Name: In vitro synthese van Native, Stapel Lange Afstand en Segmentale Lange Afstand Collageen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer de synthese van native, fibrous long spacing en segmental long spacing collageen uit Type I collageenmonomeer. Deze reproduceerbare protocollen gebruiken atoomkrachtmicroscopie voor karakterisering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de vele voorbije bachelor-, master-en post-doctorale studenten die hun tijd en moeite bijgedragen aan de studie van collageen fibrogenese in ons laboratorium bedanken. The Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada voortdurend financiële steun verstrekt voor onze collageen studies.

Opmerking: Het water voor alle protocollen een soortelijke weerstand&gt; 18 MΩ.cm. 1. Inheemse collageenvezels <ol><li> Combineer 6 pl water, 20 ui van 200 mM Na 2 HPO 4 pH 7 met HCl en 10 ul van 400 mM KCl in een microfugebuis en meng. </li><li> Voeg 4 pi collageen monomeer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) aan de microcentrifugebuis en meng. De oplossing moet helder en kleurloos zijn. </li><li> Plaats de microcentrifugebuis die het reactiemengsel in een warmteblok die is voorverwarmd tot 37 ° C en laat gedurende 3 tot 4 uur. Op dit punt, moet de oplossing zijn licht bewolkt en bevatten hoofdzakelijk inheemse collageenvezels. </li></ol> 2. Stapel-Long Afstand Collageen <ol><li> Dialyseer 1 ml van collageen monomeer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) met 12-14 kDa MWCO membraan tegen 400 ml water, het veranderen van de water vier maal gedurende een periode van 24 uur bij kamertemperatuur. De gedialyseerde collagen monomeer dat niet direct gebruikt kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Combineer 20 pl water, 20 ui van 3 mg / ml α1-zuur glycoproteïne in water en 20 ul collageen gedialyseerd monomeer in een microfugebuis. De oplossing moet helder en kleurloos zijn. </li><li> Laat de microcentrifugebuis die het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Op dit punt, moet de oplossing worden bewolkt en bevatten voornamelijk FLS collageenvezels. </li></ol> 3. Segmentale Lange Afstand Collageen <ol><li> Combineer 67 pi water, 60 pi van 100 mM glycine-HCl buffer bij pH 3,3 en 40 ui 10 mg / ml ATP in water in een microfugebuis en meng. </li><li> Voeg 33 ul collageen monomeer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) aan de microcentrifugebuis en meng. De oplossing moet helder en kleurloos zijn. </li><li> Laat de microcentrifugebuis die het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Op dit punt, zal de oplossing nog steeds helder, maar moetbevatten meestal SLS collageen. </li></ol> 4. AFM Karakterisering <ol><li> Klieven het oppervlak van een stuk mica bevestigd aan een AFM substraat voor de mica oppervlak met een stukje plakband en los te trekken. Controleer daarna de band om te bevestigen dat een hele laag van mica werd gesplitst om onregelmatigheden op het oppervlak te verminderen en ervoor te zorgen dat het oude monster wordt verwijderd als de mica wordt hergebruikt. </li><li> Toepassing 20 ul van de collageen fibrillen oplossing van het vers gesplitste substraat mica. Laat gedurende 5 minuten. </li><li> Voorzichtig afspoelen oplossing van collageen fibrillen met water. Het is raadzaam om de water direct op de midden van de mica substraat maar aan de rand en te laten stromen over het monster. </li><li> Droog het oppervlak onder een voorzichtige stroom stikstofgas. Het is raadzaam om de stroom aan de rand en niet in het midden van de mica substraat leiden. </li><li> Onder een optische microscoop bij 200 x vergroting,de inheemse en FLS collageen monsters moeten tonen groepjes van fibrillen. SLS collageen zal niet zichtbaar zijn. </li><li> De unieke eigenschappen van de drie verschillende collageenstructuren waarneembaar zijn door AFM. Over het algemeen, hebben we beeld inheemse collageen fibrillen met een AFM in intermitterende contact modus met behulp van silicium AFM probes, terwijl FLS en SLS collageenvezels we meestal afbeelding met een AFM in contact modus met behulp van siliciumnitride AFM probes. We doen dit omdat de tijd en kosten overwegingen. Silicon AFM probes zijn doorgaans scherper dan siliciumnitride AFM probes, waardoor ze bijzonder nuttig voor het afbeelden van de smallere strepen structuur van natief collageen fibrillen. Echter silicium AFM probes zijn veel gevoeliger voor verontreiniging door collageen samples dan siliciumnitride AFM probes en moeten vaak vervangen. Wij behouden ons daarom het gebruik van silicium AFM probes vooral voor de beeldvorming inheemse collageenvezels, waar resolutie is een grotere noodzaak en we werken in intermitterend contact modus om prolong hun leven van nut. </li></ol> Wij raden een eerste 100 × 100 micrometer 2 scan die moet laten zien op zijn minst een paar collageen constructen. Van daar, zoom in tot op een schaal van 10 × 10 pm 2 en dan 2 × 2 um 2 om de banding periodiciteit van inheemse en FLS collageen, of de fijnere kenmerken van een SLS collageen in acht te scannen. Het is een goed idee om ten minste twee regio&#39;s altijd op het collageen heeft gecontroleerd dat de eerste scans representatief zijn.

