Name: Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van Arabidopsis Cotyledon Epidermis Bij het ontkiemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Leer langdurige confocale time-lapse imaging van Arabidopsis cotyledon epidermis tijdens ontkieming. Deze methode maakt dynamische visualisatie van eiwitlokalisatie en celdeling mogelijk voor plantbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Amanda Rychel voor hulp bij de ontwikkeling van de time lapse-protocol en Lynn Pillitteri voor de bouw van POLAR :: POLAR-eGFP. We zijn ook dankbaar ABRC voor het verstrekken van de pm-rb te construeren. Dit protocol is ontwikkeld door middel van een ondersteuning van de PRESTO award uit Japan Wetenschap Technologie en het Agentschap. Onderzoek naar POLAR werd ook ondersteund door de Universiteit van Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) en de National Science Foundation (MCB-0855659). KMP is een NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), en KUT is een HHMI-GBMF onderzoeker.

1. Zaadsterilisatie <ol><li> Bereid zaadsterilisatie oplossing: 33% bleekmiddel, 0,1% Triton X-100. </li><li> Place zaden die gewenste fluorescerende reporter construct (s) en genotype (s) in 1,7 ml buis en toepassing van 1 ml sterilisatieoplossing. Incubeer op nutator gedurende 15 minuten. </li><li> In een steriele kap, gebruik maken van een pipet om sterilisatie oplossing te verwijderen van de buis, waardoor er zaden achter. Spoelen met 1 ml steriel water. Herhaal vier keer. </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende twee dagen of meer. </li></ol> 2. Voorbereiding van Kamer Schuif Media <ol><li> Meng 20 ml van 0,5% oplossing van Bacto Agar (niet zuiver agarose) in water in een 200 ml kolf en magnetron tot opgelost. Wees voorzichtig bij het koken van de oplossing. </li><li> Koel de oplossing tot ongeveer 60 ° C. </li><li> Verzamel 1 ml agar-oplossing met een pipet en langzaam van toepassing op de dekking van glas in de kamer dia (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Duitse coverglass System). Oplossing waarin is te heet of te snel toegepast kunnen lijm of crack glas smelten. </li><li> Onmiddellijk een tweede ml agar-oplossing. Agar nu volledig bedekken de bodem van de dia kamer. Deze minimale media is voldoende om ontwikkeling in een plant cotyledon die opgeslagen voedingsstoffen, vier tot vijf dagen door het handhaven zodat vocht en gas diffusie bevat. </li><li> Cool dia op benchtop met kamer bedekt. Als kolf wordt goed afgesloten kan worden opgeslagen en oplossing opgewarmd voor toekomstig gebruik. </li></ol> 3. Zaad Dissection <ol><li> Verwijderen tube steriel zaad van 4 ° C opgeslagen. </li><li> Plaats een papieren zakdoek op het podium van een dissectiemicroscoop en bevochtig met water. Stel weefsel een glad oppervlak te maken. Weefsel wordt gebruikt om zaden voor dissectie stabiliseren. </li><li> Pipet 20 tot 30 zaden van de buis aan het weefsel, en voorzichtig om ze te plaatsen in het gezichtsveld van de ontleden reikwijdte&#39;s standpunt. </li><li> Met behulp van scherpe pincet (Roboz, # 5 biologie tip), Verwijder voorzichtig de zaadhuid van de zaailing binnen. Zowel buitenste en binnenste integumenten worden verwijderd. </li><li> Bij beeldvorming de zaadlob, is het gunstig te verwijderen en de hypocotyl kiemwortel. Zaadlobben bevatten voldoende voedingsstoffen te ontwikkelen voor meerdere dagen onder dit protocol. Als intact zal de hypocotyl recht en dramatisch verlengen, bewegen de zaadlob van het tijdsverloop gezichtsveld. Gebruik een scalpel om de zaadlobben vrij van de hypocotyl snijden. </li><li> Houd ontleed cotyledonen ondergedompeld in water, in een microbuis of dergelijke. </li><li> Herhaal 3.4-3.6 totdat het gewenste aantal zaadlobben bereikt. 15 tot 20 succesvolle dissecties worden aanbevolen voor de montage. </li></ol> 4. Montage zaadlobben in de Kamer Dia <ol><li> Met behulp van een kleine (18 mm 2) dekglas, dwars door de agar media en de gehele laag optillen van glas de kamer dia basis. </li><li> Pipet ontleed zaadlobben met een minimum aan water vasthoudenbuis in de kamer glijbaan, onder de opgeheven agar laag. </li><li> Sluit voorzichtig de agar op de zaadlobben. Als er teveel water aanwezig is, laat deze weg met een tissue, en let niet op de zaadlobben verstoren. Specimens moeten niet langer gemakkelijk te verplaatsen wanneer mount is voltooid. </li><li> Plaats de deksel op de kamer dia en zet schuif naar microscoop podium. </li></ol> 5. Time