijpheid en vruchtbaarheid. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om te evalueren van de pubertijd begin in muizen en ratten vóór het opzetten van een vruchtbaarheidsonderzoek in seksueel volwassen dieren.

Bepaling van reproductieve bevoegdheid door te bevestigen van pubertijd begin en uitvoeren van een test van de vruchtbaarheid in muizen en ratten

Baarmoeder contracties zijn belangrijk voor het welzijn van vrouwen. Echter, pathologisch verhoogde contractiliteit kan leiden tot dysmenorroe, vooral bij jongere vrouwtjes. Hier beschrijven we een eenvoudige ex vivo voorbereiding waardoor een snelle beoordeling van de werkzaamheid van glad Spierrelaxantia die kunnen worden gebruikt voor de behandeling van dysmenorroe.

Ex vivo-methode voor het beoordelen van het voortplantingsstelsel van muizen spontane beweeglijkheid en een op MATLAB gebaseerd baarmoeder bewegings Volgalgoritme voor gegevensanalyse

Deze studie beschrijft de cruciale factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij experimentele ontwerpen met vrouwelijke ratten. In bredere zin dienen deze gegevens om stigma te verminderen en te helpen bij de ontwikkeling van meer inclusieve diagnostische en interventietools.

Knaagdier Estrous Cycle Monitoring met behulp van vaginale lavage: niet zoiets als een normale cyclus

Het protocol presenteert een muismodel van vaginale kolonisatie met anaeroob gekweekte menselijke vaginale bacteriën. We richten ons op Gardnerella vaginalis, terwijl we suggesties opnemen voor Prevotella bivia en Fusobacterium nucleatum. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een gids voor vaginale inentingen en levensvatbaar herstel van andere anaeroob gekweekte bacteriën.

Modellen van Murine Vaginale Kolonisatie door Anaeroob Gekweekte Bacteriën

De gepresenteerde cervicale manipulatiemethode kan pseudozwangerschap bij muizen induceren zonder dat het nodig is om vrouwtjes te fokken met vasectomie mannetjes. De inductie van pseudozwangerschap is vereist voor het succes van niet-chirurgische embryotransfer en niet-chirurgische kunstmatige inseminatie, die beide ook worden gepresenteerd.

Het induceren van pseudopregnancy bij vrouwelijke muizen zonder de noodzaak van vasectomie bij mannen voorafgaand aan niet-chirurgische embryotransfer of kunstmatige inseminatie

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het produceren van een betrouwbaar en reproduceerbaar dun baarmoederslijmvlies met een zeer laag sterftecijfer en minimale intra-uteriene verklevingen door binnen 1-3 minuten 95% ethanol in de baarmoeder van de muis te injecteren.

Een muismodel van dun endometrium opstellen

Orthotope diermodellen van kanker van de eierstokken te repliceren beter mens-en vaatziekten en daardoor meer inzicht in de progressie van kanker en tumor respons op therapie. Een muis model krijgt een intrabursale injectie van luciferase-expressie ovarium tumorcellen. De behandeling wordt toegediend via orale sondevoeding. Tumorgroei wordt bewaakt...

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Leer vaginale lavage en Crystal Violet kleuring voor het bepalen van de voortplantingscyclus bij vrouwelijke muizen. Deze methode identificeert hormonale stadia door cytologische evaluatie van vaginale uitstrijkjes.

Het uitvoeren van vaginale lavage, Crystal Violet kleuring, en vaginale cytologische Evaluatie Mouse loopsheid Staging identificatie (Video) | JoVE Journal

Het uitvoeren van vaginale lavage, Crystal Violet kleuring, en vaginale cytologische Evaluatie Mouse loopsheid Staging identificatie

Meer video's verkennen