<ol><li>Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Collagen at a glance.</a> J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).</li>
<li>Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+Collagen+Characterization+for+Bio+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Guide to Collagen Characterization for Bio Studies.</a> J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).</li>
<li>Baselt, D. R., Revel, J. -P., Baldeschwieler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfibrillar+Structure+of+Type+I+Collagen+Observed+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy.</a> Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).</li>
<li>Petruska, J. A., Hodge, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Subunit+Model+for+Tropocollagen+Macromolecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).</li>
<li>Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pattern+in+Native+Collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular Pattern in Native Collagen.</a> Nature. 219, 157-158 (1968).</li>
<li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extract+of+collagen+from+connective+tissue+by+neutral+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions.</a> PNAS. 41, 1-7 (1955).</li>
<li>Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+assembly+of+collagen+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).</li>
<li>Wood, G. C., Keech, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+fibrils+from+collagen+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The formation of fibrils from collagen solutions.</a> Biochem. J. 75, 588-597 (1960).</li>
<li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+Fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen Fibril formation.</a> J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).</li>
<li>Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+collagen+fibrils+in+vitro%3B+the+assembly+process+depends+on+the+initiating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Macromol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure.</a> Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).</li>
<li>Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrous+long+spacing+collagen+ultrastructure+elucidated+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).</li>
<li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+mucoprotein+with+soluble+collagen%3B+an+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study.</a> PNAS. 37, 286-291 (1951).</li>
<li>Ghadially, F. N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , 3rd Edition, Butterworths. London. (1988).</li>
<li>Paige, M. F., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+assembly+of+segmental+long+spacing+collagen+studied+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy.</a> Micron. 74, 355-361 (2001).</li>
<li>Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+particle+type+in+certain+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A new particle type in certain connective tissue extracts.</a> PNAS. 39, 459-470 (1953).</li>
<li>Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+segment-long-spacing+crystallites%3A+their+role+in+collagen+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li>
<li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li>
<li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O+prokollagene+kohzi%5BTitle%5D)+AND+%22Biokhimiya%22%5BJournal%5D)">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li>
<li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Gezuiverd collageen monomeer stabiel bij lage pH en temperatuur en de vorming van natief collageen fibrillen hoofdzakelijk bestaat verhogen van de pH en temperatuur van de collageen monomeeroplossing. Procedures voor de reconstitutie van gestreepte collageen fibrillen uit monomeren bestaan ​​al meer dan 50 jaar. De procedure die ons laboratorium in de eerste studies met collageen 15 jaar geleden 7 is gebaseerd op procedures samengevat door Chapman en medewerkers in 1986 10. De voor collageen fibrilvorming in die eerdere werk waren 0,18 mg / ml collageen in monomeer Na 2 HPO 4 / KH 2PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) buffer bij 34 ° C. Het nadeel van deze en andere procedures die we hebben geprobeerd is dat er altijd unbanded fibrillen gevormd naast de gewenste gestreepte fibrillen. Onze nieuwe condities ~ 0,3 mg / ml collageen monomeer in 100 mM fosfaat en 100 mM KCl bij pH 7 op 37 ° C gedurende 3-4 uur. De proceduredure beschreven verschilt in elk aspect van de eerdere procedure voor het natieve collageenvezels. Maar het meest opvallend, hebben we verdubbeld de ionsterkte door verhoging van de bufferconcentratie en met 100 mM KCl. De toename in ionsterkte resulteert in meer consistente vorming van uitsluitend gestreept collageenfibrillen. In onze ervaring, de enige keer dat deze procedure niet heeft eigen type collageen was toen de collageen