Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood
October 21st, 2012
Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van ACF een of SNF twee H knockdown op E vier of vier geïnduceerde celdood te observeren. Dit wordt bereikt door het genereren van cellijnen waarin ACF een of SNF twee H srna-expressie conditioneel wordt geactiveerd door toevoeging van doxycycline, wat resulteert in verminderde niveaus van ACF een of SNF twee H eiwit als tweede stap. Cellen van de verkregen cellijnen worden behandeld met doxycycline om ACF een of SNF twee H-expressie te verminderen of worden niet behandeld.
Vervolgens wordt E vier of vier geëxpresseerd in de cellen met of zonder S-H-R-N-A resistente ACF een of SNF twee H. Om het effect van ACF een of SNF twee H op E vier of vier geïnduceerde celdood te onderzoeken, worden resultaten verkregen die de impact van ACF een of SNF twee H-niveaus op E vier of vier toxiciteit laten zien op basis van het tellen van nucleo met apoptotische morfologie met behulp van de JY-assay. Het grote voordeel van deze techniek boven andere methoden, zoals transiente transfectie van RNA's, is dat alle cellen de S-H-R-N-A tot expressie brengen en het percentage cellen dat samen met traditioneel plasmide tot expressie brengt hoger is. Deze methode geeft inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de door 4 0 4 geïnduceerde celdood, maar kan ook worden toegepast op de studie van andere protische eiwitten.
Naast Ana Lafe zal een onderzoeker uit mijn laboratorium delen van deze procedure demonstreren Om de procedure voor het genereren van inductible cellijnen te starten, plateer T-Rex 2 9 3-cellen met een dichtheid van ongeveer vijf maal 10 tot de zes cellen per 10 centimeter plaat in acht milliliter DMEM met serum zonder tetracycline en met vijf microgram milliliter blaster aside. Incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide op de volgende dag. Vervang het medium met acht milliliter vers medium voorafgaand aan transfectie. Het plasmide voor transfectie is het P superior neo plus GFP-plasmide dat codeert voor ACF een of SNF twee H-S-H-R-N-A, aangedreven door een tetracycline-inductibele H een-promotor, evenals het neomycine-resistentiegen gefuseerd met GFP en aangedreven door een constitutief PGK-promotor.
Voeg 10 microgram plasmide-DNA toe aan 500 microliter 150 millimolair natriumchloride en vortex. Voeg vervolgens het jet PY-reagens toe met twee microliter per microgram DNA aan een andere buis met 500 microliter 150 millimolair natriumchloride en vortex. Voeg de jet pie-oplossing toe aan het DNA en meng goed door te vortexen.
Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na 15 minuten pipetteer je voorzichtig de DNA-complexen op de 10 centimeter platen met 70 tot 80% confluentie. T-Rex 2 9 3-cellen meng op de volgende dag.
Vervang het medium met een selectief medium, in dit voorbeeld DMEM zoals voorheen, dat 500 microgram per milliliter G vier 18 bevat. Bewaak de cellen gedurende de volgende twee weken. Vervang het selectieve medium elke drie tot vier dagen met een soortgelijk vers medium totdat kolonies verschijnen.
Identificeer kolonies met het blote oog en markeer hun locatie op de bodem van de plaat met een gekleurde marker. Controleer onder de microscoop of de kolonies goed gescheiden zijn. Kolonies kunnen geïsoleerd worden zodra ze groot genoeg zijn om zonder microscoop te visualiseren.
Voor het succes van deze procedure is het belangrijk om goed gescheiden kolonies te kiezen tijdens de kolonie-isolatie. In een steriele kap, zuig het medium van de plaat af. Spoel voorzichtig met PBS en zuig alle resterende vloeistof af.
Voeg drie microliter 0,25% trips in EDTA toe aan één kolonie op de plaat door de trips herhaaldelijk in te drukken totdat de cellen van de plaat loslaten. Breng de cellen over naar selectief medium in een put in een 24-wellsplaat. Herhaal dit voor verschillende andere kolonies op de plaat.
Laat de cellen groeien bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide totdat ze de put vullen. Splits vervolgens de cellen van elke oorspronkelijke kolonie in drie putten in een afzonderlijke 12-wellsplaat en incubeer overnacht op de volgende dag. Vervang het medium in één plaat met medium dat één microgram per milliliter doxycycline bevat vanuit een voorraadoplossing bereid in twee keer gedistilleerd water.
Vervang het medium in een controleplaat met medium zonder doxycycline. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide gedurende 72 uur. Cellen uit één behandelde en één onbehandelde put worden vervolgens geoogst voor western blot-analyse om de efficiëntie van ACF een of SNF twee H knockdown te bepalen. Een representatief resultaat wordt hier getoond.
Deze blot werd gekleurd met antilichamen tegen SNF twee H en alfa-tubuline. Dit laatste dient als een ladingscontrole. Twee van de klonen. Nummer vier en nummer vijf vertoonden een sterke reductie van SNF twee H na doxycycline-inductie en worden dus gekozen voor gebruik in het knockdown-experiment, dat in het volgende segment zal worden gedemonstreerd.