Lapse Imaging <ol><li> Stel omgekeerde confocale microscoop om de afbeelding op de gewenste fluorofoor (s). Gebruikt LSM700 parameters: voor GFP, excitatie bij 488 nm en de inning met een band pass filter op 440 tot 530 nm, want RFP, excitatie bij 555 nm en de inning met een band pass filter op 570 tot 610 nm. </li><li> Inspecteer gemonteerd exemplaren op beschadigingen. Programmeer de locaties van intacte, goed gemonteerd zaadlobben in microscoop software. In Zen 2009: Focus op een zaadlob met 20x objectief en objectief naar het centrum van de kamer dia verplaatsen. Onder Acquisitie modus, veranderen Zoom tot 0,5 en frame &lt;/ Em&gt; om 48x48 pixels. Selecteer posities checkbox en Scan overzichtsbeeld ... knop onder posities, dan stijgen horizontale en verticale tegel nummers 30-35. Wanneer scan is voltooid, klikt u op de posities knop onder de afmetingen tabblad en de plaats vizier op elke zaadlob te observeren. </li><li> Stel z serie omvat de zaadlob epidermis van alle samples.In Zen 2009: Klik op de Z-Stack uit. Selecteer elke positie onder Positie en klik op de knop Verplaatsen naar. Focus op de bovenste vlak van de zaadlob epidermis en klik op de eerste knop onder Z-Stack. Focus op de laagste stand waarin epidermis is nuttig zichtbaar en klik op de knop Laatst. Klik op de knop naast Optimal, waaruit blijkt de beste z-slice dikte, in te stellen. Controleer elke zaadlob om te bevestigen dat deze instellingen alle monsters omvatten, de z parameters kunnen niet worden ingesteld voor individual posities in Zen 2009. </li><li> Stel tijdreeksen op de gewenste resolutie en lengte. Intervallen van 15-30 min voor drie dagen zijn effectief voor eiwit dynamiek in epidermale celdeling. Dit kan worden gewijzigd indien nodig. In Zen 2009: Klik op het Time Series uit. Onder Time Series, stelt Cycli voor het aantal beelden gewenst met behulp van de schuifregelaar of typen in het tekstveld. Stel Interval tot 30 en gebruik de pull-down menu om min te selecteren. </li><li> Begin xyzt multi-positie scan. Merk op dat het aantal posities te beperken door de scan specificaties als totale scantijd groter is dan de gewenste interval, de tijdstippen niet juist. Maximaal zes gelijktijdige posities mogelijk bij beeldvorming GFP en RFP op 59 z-segmenten in 30 min interval met ons systeem. In Zen 2009: Change Frame Grootte op de gewenste resolutie en klik op Start Experiment. </li></ol> 6. Videobewerking <ol><li> Uit de confocale gegevensbestand, maken een maximale intensiteit z-projectie van elke tijd / positie combinatie en export als beeldbestanden in een lossless formaat zoals TIFF. Bestandsnamen moeten worden in een reeks per positie (bijvoorbeeld POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, enz., niet POLAR-GFP_0001_pos1) voor software om ze te combineren in een film. In Zen 2009: Gebruik Copy: Subset onder het tabblad Verwerking om posities te splitsen in aparte bestanden, dan Maximum Intensity Projection. Tot slot, exporteren als TIFF (Bestand: Export, Volledige resolutie beeldvenster - serie). </li><li> Gebruik FIJI 7,8 beelden achter elkaar af te stemmen door het uitvoeren van de macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Registratie: bUnwarpJ). Wijzig Registratie Mode op Mono. Alle Geavanceerde opties kunt gebruiken standaardwaarden. Voor lange time lapse sequenties, downloadt en installeert u de macro &quot;Affine + Consistent Elastische 2D beeldregistratie&quot;, die bUnwarpJ automatisch van toepassing zijn op een serie beelden, en open yonze gegevens met behulp van File: Import: Afbeelding Sequence om het te gebruiken. Haal het vinkje weg MOPS monumenten extractie en run. </li><li> Gebruik FIJI / ImageJ of Quicktime Pro om de volgorde van de uitgelijnde afbeeldingen te openen en in de gewenste video formaat (AVI is een goede keuze) op te slaan. </li></ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64(1983).</li>
<li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoe%2C+V+%22Development+of+Drosophila+melanogaster%22">Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).</li>
<li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449(1995).</li>
<li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854(2002).</li>
<li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division%2C+Cell+Growth%2C+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74(2004).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260(2011).</li>
<li>Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: 
		