monomeer oplossing was voorbij door de fabrikant aanbevolen datum van gebruik. Wanneer dit gebeurt, is wat waargenomen varieert van minder fibrillen die allemaal unbanded veel fibrillen nog steeds waargenomen maar overwegend unbanded. Merk op dat verlopen collageen monomeer kan vaak nog met succes worden gebruikt om inheemse collageen te maken, maar als het niet lukt, nieuw collageen monomeer moet zeker worden gekocht. FLS werd voor het eerst geïdentificeerd door Highberger et al.. 17 in collageen voorbereidingen bijgeschreven op Orekhovich et al.. 18. Verdere studies leidde Highberger en Schmitt om te concluderen dat het α1-zuur glycoproteïne, dat de vorming van FLS 12 bevordert. We waren in staat om later de procedure voor het maken repliceren FLS collageen door het combineren van in de handel verkrijgbare collageen monomeer en α1-zuur glycoproteïne bij lage pH en langzaam waardoor de pH te stijgen door dialyseren tegen water het mengsel gedurende 24 uur 11. Presenteren we nu een wijziging van die procedure door dialyseren het collageen monomeer tegen water eerst en eenvoudig te combineren met α1-zuur glycoproteïne in water om FLS collageen te vormen. De voorwaarden voor FLS collageen montage beschreven veel minder tijdrovend. Het collageen monomeer moet nog vooraf worden gedialyseerd tegen water, maar het kan in bulk en vervolgens opgeslagen bij 4 ° C stabiel totdat het wordt gebruikt. Deze nieuwe procedure levert FLS voornamelijk gestreepte collageenvezels. Vanuit onze ervaring, α1-zuur glycoeiwit met een lagere gecombineerde eiwitten en het watergehalte, en door gevolgtrekking hoger suikergehalte, is van cruciaal belang voor het succesvol maken van FLS fibrillen. We meestal met de fabrikant dat de α1-zuur glycoproteïne veel dat we gebruik maken van een gecombineerde% eiwit en het watergehalte van 82 of minder heeft. En als de procedure voor natief collageen, collageen monomeer dat te oud is kan ook resulteren in het feit dat FLS collageen. Bovendien is de zuiverheid van het water voor de dialyse is essentieel in deze procedure. Bijvoorbeeld dialyse van collageen monomeer zelfs tegen ~ 8 MΩ.cm plaats&gt; 18 MΩ.cm water resulteert in een collageenoplossing die niet zullen FLS collageen. Van de drie collageen fibrillen vormen, het makkelijkst te maken is SLS collageen. De vroegste bereiding van SLS werd door Schmitt en medewerkers 15. Publiceerden we een aanpassing van deze procedure 12 jaar geleden voor het maken van SLS collageen met behulp van in de handel verkrijgbare collagen 14. Het eenvoudigweg gepaard combineren van 2 mg / ml ATP en 0,5 mg / ml collageen in monomeer 0,05% (v / v) azijnzuur bij pH 3,5, en laat het mengsel bij kamertemperatuur geroerd. In onze ervaring, de kritische aspect van SLS samenstelling die moet worden beheerst de pH van de reactieoplossing. SLS geassembleerd in meer basisvoorwaarden (~ pH 3.6 tot 3,9) resulteert in geaggregeerde groepjes van kristallieten. Meer zure omstandigheden (pH ~ 2.9-3.2) resulteert in dunnere, meer gescheiden kristallieten dan die gemonteerd onder de ideale omstandigheden van pH 3,3-3.5. Reactie pH buiten dit bereik (&lt;2.8 en&gt; 4) geen enkel element SLS collageen. In het verleden hebben we bijgesteld de pH van het reactiemengsel door toevoeging van azijnzuur. De procedure nog verder te vereenvoudigen, in dit manuscript wij een glycine-HCl buffer om de pH te controleren. De drie verschillende collageen structuren gevormd uit de hierboven beschreven protocollen hebben karakterrealistische functies die alleen kan worden onderscheiden door de instrumenten die in staat van nanometer resolutie. Inheemse en FLS collageen worden gekenmerkt door strepen periodiciteiten van ~ 67 nm en ~ 270 nm. De langste afmeting van SLS collageen slechts ~ 360 nm. We hebben specifiek beschreven hoe we een AFM gebruiken om de drie collageenstructuren karakteriseren. Daarbij moet echter niet AFM die in contact of intermitterend contact functie met AFM probe met &lt;10 nm radius ook kunnen deze afbeelding collageenstructuren. Bovendien kunnen elektronenmicroscopie zijn en is gebruikt om karakteriseren collageenstructuren 19. Het grote voordeel van deze procedures is dat zij overwegend de gewenste collageen construeren. De enige andere vorm van collageen die in deze reacties is het uitgangsmonomeer, die vaak zichtbaar op de achtergrond van de AFM afbeeldingen. In het geval van natuurlijke en FLS collageen, kunnen ze gemakkelijk worden gescheiden van de meeste unreaCTED monomeer door herhaalde centrifugeren en wassen van de resulterende natieve of FLS collageen pellet met water. We hebben gepresenteerd eenvoudige en betrouwbare procedures voor het maken van native, FLS en SLS collageen met behulp van geavanceerde, commercieel verkrijgbare uitgangsmaterialen. Het collageen monomeer dat in al deze procedures is commercieel verkrijgbaar in een gezuiverde vorm. α1-zuur glycoproteïne en ATP zijn ook beide in de handel verkrijgbaar.