De onbehandelde cellen in de derde plaat zullen worden gebruikt om de geselecteerde cellijn uit te breiden en aliquoten van die cellen zullen vervolgens worden ingevroren. Voor verder gebruik om knockdown van ACF een of SNF twee H te induceren, plateer cellen in selectief medium in 10 centimeter platen, voeg doxycycline toe bij één microgram per milliliter aan de helft van de platen en incubeer bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide gedurende 48 tot 72 uur. Elke groep platen moet de cellen leveren voor 12 zes centimeter platen, inclusief twee duplicaten voor de DPI-assay voor elk punt, evenals één plaat voor western blot-analyse van elk monster.
48 tot 72 uur na inductie trypsiniseer de cellen uit elke groep cellen en na het tellen plateer 1,5 keer 10 tot de zes cellen per zes centimeter plaat in hetzelfde medium met of zonder doxycycline. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide overnacht op de volgende dag, transfecteer de cellen. Zoals aangegeven.
Zowel de onbehandelde als de doxycycline-behandelde
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van de ACF chromatine-hermodelleringsfactor in E4orf4-geïnduceerde celdood. Door gebruik te maken van conditionele knockdown van ACF-subeenheden Acf1 en SNF2h, werden de effecten op de cellevensvatbaarheid gemeten door middel van een DAPI-assay.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Chromatine-hermodellering
- Apoptose
Achtergrond
- ACF is een chromatine-hermodelleringsfactor die de genexpressie beïnvloedt.
- E4orf4 is bekend om het induceren van celdood in bepaalde contexten.
- Inzicht in de mechanismen van celdood kan inzichten bieden in therapeutische doelwitten.
- Conditionele knockdown-technieken maken nauwkeurige manipulatie van genexpressie mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om de bijdrage van ACF-subeenheden aan E4orf4-geïnduceerde celdood te beoordelen.
- Om een model te vestigen voor het bestuderen van de effecten van chromatine-hermodellering op apoptose.
- Om doxycycline-induceerbare systemen te gebruiken voor gecontroleerde genexpressie.
Gebruikte methoden
- Generatie van cellijnen met conditionele knockdown van Acf1 en SNF2h.
- Behandeling van cellen met doxycycline om knockdown te induceren.
- Expressie van E4orf4 in behandelde en onbehandelde cellen.
- Beoordeling van celdood met behulp van de DAPI-assay om apoptotische morfologie te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Knockdown van ACF-subeenheden beïnvloedde E4orf4-geïnduceerde celdood.
- Cellevensvatbaarheid werd significant veranderd op basis van ACF-niveaus.
- De studie toonde de bruikbaarheid van de JY-assay voor het meten van apoptose.
- Bevindingen suggereren een cruciale rol voor ACF bij het mediëren van E4orf4-toxiciteit.
Conclusies
- ACF-subeenheden zijn belangrijke regulatoren van E4orf4-geïnduceerde celdood.
- Dit onderzoek biedt inzichten in de mechanismen van apoptose.
- De methodologie kan worden toegepast om andere eiwitten betrokken bij celdood te bestuderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Conditional gene knockdown in mammalian cell lines enables precise interrogation of essential protein function without compromising cell viability, addressing a critical challenge in early discovery and target validation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence for pathway analysis, particularly when constitutive knockdown is not tolerated. The method enhances portfolio decision-making by enabling functional studies of gene contributions to cell death and other pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional dissection of essential genes by allowing temporal control over knockdown.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the impact of specific protein depletion on cellular phenotypes.
- Facilitates target validation in pathways where constitutive loss is lethal or confounding.
Screening & Assay Development
- Provides validated cell systems for downstream screening of pathway modulators or genetic interactions.
- Ensures reproducibility and standardization by generating clonal, inducible knockdown lines.
- Delivers quantitative outputs through DAPI-based apoptotic morphology assays for robust phenotypic readouts.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of disease-relevant gene perturbations in a controlled, inducible manner.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by allowing rescue experiments with shRNA-resistant constructs.
- Reduces biological risk by confirming specificity and reversibility of observed phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This conditional knockdown workflow integrates at the early discovery and target validation stages, bridging to screening and preclinical research when functional gene interrogation is required.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling controlled depletion and rescue of target proteins.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible cell lines for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative apoptotic readouts and protein expression validation via western blot.
- Translational Research: Allows alignment with disease models where gene function is temporally regulated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for conditional gene knockdown across multiple targets and pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes gene knockdown workflows and improves reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by clarifying gene function in critical pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling functional studies of essential genes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and inducible gene expression systems.
- Needs access to instrumentation for western blotting, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands rigorous cross-team standardization for colony selection, induction, and phenotypic scoring.
- Adaptation may be needed for different cell types or gene targets based on tolerance to knockdown.
- Strict criteria for apoptotic morphology and blinded scoring are essential for objective data interpretation.
