Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-

Deze experimentele aanpak combineert BRDU-incorporatie met fluorescentie in situ hybridisatie om de replicatietiming van zoogdierchromosomen kwantitatief te analyseren. Incorporeer eerst BRDU in levende cellen en oogst de metafasechromosomen.

Voer vervolgens DNA-FISH uit in combinatie met sequentiële BrdU-antilichaamkleuring om de individuele replicerende chromosomen te identificeren. Gebruik daarna fotomicroscopie om beelden vast te leggen van de FISH-signalen en de BrdU-incorporatie in individuele mitotische figuren. Bereken met behulp van CytoVision-software het oppervlak en de intensiteit van de pixels die worden vertegenwoordigd door de BrdU- of DAPI-signalen op elk geïsoleerd chromosoom.

De resultaten maken het mogelijk om de BrdU-incorporatie in individuele gerearrangeerde chromosomen en hun holos te kwantificeren en te vergelijken. Omdat de hier beschreven methode individuele cellen evalueert, is deze in staat om veranderingen in replicatie en timing bij chromosomale rearrangeringen te detecteren die slechts in een fractie van de cellen in een populatie aanwezig zijn, in tegenstelling tot de onlangs ontwikkelde high-throughput microarray- en DNA-sequencingprotocollen. Deze methode maakt een directe vergelijking mogelijk van homologe chromosomen die zich in dezelfde cel bevinden.

Het is daarnaast in staat om eenduidig chromosoomrearrangementen te identificeren die de chromosoomreplicatie beïnvloeden. De timing van volledige chromosomen ter demonstratie van de procedure zal worden uitgevoerd door Leslie Smith, een research associate in mijn laboratorium. Zaai de cellen uit bij een confluentie van ongeveer 70% in een weefkweekschaal van 150 millimeter en plaats deze gedurende 24 uur in een celincubator op het juiste tijdstip.

Punten voorafgaand aan het oogsten. Vul het medium aan met vers compleet medium dat 10 µg/mL BrdU bevat. De tijdsduur dat cellen worden gekweekt in medium met BrdU varieert per celtype en soort.

Normaal gesproken duurt de G2-fase twee tot vijf uur. Verwijder het kweekmedium uit de plaat en bewaar 10 milliliters in een conische centrifugebuis van 15 milliliter. Spoel de cellen met 10 milliliters sine en verwijder de resterende sine via vacuümaspiratie.

Voeg vervolgens vijf milliliter 0,25%trypsine toe en incubeer bij kamertemperatuur totdat de cellen van de plaat zijn losgekomen. Oogst de cellen en breng de suspensie over in de 10 milliliter gereserveerd medium. Pelleteer de cellen door centrifugatie en aspireer al het medium behalve 0,5 milliliter.

Resuspendeer de cellen nu grondig met een pasteurpipet. Voeg om de cellen osmotisch te laten zwellen drie druppels 75 millimol kaliumchloride toe, voorverwarmd tot 37 °C, en meng de celsuspensie met een pasteurpipet. Voeg vervolgens nog eens 0,5 milliliter hypotone oplossing toe. Breng nu het totale volume hypotone oplossing aan tot vijf milliliter en meng door te pipetteren.

Incubeer de celsuspensie gedurende 20 tot 45 minuten bij 37 °C, afhankelijk van het celtype. Incubeer de buisjes schuin om de cellen in suspensie te houden. Centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 400 ×g.

Zuig alle supernatant af behalve 0,5 mm en gebruik een Pasteur-pipet om de celpellet voorzichtig te resuspenderen. De osmotisch opgezwollen cellen zijn op dit punt fragiel, dus moet er voorzichtig worden gewerkt om de cytoplasmatische membranen niet te beschadigen. Voeg vervolgens drie druppels Carnoy-fixatief toe en meng voorzichtig.

Voeg vervolgens nog 0,5 milliliter fixeerder toe tot het totale volume fixeerder vijf milliliter bedraagt en pipetteer tot een homogene celsuspensie is verkregen. Deze gefixeerde cellen kunnen gedurende enkele maanden donker worden bewaard bij negatief 20 graden Celsius. Oogst de gefixeerde cellen door centrifugatie, aspireer de fixeerder en resuspendeer het pellet in 10 volumes fixeerder terwijl u een ijskoude microscoop gebruikt.