Collageen is een klasse van structurele eiwitten die een drievoudige helixstructuur bestaat uit drie polypeptide ketens. Deze triple helix monomeren verder verzamelen op een hiërarchische wijze steeds grotere structuren. Er zijn ten minste 28 genetisch verschillende collageentypes geïdentificeerde 1. Gecombineerd, collagenen goed voor 30% van het totale eiwit dat voorkomt bij dieren, met Type I de meest voorkomende vorm goed voor maximaal 90% van alle collageen eiwitten 2. Type I collageen wordt gevonden als fibrillous structuren in de huid, ligamenten, pezen en botten. Atomic Force Microscope (AFM) en elektronenmicroscoop (EM) beelden van Type I inheemse collageenvezels Typisch voor banding met een karakteristieke periode van ~ 67 nm (vaak aangeduid als D-banding) 3-5. Type I collageen monomeer een triple helix heterotrimeer bestaande uit twee identieke α1 (I)-ketens en een α2 (I)-keten, elk meer dan eenduizend aminozuren lang. Het is lang en dun met afmetingen van 300 nm lang en 1,4 nm in diameter. Type I collageen monomeer kan gemakkelijk worden verkregen door het afbreken van nature gevormd hogere orde structuren 6. We 7 en vele anderen 8-10 hebben aangetoond dat deze oplosbaar monomeer bouwstenen vervolgens kan worden gebruikt om D-banded fibrillen in vitro (figuur 1) te reconstrueren. Naast natief collageen fibrillen zijn twee andere hogere orde collageenstructuren gevonden te vormen in vitro met dezelfde monomeer bouwstenen. Beide structuren zijn vezelachtige lange afstand (FLS) en segmentale lange afstand (SLS) collageen (figuur 1). FLS collageen een fibrillous construct als natief collageen, maar wordt gekenmerkt door een grotere frequentie dan banding natief collageen 11. In vitro FLS collageen vormt wanneer het collageen monomeer wordt gecombineerd met α1-zuur glycoproteïne <sup&gt; 12. FLS collageen waargenomen in vivo, hoewel zelden 13. SLS collageen wordt beschreven als kristallieten omdat de monomeren worden uitgelijnd in register als in een kristalrooster 14. SLS collageen vormt wanneer het collageen monomeer wordt gecombineerd met adenosine trifosfaat (ATP) 15. Natuurlijk voorkomende SLS collageen waargenomen in het kweekmedium van fibroblasten maar niet in geëxtraheerde weefselmonsters, waarschijnlijk vanwege de kleine omvang en het gebrek van onderscheidbare topografische kenmerken 16. Het doel van dit manuscript is de presentatie van gedetailleerde procedures voor het maken van inheemse collageenvezels en FLS en SLS collageen dat zelfs de meest onervaren onderzoeker kan reproduceren. Met behulp van in de handel verkrijgbare geavanceerde uitgangsmaterialen, hebben we geprobeerd om de protocollen zo eenvoudig mogelijk te maken en nog steeds hebben ze betrouwbaar werken. We hebben ook uitvoerig in op hoe een AFM te gebruiken om de verschillende collageen structuur karakteriserens die worden gemaakt. Dit werk zal zijn voor onderzoekers die willen een of meer van deze hogere orde collageen structuren te bestuderen en / of te gebruiken als voorlopers in andere toepassingen, maar op dit moment ontbreekt van de expertise of gewoon niet willen werken met weefselmonsters.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal / reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Type I collageen monomeer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) </td><td> Inamed Geavanceerde Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> Lot 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lot 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lot 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> Research Biochemicals International </td><td> A-141 </td><td> Lot FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1-zuur glycoproteïne van runderen plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3643 </td><td> Lot 051K7440 (89,8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71,2%) Lot 063K7495 (71,9%) Lot 117K7535 (75,9%) (Eiwit + watergehalte) </td></tr><tr><td> a1-zuur glycoprotein uit menselijk plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9885 </td><td> Lot 128H7606 (70,9%) Lot 049K7565V (68%) (Eiwit + watergehalte) </td></tr><tr><td> mica </td><td> Ted Pella </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - Silicon SPM-Sensor </td><td> Nanowereld </td><td> NHC </td><td> Silicon AFM sonde die we gebruiken voor niet voortdurend contact modus </td></tr><tr><td> Veeco nanoprobe Tips </td><td> Veeco (Nu Bruker AFM probes) </td><td> NP-S </td><td> Siliciumnitride AFM sonde die we gebruiken voor contact-modus </td></tr></tbody></table>