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji">http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji</a> (2008).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36(2004).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArganda-Carreras%2C+I+%22Computer+Vision+Approaches+to+Medical+Image+Analysis%2C+ser.+Lecture+Notes+in+Computer+Science%22">Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science</a>. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).</li>
<li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+of+the+Mouths+of+Plants%3A+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296(2010).</li>
<li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011(2007).</li>
<li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619(2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze time-lapse confocale techniek maakt longitudinale studies van fluorescent gemerkte eiwit expressie en lokalisatie in afzonderlijke cellen van de epidermis Arabidopsis cotyledon die bij POLAR en dynamisch veranderende eiwitten is essentieel voor een goed begrip van hun functie. Eerder heeft geleidelijk time lapse imaging gebruikt om Arabidopsis wortel schimmelinfectie 11 en meristeem groei 5,12 onderzoeken, maar het toevoegen van de zaadlob epidermis vergroot de veelzijdigheid...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> One-kamer slide </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Of twee-kamer (155379) </td></tr><tr><td> Laser scanning confocale microscoop </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Zen 2009 software </td></tr><tr><td> 20x objectief </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0,8, Plan-APOCHROMAT </td></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop </td><td> Benz (National) </td><td> 431TBL </td><td> Verlicht van beneden </td></tr><tr><td> # 5 pincet, biologie tip </td><td> Roboz Chirurgisch instrument </td><td> RS-4978 </td><td> Zeer fijne tipskritisch </td></tr></tbody></table>

lange termijn, hoge resolutie confocale time lapse imaging van<em&gt; arabidopsis cotyledon</em&gt; epidermis bij het ontkiemen

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamiek van cellulair gedrag gedurende een ontwikkelingsvolgorde een krachtige techniek voor het begrijpen van de mechanismen van weefsel patronen zijn. Tijdens de dierlijke ontwikkeling, de belangrijkste celproliferatie en patroonvorming gebeurtenissen zeer snel. Bijvoorbeeld in Caenorhabditis elegans alle celdelingen die voor de larven bouwplan worden binnen zes uur na bevruchting, met zeven mitotische cycli 1, zestien of meer mitosen van Drosophila embryogenese bij minder dan 24 uur 2. Daarentegen celdelingen tijdens plantenontwikkeling traag, typisch in de orde van een dag 3,4,5. Dit legt een unieke uitdaging en een noodzaak voor de lange termijn live beeldvorming voor het documenteren van dynamische gedrag van celdeling en differentiatie gebeurtenissen tijdens fabriek organogenese. Arabidopsis epidermis is een uitstekend modelsysteem voor het onderzoeken van signalering, lot van de cel, en de ontwikkeling van planten. In de zaadlob, dit weefsel bestaat uit lucht-en waterbestendig stoep cellen afgewisseld met gelijkmatig verdeeld huidmondjes, kleppen die open en dicht bij de gasuitwisseling en verlies van water te controleren. Juiste afstand van deze stomata is cruciaal voor de functie en de ontwikkeling volgt een reeks asymmetrische deling en celdifferentiatie stappen om de georganiseerde epidermis (Fig. 1) te produceren. Dit protocol maakt waarneming van cellen en eiwitten in de epidermis over verschillende dagen van ontwikkeling. Deze termijn maakt een nauwkeurige documentatie van stam-celdelingen en differentiatie van epidermale cellen, met inbegrip van huidmondjes en epidermale stoep cellen. Fluorescerende eiwitten worden gefuseerd om eiwitten van belang hun dynamiek beoordelen tijdens celdeling en differentiatie. Deze techniek staat te begrijpen het lokaliseren van een nieuw eiwit, POLAR 6, tijdens de fase van proliferatie stomatale-lineage cellen in the Arabidopsis cotyledon epidermis, waar het wordt uitgedrukt in cellen voorafgaand asymmetrische deling gebeurtenissen en verplaatst naar een karakteristiek deel van de cel cortex kort voor splitsing optreedt. Afbeeldingen kunnen worden geregistreerd en gestroomlijnd video gemakkelijk geproduceerd met behulp van public domain software om dynamische eiwit lokalisatie en celtypen te visualiseren als ze veranderen in de tijd.

