Name: Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het isoleren van lymfocyten uit het voortplantingskanaal van muizen met enzymvertering en Percoll-gradiëntscheiding. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar immuunresponsen en voortplantingsziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen NIH bedanken voor de financiering van subsidies R01-AI026328 (KAK) en R01-AI079004 (KAK).

1. Het verwijderen van de voortplantingsorganen <ol><li> Euthanaseren de muis met behulp van goedgekeurde richtlijnen. Maak lage middellijn incisie en trekken de huid. </li><li> Isoleer en verwijder gehele genitale tractus, van eileider naar vaginale opening. </li><li> Lengterichting Open het hele darmkanaal met een schaar. </li><li> Snijd de voortplantingsorganen waarbij fijne chirurgische schaar in kleine stukjes (ongeveer &lt;1 mm) in een petrischaal met complete RPMI-10/EDTA (zie onderstaande formule) en roer het weefsel in 125 ml kolf bij kamertemperatuur op een magnetische roerder ingesteld 15 min. Deze procedure wordt tweemaal herhaald en de supernatant, die epitheel en ander afval bevat, wordt verwijderd. </li><li> Giet de inhoud van kolf door een cel zeef (40 pm). Afwassen EDTA residu met volledig medium. Volledige RPMI/10: 500 ml RPMI (Gibco), 10% foetaal bovine serum (FBS), door warmte geïnactiveerd, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml 1M HEPES. Volledige RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (zoals hierboven) met 5 uM EDTA </li></ol> 2. Het verteren van genitale weefsel <ol><li> Overdracht weefselstukken een nieuwe kolf met 20 ml verse RPMI-10/collagenase (zie recept hieronder) en verteren van het weefsel bij 37 ° C gedurende 1 uur op een magnetische roerder ingesteld krachtig te roeren het weefsel. Volledige RPMI-10/collagenase: Vlak voor gebruik reconstitueren collagenase type VIII (Sigma, bij -20 ° C, of volgens de instructies van de fabrikant.), In volledige RPMI/10 aan een eindconcentratie van 450-500U/ml. </li><li> Na de eerste vertering, verzamel supernatanten door 100 um cel zeef, houden de cellen op ijs. </li><li> Breng de onverteerde weefsel naar een nieuwe kolf en herhaal stap 2.1 nog tweemaal met vers compleet RPMI-10/collagenase voor een totaal van 3 afzonderlijke digesties. Op dit punt moet geen zichtbare weefselstukken in oplossing. </li><li> Zwembad de alle bovenstaande vloeistoffen bij elkaar uit een steekproef en het verzamelen van door middel van 100 um cel zeef. Spin de cElls naar beneden. Celpellets worden gescheiden met behulp van Percoll gradiënten. </li></ol> 3. Het scheiden van het genitaal cellen met behulp van Percoll gradiënten <ol><li> Bereid elke concentratie van Percoll voor gebruik: <ul><li> 100% isotone Percoll: mix 9:01 voorraad Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH 7,4 aan met HCL. </li><li> 40% Percoll oplossing mix van 40 ml isotone Percoll 100% en 60 ml compleet RPMI. </li><li> 70% Percoll oplossing mix van 70 ml isotone Percoll 100% met 30 ml compleet RPMI. </li></ul></li><li> Resuspendeer elke cel pellet uit stap 6 in 40% Percoll oplossing. Een gelijk volume van 70% Percoll wordt gebruikt om de gradiënten maken. Er zijn twee manieren in te stellen gradiënt buizen: <ol><li> Onderlaag: celsuspensie eerst toevoegen met 40% Percoll in een gradiënt buis, vervolgens zorgvuldig onder-laag 70% Percoll. </li><li> Over-laag: eerste 70% Percoll toe in de buis vervolgens voorzichtig en langzaam laden 40% Percoll met de cellen op detop. </li></ol></li><li> Gradient monsters worden gecentrifugeerd @ 900 xg, kamertemperatuur gedurende 20 min met de rem uit. </li><li> De lymfocyten zullen op de grenslaag tussen 40% en 70% Percoll lagen. Voorzichtig oogsten van de interface laag, wassen met RPMI 1:3 en spin down op 740 xg. De lymfocyten worden in de cel pellet en zijn klaar voor verder gebruik. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Een voorbeeld van isolatie van lymfocyten uit muizen genitaal en flow cytometrie (FACS) analyse wordt getoond in figuur 1. Genitaal werd uit Chlamydia muridarum intravaginaal geinfekteerd muis 7 dagen na infectie. Twee geslachtsorganen werden samengevoegd om voldoende lymfocyten functionele fenotype onderzoek hebben door FACS. Ontleed weefsels werden verwerkt door de spijsvertering en isolatiestappen zoals hierboven beschreven. De enkele celsuspensie werd gekleurd voor verschillende fluorochroom-geconjugeerdemonoklonale antilichamen tegen muis CD3, CD4 en CD8. Figuur 1 een dot-plot presentatie van CD4 positieve T-cellen versus CD8 positieve T-cellen gated op CD3 positieve T lymfocyten. Onze procedure kan onderzoeken lymfocyten geïsoleerd van genitale stukken van verschillende ziekten modellen voor verschillende immuuncellen functionele en fenotypische kenmerken te beoordelen in verschillende ziekten in muismodel. Deze omvatten diverse immuuncellen, zoals dendritische cellen, neutrofielen, macrofagen NK, NKT, T cellen (Ag specifieke T-cellen), B-cellen etc. 3-10. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> Figuur 1. Lymfocyten werden geïsoleerd uit genitale stukken muizen geïnfecteerd met chlamydia muridarum, met behulp van de methode die hier gepresenteerd. Na de volledige scheiding procedure werden lymfocyten gekleurd met fluorochroom-geconjugeerde CD3, CD4 en CD8. Het kwadrant data waren gated op CD3 + lymfocyten,met CD4 + en CD8 + met en percentage van de gated cellen.