in vitro synthese van native, stapel lange afstand en segmentale lange afstand collageen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collageenvezels aanwezig in de extracellulaire matrix van dierlijk weefsel structurele steigers en mechanische sterkte. Deze native collageenfibrillen een karakteristieke strepen periodiciteit van ~ 67 nm en zijn gevormd in vivo door de hiërarchische samenstelling van Type I collageen monomeren, die 300 nm lang en 1,4 nm in diameter. In vitro, door variatie van de voorwaarden voor de monomeer bouwstenen worden blootgesteld, kunnen unieke structuren, variërend in lengte schalen tot 50 micron worden gebouwd, waaronder niet alleen inheemse soort fibrillen, maar ook vezelig lange afstand en segmentale lange afstand collageen. Hierin presenteren we procedures voor het vormen van de drie verschillende collageenstructuren een gemeenschappelijke handel verkrijgbare collageen monomeer. Met behulp van de protocollen die wij en anderen hebben gepubliceerd in het verleden om deze drie soorten maken doorgaans leiden tot mengsels van structuren. In het bijzonder, unbanded fibrillen waren vaak feluid bij het maken van inheemse collageen, en inheemse fibrillen waren vaak aanwezig bij het maken van vezelige lange afstand collageen. Deze nieuwe procedures hebben het voordeel van het gewenste soort collageen fibrillen vrijwel uitsluitend. De vorming van de gewenste structuren wordt gecontroleerd door beeldvorming met een atomic force microscope.