<html> Een reeks informatieve tijdstippen verzameld deze methode wordt getoond in figuur 3. Celmembranen zijn gelabeld met RFP (pm-rb) en GFP gefuseerd met POLAR eiwit onder zijn oorspronkelijke promotor (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Bij de 30-min tijdschaal, zien we celdelingen, samen met de veranderingen in de eiwit lokalisatie daaraan voorafgaande. Asymmetrische celdelingen in de stomatale lijn vorm stamcelachtige zoals stomata precursors genoemd meristemoids, die het vermogen verdere asy...

We beschrijven een protocol met behulp van dia&#39;s kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Het in vivo visualiseren van de dynamiek van cellulair gedrag gedurende een ontwikkelingsreeks kan een krachtige techniek zijn om de mechanica van weefsel...

Het doel van het volgende experiment is om de vroege gebeurtenissen van de epidermale ontwikkeling na kieming van het zaad op cellulair niveau te visualiseren. Dit wordt bereikt door in eerste instantie de zaadhuid te verwijderen om in een tweede stap een duidelijk zicht op de kosin mogelijk te maken. De kosin worden gemonteerd onder een laag agarmedium dat hen immobiliseert en hun ontwikkeling ondersteunt; vervolgens wordt er gedurende meerdere dagen time-lapse imaging uitgevoerd om de groei en deling van epidermale cellen in vivo waar te nemen.Er zijn resultaten verkregen die dynamische genexpressie en eiwitlokalisatie tonen op basis van zichtbare fluorescentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals stilstaande beelden van Gus-kleuring of GFP-fusies, is dat het de dynamische beweging van eiwitten tijdens celdeling en differentiatie laat zien. De Arabidopsis-zaden voor dit experiment worden gesteriliseerd in een sterilisatieoplossing bestaande uit 33% huishoudbleekmiddel en 0,1% Triton X 100; plaats de zaden met de gewenste fluorescente reporterconstructen en genotypen in een buisje van 1,7 milliliter, voeg één milliliter sterilisatieoplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten op een agitator.Verwijder in een steriele werkbank met een pipet de sterilisatieoplossing uit de buis, zodat de zaden achterblijven. Spoel met één milliliter steriel water. Herhaal dit vier keer na de vierde spoelbeurt.Incubeer gedurende twee of meer dagen bij 4 °C. Om de chamber slide voor te bereiden, mengt u 20 ml van een 0,5% oplossing van bact to agar in water in een kolf van 200 ml en verwarmt u dit in de magnetron tot het is opgelost. Wees voorzichtig wanneer de oplossing kookt.Verwarm de oplossing tot ongeveer 60 °C. Een oplossing die te heet is of te snel wordt aangebracht, kan de lijm doen smelten of het glas van het kamerslide doen barsten. Wanneer de agar-oplossing voldoende is afgekoeld, neem dan één milliliter op met een pipet en breng dit onmiddellijk langzaam aan op het dekglas binnen het kamerslide.Voeg een tweede milliliter agaroplossing toe. Het agarmedium moet nu de bodem van het kamerglaasje volledig bedekken. Dit minimale medium is voldoende om de ontwikkeling in een plantoleïne te ondersteunen, wat vier tot vijf dagen lang opgeslagen voedingsstoffen bevat door vocht vast te houden en gasdiffusie mogelijk te maken.Leg het objectglas met de afgedekte kamer op de werkbank. Verwijder aan het begin van deze procedure de buis met steriele zaden uit de opslag bij vier graden Celsius. Plaats een papieren tissue op de tafel van een dissectiemicroscoop, bevochtig deze met water en pas aan om een glad oppervlak te creëren.Het weefsel wordt gebruikt om de zaden te stabiliseren tijdens de dissectie. Pipetteer 20 tot 30 zaden vanuit de buis op het weefsel, waarbij u er zorg voor draagt dat ze in het gezichtsveld van de dissectiemicroscoop worden geplaatst. Het