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
<li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li>
<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
<li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li>
<li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li>
<li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit protocol wordt getoond hoe lymfocyten te bereiden van de muis geslachtsorganen en is gemakkelijk onder de knie. De meest kritische punt van dit proces is cellevensvatbaarheid handhaven door hem de cellen op ijs. De cel opbrengst van deze werkwijze is afhankelijk van techniek, lossen vaardigheid, de infectieuze toestand van de muis (naïeve dagen na infectie), het pathogeen (bacteriële, virale, schimmel) en de sectie van de murine voortplantingsorganen onderzocht (eileider, uterus, vaginale segment of hele genitale...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma Life Sciences </td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare Bio-Wetenschappen </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Gibco door Life Technologies </td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van lymfocyten van mouse geslachtsorganen mucosa

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosale oppervlakken, ook in de gastro-intestinale, urogenitale en luchtwegen, bieden portals van binnenkomst voor ziekteverwekkers, zoals virussen en bacteriën 1. Slijmvliezen ook inductieve sites in de gastheer immuniteit tegen pathogenen, zoals de Peyers vlekken in het darmkanaal en de neus-geassocieerde lymforeticulair weefsel in de luchtwegen te genereren. Deze unieke eigenschap zorgt mucosale immuniteit als een cruciale speler van de afweer systeem. Veel studies zijn gericht op het gastro-intestinale en respiratoire slijmvliezen sites. Toch is er weinig onderzoek naar de reproductieve mucosale sites. De genitale tractus slijmvlies is de primaire plaats van infectie voor seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA), met inbegrip van bacteriële en virale infecties. SOA&#39;s zijn een van de meest kritische gezondheid uitdagingen voor de wereld van vandaag. Centers for Disease Control en Prevention schat dat er 19 miljoen nieuwe besmettelijke elk jaar in de Verenigde Staten. STDs kosten de Amerikaanse gezondheidszorg 17 miljard dollar per jaar 2, en de kosten individuen nog meer in directe en levenslange gevolgen voor de gezondheid. Om deze uitdaging het hoofd wordt een beter begrip van reproductieve mucosale immuniteit nodig en isoleren lymfocyten is een essentieel onderdeel van deze studies. Hier geven we een methode reproduceerbaar lymfocyten isoleren van murine vrouwelijke geslachtsorganen voor immunologische studies die kunnen worden aangepast voor aanpassing aan andere soorten. De hieronder beschreven methode is gebaseerd op een muis.

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere species

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Slijmvliesoppervlakken, waaronder die in het maag-darmstelsel, het urogenitale stelsel en de luchtwegen, vormen toegangspoorten voor pathogenen, zoals virussen en ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van lymfocyten uit het reproductieve stelsel van de muis. Dit wordt bereikt door eerst het gehele genitaliëstelsel te verwijderen en het weefsel in kleine stukjes te snijden om de lymfocyten uit het weefsel te bevrijden. Het fijn gesneden weefsel wordt vervolgens gedigereerd met collagenase eight onder krachtig roeren bij 37 °C.Met behulp van magnetisch roeren worden de lymfocyten vervolgens geïsoleerd via een percoll-gradiënt. Uiteindelijk kunnen de lymfocyten worden gekarakteriseerd door middel van flowcytometrie. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de diagnose en therapie van reproductieve ziekten, aangezien deze methode ons in staat stelt het gedrag van weefsellymfocyten te begrijpen, die vaak verschillen van de lymfocyten die uit het circulatiesysteem zijn geïsoleerd.Hoewel deze methode inzicht biedt in het reproductieve slijmvliesstelsel, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals het darm- en luchtwegslijmvliesstelsel. Maak na het euthanaseren van een vrouwelijke muis met een chirurgische schaar een lage mediane incisie en open vervolgens de huid. Verschuif de darmen voorzichtig opzij, identifi

isolation-of-lymphocytes-from-mouse-genital-tract-mucosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Isolatie van lymfocyten met behulp van de Miltenyi MAC-kit is een betrouwbare manier om cellen van hele lymfeweefsel homogenaten te zuiveren. Cellen gezuiverd met behulp van de Miltenyi systeem zijn meestal ≥ 96% zuiver. Hier tonen we de stappen die zijn genomen om CD4 + T-cellen, een van de vele kits worden aangeboden door Miltenyi isoleren.

Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer's patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Isolatie van lymfeklieronstcellen is een meervoudige procedure die enzymatische vertering en mechanische disaggregatie omvat om fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische en bloed-endotheelcellen te verkrijgen. In de beschreven procedure wordt een korte vertering gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de degradatie van oppervlaktemarkeringen van vitale lymfeklersonstcellen te minimaliseren.

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Leer een efficiënte methode voor het isoleren van lymfocyten uit het voortplantingskanaal van muizen met enzymvertering en Percoll-gradiëntscheiding. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar immuunresponsen en voortplantingsziekten.

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Meer video's verkennen