Inheemse collageen Het reactiemengsel van ~ 0,3 mg / ml collageen monomeer in 100 mM fosfaat en 100 mM KCl bij pH 7 op 37 ° C gedurende 3-4 uur een oplossing die native type collageen fibrillen met duidelijke ~ 67 nm D-strepen geven, zonder unbanded fibrillen. Onder een optische microscoop bij 200 maal vergroting kan bosjes meerdere fibrillen normaal gezien op het substraat mica name wanneer bekeken door differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie (figuur 2). In een typisch monster een willekeurige 100 x 100 pm2 scan door AFM zal gewoonlijk tenminste enkele fibrillen die 5-50 micron lang (Figuur 3a-c). Individu kan gescheiden collageenvezels gemakkelijk worden geïdentificeerd,. Met een 512 × 512 pixels 2 image scan, zoomen in een 10 × 10 micrometer 2 scanformaat toont aan dat alle fibrillen zijn geringd (Figuren 3d-f </strong&gt;). Om een nauwkeurige meting van banding periodiciteit, is het het beste om in te zoomen op een 2 × 2 um 2 scanformaat (Figuren 3g-i). Banding periodiciteit kan worden bepaald door eenvoudig meten en middelen van de longitudinale afstand tussen verschillende pieken of dalen. Ook kan de AFM software kan een eendimensionale Fouriertransformatie langs een longitudinale doorsnede kan worden gebruikt. Figuur 4 toont een AFM afbeelding van een hoogte fibril en een overeenkomstige langsdoorsnede. FLS collageen Het reactiemengsel van 1 mg / ml μ1-zuurglycoproteïne en ~ 1 mg / ml collageen monomeer in water bij kamertemperatuur gedurende 30 min levert een oplossing van FLS collageenfibrillen. Bosjes fibrillen, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen bij natief collageen kan zichtbaar op het mica substraat onder een optische microscoop bij 200 x magnification. In een typisch voorbeeld zal een willekeurige 100 x 100 pm2 scan door AFM vertonen gewoonlijk ten minste enkele fibrillen. Met een 512 × 512 pixels 2 image scanformaat, kan de strepen periodiciteit worden gemeten door in te zoomen in een 10 × 10 micrometer 2 scan (figuur 5a) of beter gezegd met een 2 × 2 micrometer 2 scan (figuur 5b). Figuur 5c toont een langsdoorsnede van een FLS fibril. SLS collageen Het reactiemengsel van 2 mg / ml ATP en ~ 0,5 mg / ml collageen monomeer in 100 mM glycine-HCl buffer bij pH 3,3 bij kamertemperatuur gedurende 2 uur levert een oplossing van SLS collageen. Typisch zal SLS kristallieten niet zichtbaar onder een optische microscoop. Een AFM moet de aanwezigheid van SLS kristallieten bevestigen. In een typisch voorbeeld, zal een willekeurige 100 × 100 micrometer 2 scan door de AFM geven over het algemeen veeldots. Inzoomen op een 10 × 10 pm 2 scan zal meestal tonen verschillende SLS kristallieten (figuur 6a). En een 2 x 2 pm2 scan (figuur 6b) toont de fijnere structuur van een SLS kristalliet. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> Figuur 1. De drie structureel verschillende vormen van collageen fibrillen die in vitro zijn gevormd uit collageen monomeer. AFM beelden beeltenis van collageen monomeer en de drie hogere orde collageen structuren allemaal op dezelfde grootte schaal (2 × 2 um 2). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> Figuur 2. Digitale beeld bij ~ 200 x vergroting met optische microscopie van DIC natief collageen fibrillen op mica (a) onaangeroerd en (b) thresholded en geslepen to wijzen op de fibrillen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> Figuur 3. AFM-beelden van natief collageen fibrillen op mica. Intermitterende contact mode AFM amplitude beelden worden getoond. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> Figuur 4. (A) 0,5 x 1 um2 intermitterend contact mode AFM afbeelding hoogte (verticale as = 100 nm) en (b) langsdoorsnede van een natief collageen fibrillen. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> Figuur 5. AFM afbeeldingen van FLS collageenfibrillen op mica. (A) 10 × 10 micrometer 2 contact mode AFM doorbuiging beeld, (b) 2 × 2 micrometer 2 contact mode AFM doorbuiging beeld en (c) longitudinaledoorsnede van een FLS collageen fibrillen. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> Figuur 6. AFM afbeeldingen van SLS collageen op mica. Intermitterende contact mode AFM amplitude beelden worden getoond.