dissekeren van de co leadin is het meest uitdagende aspect van deze procedure.Het gebruik van een lage vergroting en scherpe pincetten, in combinatie met uiterste voorzichtigheid, draagt bij aan een succesvolle dissectie. Verwijder met scherpe pincetten voorzichtig de zaadhuid van het kiemplantje; zowel de buitenste als de binnenste integumenten moeten worden verwijderd. Gebruik vervolgens een scalpel om het cotyledon vrij te snijden van het hypocotyl en de radicula.Het is gunstig om de hypercotyle en de wortel te verwijderen voor beeldvorming, omdat de hypercotyle bij intacte toestand drastisch zal strekken en verlengen. Verplaats de cos leadin uit het gezichtsveld van de time-lapse en houd de gedisseceerde cos leadin ondergedompeld in water. Herhaal de zaaddissectie totdat het gewenste aantal Olean is bereikt.Het wordt aanbevolen om 15 tot 20 succesvolle dissecties uit te voeren voordat de olean in het kamerglaasje wordt geplaatst. Om het kamerglaasje voor te bereiden op het plaatsen van de cotan, gebruikt u een klein dekglasje om door het agarmedium te snijden en de gehele laag op te tillen van de glazen bodem van de kamer. Schuif de gedissecteerde cotan met een minimale hoeveelheid water met een pipet vanuit de bewaarbuis in de kamer.Schuif het onder de opgetilde agarlaag. Laat de agar voorzichtig op de sedins zakken. Als er overtollig water aanwezig is, absorbeer dit dan met een tissue.Zorg ervoor dat het sediment niet wordt verstoord wanneer de montage is voltooid. De specimens mogen niet langer gemakkelijk bewegen. Plaats het dekglas op het kamerglaasje en breng het glaasje over naar de objecttafel van de microscoop.Stel vóór de beeldvorming de geïnverteerde confocale microscoop in om de gewenste fluorofoor te beelden. De LSM 700-parameters zijn ingesteld op GFP-excitatie van 488 nanometers en collectie, met een banddoorlaatfilter van 440 tot 530 nanometers, en voor RFP-excitatie op 555 nanometers en collectie.Gebruik een banddoorlaatfilter van 570 tot 610 nanometer met een 20x objectief. Focus op de ACO-inleiding en verplaats het objectief naar het midden van de kamer. Schuif naar de acquisitiemodus, wijzig de zoom naar 0,5 en de framegrootte naar 48 bij 48 pixels.Selecteer het selectievakje 'positions' en de overzichtsafbeelding van de scan en verhoog vervolgens het aantal horizontale en verticale tegels naar 30 tot 35. Klik op de scanknop om te beginnen met scannen. Wanneer de scan is voltooid, klikt u op de knop 'positions' onder het tabblad 'dimensions' en plaatst u kruisdraaden bij elke cot lead die u wilt observeren.Inspecteer de gemonteerde specimens op beschadigingen. Verwijder de posities die overeenkomen met beschadigde coss leadin zodat alleen geschikte specimens voor beeldvorming overblijven. Stel vervolgens een Z-serie in die de coss leadin epidermis van alle monsters omvat.Klik op het selectievakje Zack. Selecteer elke positie onder de positielijst en klik op de knop move to. Focus op het bovenste vlak van de cos-lead in de epidermis en klik op de knop set first onder Zack.Focus op de laagste positie waarbij de epidermis bruikbaar zichtbaar is. Klik vervolgens op de knop 'set last'. Klik op de knop naast 'optimal', die de beste Z-plakdikte aangeeft om in te stellen.Controleer elke kos lead-in om te bevestigen dat deze instellingen alle monsters omvatten. De Z-parameters kunnen niet voor individuele posities worden ingesteld. In de hier gebruikte Zen 2009-software kunnen tijdreeksen worden opgezet met de gewenste resolutie; lengte-intervallen van 15 tot 30 minuten gedurende drie dagen zijn effectief voor proteïnedynamiek bij epidermale celdeling, maar intervallen kunnen indien nodig worden gewijzigd.Vink het vakje 'time series' aan