Houd het objectglas onder een hoek van ongeveer 45 graden. Voeg de celсусpensie druppelsgewijs toe om deze te verspreiden. Spoel het objectglas volledig met fixeerder en laat het overschot weglopen.

Leg het objectglas vervolgens plat op papieren handdoeken om aan de lucht te laten drogen. Beoordeel de monsters op de aanwezigheid van mitotische spreads met behulp van een omgekeerde microscoop. Voeg twee microliters 10 microgram per milliliter RNAs A in twee XSSC toe aan elk objectglas en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius.

Voer drie wasbeurten van drie minuten uit met 2 XSSC pH 7.0 bij kamertemperatuur. Dehydrateer de monsters vervolgens via een ethanolserie bij kamertemperatuur gedurende drie minuten. Laat de monsters vervolgens aan de lucht drogen bij kamertemperatuur in een gekoelde microcentrifugebuis.

Voeg vier µg van het gelabelde nucleotiden-DNA-substraat, 10 X NIC-translatiebuffer, DNTP-mix en NIC-translatie-enzym toe. Incubeer de reactie een nacht bij 16 °C en verhit gedurende 10 minuten bij 70 °C om de reactie te stoppen. Koel vervolgens vijf minuten op ijs af.

Om het DNA vervolgens met ethanol te precipiteren, voegt u 48 µL natriumacetaat 3 M, 160 µL cot 1D NA van 0,25 µg/µL en 1,2 mL 100% ethanol toe. Bewaar de monster bij -80 °C gedurende 10 minuten tot een nacht om het DNA te precipiteren. Pelleteer door middel van centrifugatie en was het pellet met 70% ethanol. Resuspendeer de luchtgedroogde DNA-probe in 40 µL dubbel gedestilleerd water voor een uiteindelijke concentratie van 100 ng/µL gelabeld back DNA voor de back SEP simultane hybridisatie. Bereid twee aparte cot 1D NA-bevattende probe-cocktails voor zoals gedetailleerd in het bijbehorende manuscript.

Denatureer de probe-cocktails gedurende 10 minuten bij 75 °C. Incubeer vervolgens 30 minuten bij 37 °C om het cot 1D NA aan repetitieve sequenties te binden. Combineer nu de back probe met de S probe in een verhouding van drie op twee voor 25 µL per monster.

Schuif de preparaten opzij om de monsters te denatureren. Dompel de preparaten onder in 70% formamide 2 XSSC bij 72 °C en incubeer gedurende drie minuten. Dehydrateer de monsters onmiddellijk via een ethanolserie bij 4 °C gedurende drie minuten.

Laat de monsters bij kamertemperatuur ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen voordat de voorbereiding van de probe wordt voltooid. Equaliseer de coupes op een objectglasverwarmer van 45 °C. Voeg vervolgens 25 µL van de back S probe-mix toe.

Plaats voorzichtig een dekglas op elke slide en verzegel alle randen met rubbercement voor de hybridisatiestap. Incubeer de monsters gedurende de nacht bij 37 °C in een bevochtigde kamer. Voer drie post-hybridisatiewassingen uit van telkens drie minuten in 50% IDE 2X SSC pH 7,0 bij 38 tot 40 °C.

De optimale temperatuur van de wasstappen is afhankelijk van de probe. Als er sprake is van een hoge achtergrondhybridisatie, verhoog dan de temperatuur van de wasstappen. Omgekeerd, als het signaal van de probe zwak is en er geen achtergrond aanwezig is, verlaag dan de temperatuur van de wasstappen.

Voer één wasbeurt uit in PN-buffer bij kamertemperatuur gedurende drie minuten. Voeg voor de BRDU-detectie 200 µL PNM-blokkeringsbuffer toe aan elk objectglas. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker en laat de objectglazen uitlekken op een papieren handdoek.

Voeg vervolgens 100 µL van 50 µg/mL anti-BRDU-FE-geconjugeerd antilichaam toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voer drie wasbeurten van drie minuten uit in PN-buffer bij kamertemperatuur. Verwijder de overtollige PN-buffer van elke slide.

Voeg vervolgens 20 µL dappy Antifa-montagevloeistof toe. Bedek het objectglas met een papieren handdoek en druk op het dekglas om luchtbellen en overtollige montagevloeistof naar buiten te persen. Leg de beelden vast met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een CCD-camera.