Eenvoudige en reproduceerbare procedures beschreven voor het maken van drie structureel onderscheiden collageen samenstellingen van een gemeenschappelijke handel verkrijgbare Type I collageen monomeer. Inheemse type, kan vezelig lange afstand of segmentale lange afstand collageen worden opgebouwd door het variëren van de voorwaarden voor de 300 nm lang en 1,4 nm diameter monomeer bouwsteen wordt blootgesteld.

In vitro synthese van Native, Stapel Lange Afstand en Segmentale Lange Afstand Collageen

Collageenfibrillen zijn aanwezig in de extracellulaire matrix van dierlijk weefsel om te voorzien in structurele ondersteuning en mechanische sterkte. Deze natuurlijke ...

Het algemene doel van deze procedures is om aan te tonen hoe collageenmonomeer kan worden gebruikt om reproduceerbaar drie verschillende soorten collageenstructuren van een hogere orde te maken. Natuurlijk collageen wordt gevormd door de pH van de collageenmonomeeroplossing te verhogen. Vezelig collageen met lange tussenruimte wordt gemaakt door collageenmonomeer te combineren met alfa-1-zuur glycoproteïne en segmentaal collageen met lange tussenruimte.Collageen wordt gemaakt door collageenmonomeer te mengen met een TP. Uiteindelijk wordt atoomkrachtmicroscopie gebruikt om de drie verschillende typen gevormde collageenstructuren te karakteriseren. Het belangrijkste voordeel van deze protocollen ten opzichte van eerder gepubliceerde procedures is dat ze eenvoudiger zijn en zeer reproduceerbaar bij het vormen van de gewenste collageenstructuren. Deze protocollen zijn de afgelopen 10 jaar in ons laboratorium ontwikkeld, waarbij gebruik is gemaakt van een betrouwbare commerciële bron van collageenmonomeer als startmateriaal. De procedure zal worden gedemonstreerd door Calvin Chang, een promovendus uit mijn laboratorium, om natuurlijke collageenvezels te creëren met een duidelijke banding van 67 nanometer.Begin met het voorverwarmen van een warmteblok tot 37 °C. Bereid vervolgens de bufferoplossing in een microcentrifugebuis door vier µL van een collageenmonomeeroplossing van 3 mg/mL toe te voegen en goed te mengen. De resulterende oplossing moet helder en kleurloos zijn.Plaats het mengsel drie tot vier uur op een op 37 °C voorverwarmd warmteblok om de native collageenfibrillen te laten vormen. De uiteindige oplossing moet licht troebel zijn en zal hoofdzakelijk native collageenfibrillen bevatten om vezelig long spacing collageen te prepareren. Plaats eerst 1 mL van een collageenmonomeeroplossing van 3 mg/mL in een membraan met een molecular weight cutoff van 12 tot 14 kilodalton.Dialyse vervolgens tegen 400 milliliters water, waarbij het water vier keer wordt vernieuwd over een periode van 24 uur. Combineer daarna 20 µL van het gedialyseerde collageenmonomeer met 20 µL ultrapuur water en 20 µL van 3 mg/mL alpha-1-zuur glycoproteïne in water in een microcentrifugebuis en meng dit.Laat het vezelige long-spacing collageen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur assembleren. Tijdens deze periode zal de oplossing veranderen van helder naar troebel om het long-spacing collageen te vormen. Bereid eerst de zure buffer voor in een microcentrifugeebuisje.Voeg 40 µL van 10 mg/mL TP in water toe aan de buffersolutie en meng dit. Voeg tenslotte 33 µL van een collageenmonomeeroplossing van 3 mg/mL in 0,01 N zoutzuur toe en meng om te homogeniseren.Laat het segmentale collagen met lange tussenruimtes gedurende twee uur bij kamertemperatuur assembleren. De uiteindelijke oplossing zal bij deze bereiding helder zijn, in tegenstelling tot de andere twee beschreven vormen van collagen. Om een schoon, vlak oppervlak voor atomaire krachtmicroscopie of een FM te verkrijgen, bevestigt u een stuk plakband aan een A FM-substraat van MICA en pelt u ten minste één laag af.Controleer de tape om te bevestigen dat een volledige laag is verwijderd. Zodra een geschikt oppervlak is verkregen, brengt u 20 µL van de collagen FI-oplossing aan op het mica-substraat en laat u dit vijf minuten rusten. Spoel na vijf minuten de overtollige fibrillen weg door water aan de rand van het mica-substraat toe te voegen en dit gedurende 10 tot 15 seconden over het monster te laten stromen.Voeg geen water direct toe aan het monstergebied. Droog vervolgens het oppervlak met een zachte stroom nitrogengas vanaf één rand van het substraat. Zorg ervoor dat de stroom niet op het centrum van het monster is gericht.Controleer het monster onder een optische microscoop bij een vergroting van 200 x op de natuurlijke en fibreuze lange afstand. Collagenmonsters vertonen klonters fibro, terwijl de segmentale lange afstand van collageen niet zichtbaar is. De unieke kenmerken van de verschillende collagenen kunnen zo optimaal worden waargenomen.Voer met een AFM een initiële vierkante scan van 100 bij 100 micrometer uit en zoom vervolgens in naar scanmaten van 10 bij 10 micrometer vierkant, en tenslotte twee bij twee micrometer vierkant. Om de periodiciteit van de bandvorming van natuurlijk en vezelig longweefsel te observeren. Collageen vormde de fijnere kenmerken van het segmentale collageen in de longruimte.Gebruik voor native collageen-fibrillen de atoomkrachtmicroscoop in de intermittent contact-modus met een silicium-AFM-probe voor fibrous long spacing en segmental long spacing. Gebruik voor collageen-fibrillen de atoomkrachtmicroscoop in de contact-modus en hanteer siliciumnitride-AFM-probes voor de beste resultaten. Controleer ten minste twee andere regio's op het collageenmonster om te verifiëren dat de initiële scans representatief zijn.De hoge ruimtelijke resolutie van een AFM is ideaal voor het karakteriseren van de verschillende collagenpreparaten die in deze video worden beschreven. Het maakt gemakkelijk onderscheid tussen native collageenvezels, fibrous long spacing collagen en segmental long spacing collagen. Optische microscopietechnieken, zoals differentieel interferentiecontrast-microscopie, tonen de vezels wel, maar zijn niet in staat om de kenmerken op nanometerschaal te tonen die de drie typen collageen die met deze methoden zijn geprepareerd, van elkaar onderscheiden. In een typisch monster laat een willekeurige scan van 100 bij 100 micrometer met een AFM ten minste enkele individueel gescheiden fibrillen zien met een lengte van 5 tot 50 microns.Collageen-fis kunnen in dit stadium gemakkelijk worden geïdentificeerd; bij een vergroting tot een scanformaat van 10 micrometer kwadraat is te zien dat alle fis gebandeerd zijn. Om dePeriodiciteit van de bandering nauwkeurig te meten, is het optimaal om in te zoomen op een scanformaat van twee bij twee micrometer kwadraat. Inzoomen op een scanformaat van 10 bij 10 micrometer kwadraat laat zien dat alle fibrillen gebandeerd zijn.Om de periodiciteit van de banden nauwkeurig te meten, is het raadzaam om in te zoomen op een scanformaat van twee bij twee micrometer. De bandperiode neemt toe wanneer het collageen wordt geprepareerd volgens de procedure voor collageen met lange tussenruimtes, wat herhalingen van 270 nanometer langs de vezellengte oplevert. In een typisch monster laat een willekeurige scan van 100 bij 100 micrometer met een FM ten minste enkele fibrillen zien.De periodiciteit van de banden is zichtbaar door in te zoomen op een scan van 10 bij 10 micrometer en is eenvoudig meetbaar met een scan van 2 bij 2 micrometer. Ten slotte vormt het segmentale long spacing collageen helemaal geen vezels, maar individuele segmenten. In een typisch monster vertoont een willekeurige scan van 100 bij 100 micrometer met een FM veel individuele stippen.Een nauwere scan van 10 bij 10 micrometer laat verschillende SLS-kristallieten zien en een scan van 2 bij 2 micrometer toont de fijnere structuur van een SLS-kristalliet. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uniforme, volwassen, natuurlijke FLS- en SLS-collageenconstructen maakt van commercieel verkrijgbaar collageenmonomeer. Collageen is een biocompatibel materiaal dat nuttig is als substraat of als steiger voor het kweken van cellen en weefsels.Met deze procedure kunt u starten met gewenste collageenstructuren voor deze en andere toepassingen.