onder 'time series set cycles' voor het gewenste aantal beelden door dit in het tekstveld te typen, stel het interval in op 30 en gebruik het uitklapmenu om 'MIN' te selecteren om de XY, ZT multi-positie scan te starten; wijzig de framegrootte naar de gewenste resolutie en klik op 'start experiment' om de gegevens te verzamelen. Houd er rekening mee dat het aantal posities beperkt moet worden door de scanspecificaties. Als de totale scantijd groter is dan het gewenste interval, zullen de tijdstippen niet correct zijn.Met dit systeem zijn maximaal zes gelijktijdige posities mogelijk bij het beelden van GFP en RFP over 59 Z-coupes in een interval van 30 minuten. Een voorbeeld van een set informatieve tijdstippen die met deze methode zijn verzameld, wordt hier getoond. Celmembranen zijn gelabeld met RFP en GFP gefuseerd aan een polair eiwit onder zijn natuurlijke promoter.De afbeeldingen in serie A laten zien dat polair GFP aanvankelijk gelijkmatig verdeeld is en vervolgens ongeveer twee uur vóór de asymmetrische delingen, aangegeven door de pijlpunten, verschijnt. Polair GFP segregeert weg van de plaats van de beginnende meister OID in serie B na de eerste asymmetrische deling, aangegeven door de pijlpunt bij 47 uur. Polair GFP verdwijnt in beide cellen.Dit suggereert een snelle overgang naar de status van sluitcelmoedercel door de merisoïde; de met een asterisk aangegeven sluitcelmoedercel deelt symmetrisch en differentieert tot stomataire sluitcellen, terwijl de cysto-cel polaire GFP-expressie hervint, wat vermoedelijk voorafgaat aan een latere asymmetrische deling. Hier wordt een gestroomlijnde, geregistreerde video getoond van polaire GFP-lokalisatie tijdens de amplificatie en spreiding van één stomataire precursorcel. Aanvankelijk verschijnt polaire GFP uniform in de cel tegen 39 uur na kieming.Het polariseert sterk vlak voor een deling bij 40 uur, waarbij een kleinere dochtercel aan het tegenovergestelde uiteinde van de cel wordt geplaatst. De grotere cel aan de rechterkant herstelt ook de identiteit van de stomatale lijn en bij 45 uur verschuift de polaire GFP-lokalisatie naar een positie naast de stomatale precursor. De deling bij 47 uur produceert een nieuwe stoma-voorloper aan de rechterkant, georiënteerd weg van de bestaande stoma-voorloper aan de linkerkant van de eerste stoma-voorloper.Het eindresultaat is dat twee huidmondjes door één cel van elkaar gescheiden zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe langdurige time-lapse opnamen van een kiemende cotyleon kunnen worden gebruikt om genexpressie en eiwitlokalisatie in de epidermis tijdens de ontwikkeling te beoordelen.

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven het gebruik van perfluorodecalin als een infiltratieve montage medium. Dit is een eenvoudige methode voor het verbeteren van de diepte van beeldvorming...

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Hier wordt een simpele techniek voor de confocal time-lapse beeldvorming van wortel- en hypocotyloplossing met hoge resolutie voor maximaal 3 dagen gegeven met behulp van hoge numerieke diafragma-doelstellingen en perfluorodecaline als onderdompelingsmedium.

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Wij bieden een methode voor het identificeren van modulatoren van bladtranspiratie door grootschalige screening van een samengestelde bibliotheek.

Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Leer langdurige confocale time-lapse imaging van Arabidopsis cotyledon epidermis tijdens ontkieming. Deze methode maakt dynamische visualisatie van eiwitlokalisatie en celdeling mogelijk voor plantbiologisch onderzoek.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van

Meer video's verkennen