Leg met behulp van het 100x objectief, het automatische filterwiel en de CytoVision-software BRDU vast met een FITC-filter, en de chromosoomverf- en centromeersondes met een Cy3- of Texas Red-filter. Gebruik daarnaast een DAPI-filter voor de kernkleuring. Identificeer de individuele chromosomen van belang met behulp van BAC-EP of chromosoomspecifieke verfsondes in de CytoVision-software.

Knip elk chromosoom van belang als geheel uit de metafase-spread. Kopieer en plak de DPI- en FITZY-chromosoombeelden in een nieuw venster. Selecteer het grafiekpictogram in het toolmenu, waarmee een grafiek kan worden gegenereerd die het oppervlak en de intensiteit van zowel de Fitz- als dappy-kleuring langs elk individueel chromosoom weergeeft.

Dit wordt gedaan door een lijn over de lengte van het chromosoom te trekken, van de korte arm naar de lange arm. Selecteer in het toolmenu het data-icoon en genereer een tabel waarin de berekende oppervlakte en intensiteit voor ZI en dpi worden weergegeven. Selecteer vervolgens de ZI- en DPI-signalen voor de chromosomen van belang.

Klik vervolgens op de knoppen voor intensiteit en oppervlak bij het tabelpictogram. De software genereert een numerieke meting van pixels per vierkante inch voor elk signaal. Daarna wordt de gemiddelde pixelintensiteit van elk chromosoom vermenigvuldigd met het oppervlak dat door die pixels wordt ingenomen.

Om het totale aantal pixels te verkrijgen voor de visualisatie van de laatst replicerende regio's van chromosomen, moet het bandenpatroon van BRDU-incorporatie voor actief replicerende regio's van chromosomen worden geëvalueerd. Bereken vervolgens de verschillen in replicatietiming tussen chromosoomparen op basis van verschillen in het BRDU-bandenpatroon. De chromosomen in zoogdiercellen repliceren volgens een temporeel programma, waarbij vroege en late replicatie respectievelijk aan het begin en aan het einde van de S-fase plaatsvinden.

Een typische S-fase in zoogdiercellen duurt acht tot 10 uur, en de G2-fase duurt doorgaans twee tot vijf uur. In dit experimentele systeem wordt BrdU toegevoegd gedurende toenemende perioden om de laatste delen van de chromosomen te labelen die repliceren; deze cellen bevatten een deletie van het menselijke ASAR6-gen gelokaliseerd op 6q16.1. Na een behandeling van vijf uur met BrdU werden mitotische cellen geoogst en verwerkt voor BrdU-incorporatie en fluorescente in situ hybridisatie met behulp van een chromosoom 6 paint-sonde, waarbij de twee chromosomen 6 drie fluorescente labels vertoonden.

Het significante verschil in het BRDU-bandingspatroon is consistent met de vertraging in de replicatietiming van meer dan twee uur voor een van de chromosoom zesjes. Cyto vision-software toont de verschillende signaalintensiteitsprofielen voor DPI en BRDU op de twee chromosoom zesjes, wat duidt op asynchrone replicatie. Daarnaast is er een significant verschil in de totale hoeveelheid BRDU-incorporatie in vergelijking met een soortgelijke analyse van de DPI-kleuring.

De inclusie van een back probe die het menselijke AR six-gen bevat, brengt het enkele chromosoom zes met een deletie op de lange arm in deze cel in kaart. Opvallend is dat er een intensere BrDU-incorporatie en een uitgebreider bandpatroon van BrDU-incorporatie is dan op het niet-ED chromosoom zes. Mitotische spreads van zeven verschillende cellen werden verwerkt voor kwantificering van het verschil in replicatietiming tussen de chromosoom zesen.

De BRDU-niveaus vertonen een verschil van meer dan tweevoud tussen de totale pixelwaarden voor de gedeleteerde en niet-ED chromosoom zesen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in drie dagen correct worden uitgevoerd. We hopen dat u nu een goed begrip heeft van hoe u de replicatietiming van homologe chromosomen binnen dezelfde cel kunt meten en hoe u chromosomale herschikkingen die correleren met veranderingen in de replicatie eenduidig kunt identificeren.

Timing van volledige chromosomen.