in-vitro-synthesis-native-fibrous-long-spacing-segmental-long-spacing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een methode wordt beschreven voor de bereiding van een 3-dimensionale matrix van collageen type I en primaire humane fibroblasten. Deze organotypische gel dient als nuttige substraat invasieve celmigratie beoordelen omdat het bootst basiskenmerken van weefsel stroma en vatbaar is voor vele vormen van microscopie.

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

Traditionele procedures voor de isolatie van oplosbare type 1 collageen (COL1) hebben ongeveer 10 dagen van start tot finish vanwege langdurige buffer incubatie en moeizame resuspensions van fibrillen. We beschrijven hier een middel te zuiveren KOL1 van kleine huid biopten in minder dan 3 uur.

Een verbeterde werkwijze voor de bereiding van type I collageen van de huid

Deze procedure laat zien in vivo nabij infrarood fluorescentie beeldvorming van collageen remodeling activiteiten in muizen als ex vivo kleuring van collageen in het weefsel secties met behulp van gekooid collageen mimetische peptiden die kunnen worden foto-getriggerd om te hybridiseren met gedenatureerde collageen strengen.

Beeldvorming Gedenatureerd Collageen Strengen<em&gt; In vivo</em&gt; En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via-Foto getriggerd Hybridisatie van Caged Collageen Mimetic Peptiden

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft hoe u een 2D gemengde matrix voorbereidt, bestaande uit gelatine en collageen I, en een 3D collageen I plug om lineaire invadosomen te bestuderen. Deze protocollen staan ​​voor de studie van lineaire invadosoomvorming, matrixdegradatieactiviteit en de invasiemogelijkheden van primaire cellen en kankercellijnen.

2D en 3D matrices om Lineaire Invadosome Formatie en Activiteit te bestuderen

Dit artikel presenteert een strategie voor het bouwen van eindige-elementenmodellen van vezelige geleidende materialen die zijn blootgesteld aan een elektrisch veld (EF). De modellen kunnen worden gebruikt om de elektrische input te schatten die cellen die in dergelijke materialen zijn gezaaid, te schatten en de impact te beoordelen van het veranderen van de materiaaleigenschappen, structuur of oriëntatie van de steiger.

Eindige element modellering van een cellulair elektrisch micromilieu

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Het volgende protocol presenteert een op afschuiving gebaseerde extrusiemethode voor de fabricage van collageenhydrogels met fibrillen met nanoschaalpatronen, die kan worden toegepast op een breed scala aan weefselengineeringtoepassingen.

Productie van collageen met nanofibrillaire patronen voor weefselmanipulatie

Leer de synthese van native, fibrous long spacing en segmental long spacing collageen uit Type I collageenmonomeer. Deze reproduceerbare protocollen gebruiken atoomkrachtmicroscopie voor karakterisering.

In vitro synthese van Native, Stapel Lange Afstand en Segmentale Lange Afstand Collageen

Meer video's verkennen